CN109680092A - 一种检测红豆杉属植物基因表达水平的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测红豆杉属植物基因表达水平的试剂盒和方法，具体地，公开了一种检测曼地亚红豆杉（Taxus×media）在不同处理下基因表达水平变化的试剂盒及其方法。在本发明中，所述试剂盒包括检测内参基因的引物对或引物对组合，所述内参基因选自SAND、ARP2、RBCL、GAPDH1、Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41或其组合。本发明提供的适合红豆杉属标志物基因表达研究的内参基因，为开展红豆杉属植物的功能基因表达分析提供参考依据。

Description

一种检测红豆杉属植物基因表达水平的试剂盒和方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体地，涉及一种检测红豆杉属植物基因表达水平的试剂盒和方法，更具体地，涉及一种检测曼地亚红豆杉(Taxus×media)在经过不同处理后基因表达水平的试剂盒及其方法。
背景技术
实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强的特点，广泛应用于检测基因的表达水平。为了保证实验结果的准确、可靠，除了合理的实验和引物设计外，其它的实验步骤都要严格对待，如提取的RNA质量、聚合酶的扩增效率、cDNA的合成以及在做定量时操作的准确性和防止污染等[1]。此外，选择合适的内参基因也是正确反映目的基因表达水平的一个重要前提，如ACT，GAPDH，18S rRNA和TUB等已被选为内参基因用于荧光定量PCR中[2-5]，然而，研究结果表明，恒定表达的基因并不存在[6,7]，也不存在适合所有植物，组织或实验处理的内参基因，因此，应根据物种和实验条件选择合适的内参基因。如：Mallona等[8]的研究证明EF1α适合作为矮牵牛Mitchell品系的内参基因，CYP适合作为V30品系的内参基因，而GAPDH在这两个品系中均不稳定。蒋婷婷等[9]从棉花(Lycoris sprengeri)不同组织和不同花期中筛选出Actin表达最稳定，适合作为内参基因。苏晓娟等[10]认为Actin和18S rRNA等基因适合作为毛果杨(Populus trichocarpa)不同组织和锌胁迫下的组培苗内参基因。Xu等[11]以中国白菜为材料并且研究结果表明TUB和GAPDH在可育系和不可育系花蕾中的表达最稳定。KIM等[12]发现18S rRNA在水稻逆境胁迫中稳定性最高。
高通量测序技术发展迅速，已被广泛应用于基因组学和功能组学研究，并且测序产生的大片段序列和基因表达数据已成为快速筛选理想内参基因的有效方式[13-15]。SANG等[16]利用转录组数据筛选出了适合分析超积累型东南景天(Hyperaccunulating Sedumalfredii Hance)的内参基因UBC9和TUB；朱友银等[17]利用转录组数据筛选出适合作为中国樱桃(Prunus pseudocerasus)低温响应和盐胁迫处理的内参基因GAPDH；刘洪峰等[18]利用转录组数据筛选出适合牡丹(Paeonia ostii)的新型内参基因PUF1639、MBF1A、PP2CFP和RPS9。此外研究发现，根据材料自身转录组数据设计的引物比直接应用其它材料的内参基因稳定性要好[19]。
然而，还没有对于红豆杉属植物如曼地亚红豆杉(Taxus×media)在不同激素水平下研究基因表达的内参基因的系统性研究。
参考文献：
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[2]张计育,黄胜男,王涛,等.金魁猕猴桃RT-qPCR内参基因的筛选[J].上海农业学报，2018,34(1):84-88.
[3]王梨嬛,潘永娟,杨莉,等.‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选[J].果树学报,2013,30(1):48-54.
[4]朱海生,陈敏氡,温庆放,等.丝瓜18S rRNA基因克隆及其作为内参基因的应用[J].核农学报,2016,30(1):35-41.
[5]杨晶,卢玉彬,迟孟涵,等.红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析[J].中草药，2017,48(9):1845-1850.
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[8]Mallona I,Lischewski S,Weiss J,et al.Validation of reference genesfor quantitative real-time PCR during leaf and flower development in Petuniahybrida[J].BMC Plant Biology,2010,10(1):4.
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[10]苏晓娟,樊保国,袁丽钗,等.实时荧光定量PCR分析中毛果杨内参基因
的筛选和验证[J].植物学报,2013,48(5):507-518.
