CN112941229B

CN112941229B - 一种蓝莓内参基因及其引物和应用

Info

Publication number: CN112941229B
Application number: CN202110387280.6A
Authority: CN
Inventors: 周扬颜; 郭鹏; 陈文秀; 莫翱玮; 孙卫健; 许鹏昊
Original assignee: Shandong Dafengyuan Agricultural Co ltd
Current assignee: Shandong Dafengyuan Agricultural Co ltd
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-04-08
Also published as: CN112941229A

Abstract

本发明公开了一种用于蓝莓内参基因的实时荧光定量PCR引物对，包括针对蓝莓actin7基因的PCR引物对和/或针对蓝莓TUB基因的PCR引物对。前述实时荧光定量PCR引物对中的引物特异性强，具有很高的稳定性、可靠性和重复性，为在ABA胁迫等逆境胁迫下蓝莓相关功能基因的精确定量研究提供有力支持，提高了研究的可靠性。

Description

一种蓝莓内参基因及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种蓝莓内参基因及其引物和应用，特别涉及蓝莓actin7基因和/或蓝莓TUB基因作为蓝莓内参基因及其引物和应用。

背景技术

蓝莓(Vaccinium Spp)为杜鹃花科越橘属多年生低灌木。原生于北美州与东亚，分布于朝鲜、蒙古、欧洲、北美洲以及中国黑龙江、内蒙古、吉林长白山等地区。蓝莓果实中营养丰富，富含花青素，具有防止脑神经老化、强心、抗癌、软化血管、增强人体免疫等功能。因为其具有较高的保健价值而风靡世界，是世界粮食及农业组织推荐的五大健康水果之一。然而，在栽培过程中蓝莓植株时常会受到多种逆境胁迫的影响。因此，提高植物自身对逆境胁迫的生存力是蓝莓育种工作的目标之一。而育种过程中就经常检测不同转录本的表达量，为了准确定量，就需要有效的内参基因。

理想的内参基因应该是在不同组织类型、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。然而，尚未报道适用于所有不同条件的内参基因。因此，根据实验条件和实验材料筛选合适的内参基因，已成为应用实时荧光定量PCR进行基因组功能分析的重要前提。

目前，蓝莓常见内参基因如18S rRNA基因、HIS、GAPDH等，其它关于蓝莓逆境条件下内参基因的克隆及内参基因稳定性筛选的研究未见报道。如大多数植物在逆境条件下18S rRNA的表达量较高，当目的基因表达量低时18S rRNA不适合作为内参基因，此时最好配合其他内参基因一起使用，以提高qRT-PCR定量的准确性。因此，在研究蓝莓逆境条件下功能基因表达中缺少合适的内参基因。

发明内容

本发明通过从蓝莓基因组数据获得内参基因，利用BestKeeper、NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对该基因的稳定性进行评价，表明两个内参基因适用于蓝莓ABA胁迫条件下基因表达研究，并用该基因为基因设计了实时荧光定量PCR引物，为后续蓝莓功能基因的精确定量及功能研究奠定基础。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了下面的技术方案。

本发明第一方面提供了一种用于PCR反应的蓝莓内参基因，所述内参基因为蓝莓actin7基因和/或蓝莓TUB基因。

本发明第二方面提供了一种用于蓝莓内参基因的实时荧光定量PCR引物对，所述PCR引物对包括针对蓝莓actin7基因的PCR引物对和/或针对蓝莓TUB基因的PCR引物对。

在一些实施方式中，以蓝莓actin7基因的成熟mRNA或所述蓝莓actin7基因的成熟mRNA的片段为模板，设计得到所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对。

在一些实施方式中，所述蓝莓actin7基因的成熟mRNA的片段为蓝莓actin7基因的mRNA编码序列片段。

在一些实施方式中，以SEQ ID NO.5所示RNA序列为模板，设计得到所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对。

在一些实施方式中，所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

在一些实施方式中，以蓝莓TUB基因的成熟mRNA或所述蓝莓TUB基因的成熟mRNA的片段为模板，设计得到所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对。

在一些实施方式中，所述蓝莓TUB基因的成熟mRNA的片段为蓝莓TUB基因的mRNA编码序列片段。

在一些实施方式中，以SEQ ID NO.6所示RNA序列为模板，设计得到所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对。