[11]Xu X,Yang Z,Sun X,et al.Selection of reference genes forquantitative real-time PCR during flower bud development in CMS7311 ofheading Chinese cabbage(Brassica rapa,L.ssp.pekinensis)[J].Acta PhysiologiaePlantarum,2014,36(3):809-814.
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[18]刘洪峰,高乐旋,胡永红.牡丹不同发育阶段种子和花瓣组织实时荧光定量PCR中内参基因的挖掘与筛选[J].农业生物技术学报,2015,23(12):1639-1648.
[19]杨丹,李清,王贵禧,等.平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与体系建立[J].中国农业科学,2017,50(12):2399-2410.
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一方面提供一种检测红豆杉属植物在经过处理后目标基因表达水平变化的试剂盒，该试剂盒包括能够特异性扩增内参基因的引物对，所述内参基因选自SAND、ARP2、RBCL和GAPDH1基因中的至少一种。例如1种、2种、3种、4种，优选地，为2种以上，更优选地，为3种。
在本发明的一些实施方案中，所述经过处理是指经过激素处理。在本发明的一些具体实施方案中，所述激素选自ABA、COR、MeJA、SA、ETH中的至少一种。
其中，ABA是指脱落酸(Abscisic acid)，别名：脱落素(Abscisin)，休眠素(Dormin)，是一种抑制生长的植物激素，因能促使叶子脱落而得名。
COR是指冠菌素(Coronatine)，是由一个含氨基酸的冠烷酸(Coronamic acid，CMA)和一个聚酮结构的冠菌酸(Coronafacic acid，CFA)以酰胺键联结而成的新型植物生长调节物质。
MeJA是指茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate)，其作为与损伤相关的植物激素和信号分子，广泛地存在于植物体中，外源应用能够激发防御植物基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。
SA是指水杨酸(Salicylic acid)，是一种植物体内产生的简单酚类化合物，广泛存在于高等植物中。
ETH是指乙烯(Ethylene)，是一种气态激素，能够加速果实成熟、促进脱落衰老、调节植物生长和促进开花。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增SAND基因的引物对序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增ARP2基因的引物对序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增RBCL基因的引物对序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增GAPDH1基因的引物对序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经过处理是指经过ABA处理，在这种情况下，所用内参基因为RBCL和GAPDH1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经过处理是指经过MJ处理，在这种情况下，所用内参基因为SAND和GAPDH1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经过处理是指经过SA处理，在这种情况下，所用内参基因为ARP2和GAPDH1。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括能够特异性扩增Actin、18SrRNA、GAPDH2和TBC41基因的引物对中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增Actin基因的引物对序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增18S rRNA基因的引物对序列如SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增GAPDH2基因的引物对序列如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增TBC41基因的引物对序列如SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经过处理是指经过COR处理，在这种情况下，所述内参基因为ARP2和18S rRNA。
在本发明的一些具体实施方案中，所述经过处理是指经过ETH处理，在这种情况下，所述内参基因为GAPDH1和Actin基因。
在本发明的实施方案中，所述红豆杉属植物选自欧洲红豆杉(Taxus baccataL.)、太平洋紫杉(Taxus brevifolia Nutt.)、加拿大红豆杉(Taxus canadensisMarshall)、南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)、中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.chinensis)、东北红豆杉(Taxus cuspidata Siebold&Zucc.)、佛罗里达红豆杉(Taxus floridana Nutt.ex Chapm.)、墨西哥红豆杉(Taxus globosaSchltdl.)、南洋红豆杉(Taxus sumatrana(Miq.)de Laub.)、西藏红豆杉(Taxuswallichiana Zucc.)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis W.C.Cheng&L.K.Fu)和曼地亚红豆杉(Taxus×media)中的一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述红豆杉属植物为曼地亚红豆杉(Taxus×media)。
本发明的第二方面提供能够扩增内参基因SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种的引物对在制备用于检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的试剂盒中的用途。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增SAND基因的引物对序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增ARP2基因的引物对序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增RBCL基因的引物对序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增GAPDH1基因的引物对序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。
本发明的第三方面提供能够扩增内参基因SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种的引物对和能够扩增内参基因Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41中的至少一种的引物对在制备用于检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的试剂盒中的用途。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增Actin基因的引物对序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增18S rRNA基因的引物对序列如SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增GAPDH2基因的引物对序列如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示。
在本发明的一些实施方案中，能够特异性扩增TBC41基因的引物对序列如SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示。
在本发明的一些实施方案中，所述经过处理是指经过激素处理。在本发明的一些具体实施方案中，所述激素选自ABA、COR、MeJA、SA、ETH中的至少一种。
本发明的第四方面提供一种检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的方法，其包括以下步骤：
1)获得经过处理前后的红豆杉属植物的组织样本，并提取所述组织样本的RNA；
2)对步骤1)获得的RNA样本进行反转录，获得cDNA模板；
3)利用能够特异性扩增目标基因的引物对和能够特异性扩增选定内参基因的引物对对步骤2)获得的cDNA模板进行荧光定量PCR扩增；
4)通过比较内参基因和目标基因的Ct值，获得所述目标基因的表达水平变化。
在本发明的一些实施方案中，所述选定内参基因包括SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种。在本发明的优选实施方案中，所述选定内参基因还包括Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41的至少一种。
本发明的有益效果
本发明通过利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和DeltaCt法以及在线网站RefFinder，评估了8个候选内参基因在5种不同植物激素处理和4种不同组织器官中的表达稳定性，并筛选出了在各试验条件下表达最稳定的内参基因：RBCL和GAPDH1(ABA处理)；18SrRNA和ARP2(COR处理)；GAPDH1和ARP2(MeJA处理)；GAPDH1和SAND(SA处理)；Actin和GAPDH1(ETH处理下)以及在组织表中最稳定的18S rRNA和SAND。本发明首次筛选出适合红豆杉属标志物基因表达研究的内参基因，为开展红豆杉功能基因表达分析提供参考。
附图说明
图1示出了8个内参基因扩增片段的RT-PCR琼脂糖电泳结果(M：D2000Marker；1：GAPDH2；2：RBCL；3：Actin；4：SAND；5：ARP2；6：GAPDH1；7：TBC41；8：18S rRNA)
图2示出了8个内参基因扩增片段的溶解曲线。
图3示出了8个内参基因Ct值在所有样品中的分布。
图4示出了geNorm分析8个内参基因的稳定性。
图5示出了适于基因表达最适基因数。
图6示出了TcMYC基因在SA处理不同时间后相对于不同内参基因或内参基因组合的相对表达量。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1内参基因的选定
1材料与方法
1.1试剂与材料
COR激素(终浓度1μmol/L)：DMSO助溶，未过滤灭菌；
ABA激素(终浓度100μmol/L)：DMSO助溶，未过滤灭菌；
乙烯利(ETH)激素(终浓度30μmol/L)：灭菌水溶解，过滤灭菌；
SA激素(终浓度100μmol/L)：无水乙醇溶解，未过滤灭菌；
MeJA激素(终浓度100μmol/L)：DMSO溶解，未过滤灭菌。
本发明以曼地亚红豆杉(Taxus×media)细胞系Tm3为实验材料，取处于对数生长期的细胞，经过COR(1μmol/L)、ABA(100μmol/L)、乙烯利(ETH)(30μmol/L)、SA(100μmol/L)、MeJA(100μmol/L)处理，分别在处理后0h、2h、6h、12h、24h、48h取样，南方红豆杉植株的根、茎、叶、韧皮部采自中国林业科学研究院温室，样品取好后迅速放于液氮中速冻，存放于-80℃冰箱备用。
1.2候选内参基因的选取及引物设计
发明人通过分析转录组数据中，并结合红豆杉相关文献，意外地获得了能够作为红豆杉属植物在不同激素水平下目标基因表达水平变化监测的内参基因(表1)及其组合。
发明人采用Primer premier6软件设计候选内参基因引物，参数设置为：引物TM值为50-60℃，扩增片段长度为100-300bp，引物长度为18-22bp，GC含量为40％-60％，其它参数为默认。并使用NCBI Primer-Blast验证引物特异性，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。
表1本发明所使用的内参基因及其引物
1.3 RNA提取和cDNA第一链合成
利用EASYspin plus试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总RNA，利用Nanodrop 8000和1.5％琼脂糖凝胶检测总RNA浓度和质量。
按照Fast Quant RT Kit(withgDNase)(天根生化科技(北京)有限公司)操作方法，合成cDNA第一链，反转录时加入总RNA600ng,反转录产物cDNA稀释4倍，并于-20℃储存。
1.4 RT-PCR检测
使用2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司)，于PCR仪上进行反应。反应体系(见表2)，PCR反应循环为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度60℃，72℃延伸1min，共进行30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。取6产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
表2 RT-PCR反应体系
1.5荧光定量PCR
荧光定量PCR试剂采用KAPAFAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(北京普凯瑞生物科技有限公司)于Roche 480PCR仪上进行反应。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复，实验中分别以水、和去除DNA污染未反转录的RNA为模板作为NTC和NRC阴性对照。反应体系(见表3)，荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，45次循环，每次循环第3步采集荧光；最后95℃变性5s，退火至60℃后保温1min。
表3 qRT-PCR反应体系
1.6制作标准曲线
以未处理的愈伤组织RNA反转录(取600ng RNA)得到的cDNA稀释4倍并以其为原始液，等梯度4倍稀释得到5种浓度的标准品，进行荧光定量PCR扩增，以CT值为纵坐标，以稀释倍数的对数值为横坐标，利用Microsoft Excel2016绘制标准曲线，得到方程斜率和相关系数R2，同时根据公式E＝(10-1/slope-1)×100，计算扩增效率。
1.7数据分析
利用Microsoft Excel 2003对原始数据经行整理，使用软件geNorm、NormFinder、Bestkeeper和DeltaCt法分析8个候选内参基因在样品中的稳定性，利用在线网站RefFinder(http://leonxie.esy.es/RefFinder/？type＝reference)对8个候选内参基因进行综合评价。
利用Microsoft Excel 2016、GraphPad Prism6和Photoshop等软件处理数据及制作图表。
2结果
2.1候选内参基因引物特异性及扩增效率分析
针对8个候选内参基因的引物的PCR扩增产物，经RT-PCR产物的琼脂糖电泳结果显示(见图1)，可见8对引物的扩增产物均为单一条带，说明引物的特异性良好(4号泳道存在一条较低的条带，经对照比较，其为引物二聚体，较高的为特异目的条带)。8个候选内参基因引物的qRT-PCR溶解曲线(见图2)均为单一峰，同样表明8个引物的特异性良好。
8对引物的扩增效率在92.5％-103.9％之间，满足优化体系的标准，并且R2均大于0.98，说明其线性回归方程可信。
2.2候选内参基因的表达分析
根据qRT-PCR实验结果，分析了8个候选内参基因在所有样品中的Ct值分布情况(见图3)，8个候选内参基因的Ct值分布在6.92(18S rRNA)-25.22(ARP2)，范围变化较大，18S rRNA表达量最高(6.92-8.98)，ARP2表达量最低(19.55-25.22)，其余候选内参及因表达量处于中间水平。
通过Microsoft Excel 2016计算8个候选内参基因在所有样品Ct值的平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(CV)，见表4，可初步判定8个候选内参基因中，GAPDH2(12.72％)的稳定性最差，SAND(4.90％)和ARP2(4.67％)的稳定性较好，其它候选内参基因处于中间水平。
表4 8个候选内参基因在所有样品中的Ct值分析
2.3候选内参基因稳定性分析
geNorm软件是根据其计算得到的M值大小来表示内参基因的稳定性，M值越小表示该基因的稳定性越高，本发明中，geNorm软件分析结果显示，在ABA处理下最稳定的两个基因为RCBL与GAPDH1；在COR处理下最稳定的两个基因为ARP2与SAND；在MeJA处理下最稳定的是GAPDH1与ARP2；在SA处理下最稳定的是18S rRNA与GAPDH1；在ETH处理下最稳定的是GAPDH1与Actin；在不同组织中最稳定的是18S rRNA与SAND(见图4；表5)。
此外，geNorm软件还可以选出适合实验条件的最适内参基因数，当Vn/Vn+1小于0.15时，表明在该实验条件下所需最优内参基因数为n个，本发明中(见图5)，在ABA、MeJA、COR、SA和ETH处理下，Vn/Vn+1的比值均小于0.15，说明在这些条件处理下，最适内参基因数为2个，而在组织表达中，Vn/Vn+1的比值均大于0.15，最低值为0.154(V4/V5)，表明最适内参基因数为3个。
NomFinder软件同geNorm程序原理相似，根据稳定值的大小筛选出最稳定的内参基因，稳定值越小表明该基因稳定性越好，本发明NomFinder分析结果表明(见表5)，在ABA处理下最稳定的为GAPDH1和RCBL，最不稳定的为TBC41。在COR处理下最稳定的基因为18SrRNA和ARP2，最不稳定的为TBC41。在MeJA处理下最稳定的基因为GAPDH1和SAND，最不稳定的基因为TBC41。在SA处理下最稳定的基因为SAND和GAPDH1，最不稳定的基因为Actin。在ETH处理下Actin和18S rRNA最稳定，而TBC41为最不稳定基因。在组织表达中18S rRNA和SAND表达最稳定，而RBCL最不稳定。
BesterKeeper软件可以计算出候选内参基因Ct值在样本中的标准差(SD)，变异系数(CV)，以及每个基因配对产生的相关系数(r)，评判标准为r越大、SD和CV值越小表明该基因稳定性越好，若SD>1，则表明该基因表达不稳定。本发明中，BesterKeeper分析SD排名结果表明(见表5)，在ABA处理下，ARP2基因最为稳定；在COR和ETH处理下，RBCL基因最稳定；而在MeJA、SA处理和组织表达中，18S rRNA最稳定。
Delta Ct法通过计算候选内参基因的平均标准差(Mean SD)，来评判候选内参及因的稳定性，该值越小表明其内参基因越稳定。在本发明中，Delta Ct法分析结果显示(见表5)，在ABA处理下，RBCL基因最稳定；在COR处理下，18S rRNA最稳定；在MeJA处理下GAPDH1为最稳定基因；在SA和组织中SAND最稳定；而在ETH处理下，Actin基因最稳定。
表5候选内参基因稳定性排名
2.4候选内参基因的综合评价
RefFinder在线网站包含geNorm、NormFinder、BestKeeper以及DeltaCt法4种评价内参基因稳定性的方法，并能对结果进行综合排名。结果显示(见表6)，在ABA处理下，8个候选内参及因的稳定性排名为RBCL>GAPDH1>ARP2>18S rRNA>SAND>Actin>GAPDH2>TBC41；在COR处理下候选内参基因的排名为18S rRNA>ARP2>SAND>RBCL>GAPDH2>GAPDH1>Actin>TBC41；在MeJA处理下候选内参基因的排名为GAPDH1>ARP2>SAND>18S rRNA>RBCL>Actin>GAPDH2>TBC41；在SA处理下候选内参基因的排名为GAPDH1>SAND>18S rRNA>ARP2>RBCL>GAPDH2>TBC41>Actin；在ETH处理下候选内参基因的排名为Actin>GAPDH1>18S rRNA>SAND>RBCL>ARP2>GAPDH2>TBC41；而在不同组织中下候选内参基因的排名为18S rRNA>SAND>ARP2>GAPDH2>TBC41>Actin>GAPDH1>RBCL。
表6 RefFinder综合评价8个候选内参基因
2.5使用TcMYC基因评价最稳定内参基因
通过利用最稳定和最不稳定内参基因，检测TcMYC基因(登录号为KC878013)在SA处理下的表达水平，以评价候选内参基因。如图6所示，单独使用GAPDH1或SAND一个内参基因与同时使用这两个内参基因，在SA处理2h后，TcMYC基因的表达量未发生显著变化。此外，在SA处理6h至24h期间，使用GAPHD1/SAND或单独使用SAND作为内参基因，TcMYC基因的表达量未发生明显变化，与未处理相比保持相对稳定水平，均下调了0.5倍左右。使用GAPHD1/SAND或单独使用GAPDH1作为内参基因均表明，在SA处理48h后TcMYC基因的表达量发生了明显下调。然而，如果通过使用不稳定的TBC41作为内参基因评价TcMYC基因的表达水平，结果显示，在2、6、12和24h时，TcMYC基因的表达发生明显变化，与0h相比，2h时发生明显下调，并且在6、12、24和48h时TcMYC基因的表达明显较低。
综上可知，最常用的4种软件和方法(geNorm、NormFinder、BestKeeper和DeltaCt)分析8个候选内参基因在不同实验处理下的稳定性排名不尽相同(见表5)，比如：在ABA处理下geNorm和DeltaCt法显示RBCL为最稳定基因，但NormFinder和BestKeeper显示GAPDH1与ARP2分别为最稳定内参基因；在COR处理下NormFinder和DeltaCt法显示18S rRNA为最稳定内参基因，而geNorm和BestKeeper显示APR2和RBCL分别为最稳定内参基因；在MeJA处理下geNorm、NormFinder和DeltaCt法均显示GAPDH1为最稳定内参基因，而BestKeeper结果认为最稳定内参基因为18SrRNA，这可能是由于程序设计的计算原理不同导致的，为了解决这个问题，我们使用在线软件RefFinder综合评价8个内参基因稳定性。RefFinder结果显示(见表6)，在ABA处理下RBCL稳定性最好，其次为GAPDH1；18S rRNA在COR处理和不同组织中稳定性最好；GAPDH1在MeJA和SA处理下的稳定性最好；而在ETH处理下Actin为最稳定内参基因其次为GAPDH1。
已有研究表明使用多个内参基因比单一内参基因更能准确、可靠地展现基因的表达水平，geNorm程序可以根据配对变异(pairwise variation)V值，来确定理想内参基因个数，程序默认当Vn/Vn+1的比值均小于0.15时，则不需要引入第n+1个基因，反之则需要引入新的内参基因。本发明结果显示，在ABA、COR、MeJA、SA及ETH处理下，V2/V3的比值均小于0.15，表明在这些试验条件下的最适内参基因数为2个，而在组织中Vn/Vn+1的比值均大于0.15，表明需要引入新的内参基因归一化数据，且V4/V5值最接近0.15，故最适数据归一化内参基因数为3个。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种检测红豆杉属植物基因表达水平的试剂盒和方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtggatat tctgaggcta ca 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctgcgagtg gaagacctac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aactacacgc ttccagatg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctccgctc agaacaat 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgttggct cattattgtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttctcgttct ccttcaagtt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcagcagatg caccgatgt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacctccacg ccaatcctt 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagagaagct tgcttatgta gc 22
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgatatcc acatcacact tc 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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tctggtcctg ttccgttggc 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctttcgca gtggttgtct t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccctgggg tgaggttggt 20
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<212> DNA
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gccaaaggag ccaggcagtt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagaagaaa gagtcagcaa atgg 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggaacgacat gacattatga atagc 25

Claims (10)

1.一种检测红豆杉属植物在经过处理后目标基因表达水平变化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够特异性扩增内参基因的引物对，所述内参基因选自SAND、ARP2、RBCL和GAPDH1基因中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，能够特异性扩增SAND基因的引物对序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；能够特异性扩增ARP2基因的引物对序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；能够特异性扩增RBCL基因的引物对序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；能够特异性扩增GAPDH1基因的引物对序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，任选地，所述经过处理是指经过ABA处理，所述内参基因为RBCL和GAPDH1；任选地，所述经过处理是指经过MeJA处理，所述内参基因为SAND和GAPDH1；任选地，所述经过处理是指经过SA处理，所述内参基因为ARP2和GAPDH1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括能够特异性扩增Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41基因的引物对中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，能够特异性扩增Actin基因的引物对序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；能够特异性扩增18S rRNA基因的引物对序列如SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示；能够特异性扩增GAPDH2基因的引物对序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；能够特异性扩增TBC41基因的引物对序列如SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16所示。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，任选地，所述经过处理是指经过COR处理，所述内参基因为ARP2和18S rRNA；任选地，所述经过处理是指经过ETH处理，所述内参基因为GAPDH1和Actin基因。
7.根据权利1、2、4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述红豆杉属植物为曼地亚红豆杉(Taxus×media)。
8.能够扩增内参基因SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种的引物对在制备用于检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的试剂盒中的用途。
9.能够扩增内参基因SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种的引物对和能够扩增内参基因Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41中的至少一种的引物对在制备用于检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的试剂盒中的用途。
10.一种检测红豆杉属植物在经过不同处理后目标基因表达水平变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获得经过处理前后的红豆杉属植物的组织样本，并提取所述组织样本的RNA；
2)对步骤1)获得的RNA样本进行反转录，获得cDNA模板；
3)利用能够特异性扩增目标基因的引物对和能够特异性扩增选定内参基因的引物对对步骤2)获得的cDNA模板进行荧光定量PCR扩增；
4)通过比较内参基因和目标基因的Ct值，获得所述目标基因的表达水平变化，
其中，所述选定内参基因包括SAND、ARP2、RBCL或GAPDH1中的至少一种，优选地，所述选定内参基因还包括Actin、18S rRNA、GAPDH2和TBC41的至少一种。
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