在一些实施方式中，所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第二方面所述的PCR引物对。

本发明第四方面一种测定蓝莓目的基因表达丰度的方法，所述方法为：以本发明第一方面所述的内参基因为内参基因，使用实时荧光定量PCR法测定所述蓝莓目的基因的表达丰度。

在一些实施方式中，所述方法为：以本发明第二方面所述的PCR引物对为引物对扩增所述内参基因的引物对，使用实时荧光定量PCR法测定所述蓝莓目的基因的表达丰度。

在一些实施方式中，所述方法为测定生理状态、病理状态或被胁迫状态中所述蓝莓目的基因表达丰度。

在一些实施方式中，所述被胁迫状态为被植物激素胁迫状态、被温度胁迫状态或药物胁迫状态。

在一些实施方式中，所述植物激素为ABA。

在一些实施方式中，所示温度胁迫状态为高温胁迫状态。

在一些实施方式中，所示高温胁迫状态为40-43℃胁迫状态。

在一些实施方式中，所述蓝莓的品种为布里吉塔。

本发明第五方面提供了本发明第一方面所述的内参基因、本发明第二方面所述的PCR引物对或本发明第三方面所述的试剂盒在蓝莓目的基因表达丰度分析中的应用。

在一些实施方式中，所述蓝莓目的基因表达丰度为生理状态、病理状态或被胁迫状态中蓝莓目的基因表达丰度。

在一些实施方式中，所述植物激素为ABA。

在一些实施方式中，所示温度胁迫状态为高温胁迫状态。

在一些实施方式中，所示高温胁迫状态为40-43℃胁迫状态。

在一些实施方式中，所述蓝莓的品种为布里吉塔。

本发明有益效果在于：

本发明公开了一种适用于蓝莓ABA胁迫条件下，基因表达研究的内参基因，同时揭露了利用蓝莓内参基因为基础设计的荧光定量PCR引物及其应用。本发明的内参基因可在蓝莓相应ABA胁迫时稳定表达，提高研究的稳定性、可靠性和重复性。

附图说明

图1示出了本发明中实施例4的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图2示出了本发明中实施例4中针对actin7基因扩增的溶解曲线图。

图3示出了本发明中实施例4中针对TUB基因扩增的溶解曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

凡没有详细介绍来源和性质的材料，均按照本领域常规的材料来使用。凡没有详细描述的内容，均通过本领域常规方法操作。相应的试剂盒按照试剂盒中说明书的指导进行操作。

实施例1：蓝莓内参基因获得

(1)从蓝莓基因组数据库(登录网址：www.vaccinium.org)中获得候选内参基因actin7和TUB序列，用Primer5.0设计两对引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物，引物序列为：

①扩增actin7的引物对：

正向引物1(SEQ ID NO.1)：5’-GGAGAAGATCTGGCATCACAC-3’；

反向引物1(SEQ ID NO.2)：5’-TTTCCTTGCTCATTCTATC-3’。

②扩增TUB的引物对：

正向引物2(SEQ ID NO.3)：5’-GGCGACTCCGATCTCCAGCTTG-3’；

反向引物2(SEQ ID NO.4)：5’-CTCTGCCTCGGTAAACACCATC-3’。

(2)总RNA提取和cDNA合成：采用植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP432)提取蓝莓(布里吉塔品种，后续试验均为该品种蓝莓)叶片总RNA；使用ThermoNanoDrop2000C(Thermo Scientific)测定总RNA浓度、测定OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₃₀/OD₂₆₀比值；1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，R312)进行cDNA合成，-20℃保存备用。

(3)PCR扩增：以步骤(2)中获得的cDNA为模板，使用步骤(1)的两个引物对分别进行PCR扩增，获得内参基因actin7和TUB的扩增片段。

PCR反应体系：总体积20μL，2×Phanta Master Mix 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，模板cDNA 1μL，ddH₂O 8μL。

PCR反应程序：96℃预变性3min，96℃变性30s，58℃退火20s，72℃延伸60s，34个循环，最后72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳检测：取步骤(3)中扩增产物20μL，于1％琼脂糖凝胶电泳检测。将产物进行胶回收纯化后，连接到T4载体上，转入DH5α大肠杆菌中，挑取阳性菌落，摇菌测序，所测得序列即为内参基因actin7和TUB的核苷酸编码序列的一部分。

根据测序结果推断内参基因actin7的成熟RNA片段的序列如下所示(SEQ IDNO.5)。

5’-GGAGAAGAUCUGGCAUCACACGUUCUACAAUGAGCUCCGAGUUGCCCCAGAGGAGCACCCUGUCCUCCUUACUGAAGCACCUCUGAACCCCAAGGCUAACCGUGAGAAGAUGACCCAAAUCAUGUUUGAAACCUUCAACACCCCUGCUAUGUAUGUUGCUAUUCAGGCUGUGCUUUCCCUAUAUGCUAGUGGUCGUACAACUGGAAUCGUGCUGGACUCUGGCGAUGGUGUGAGCCAUACGGUCCCUAUAUACGAAGGAUACGCACUCCCACACGCCAUCCUUCGUCUUGACUUGGCGGGCCGGGAUCUCACCGAUGCUUUGAUGAAAAUCCUUACUGAGCGCGGCUACUCCUUCACUACCACAGCAGAGCGGGAAAUCGUGAGGGACAUGAAGGAGAAGCUCGCUUAUAUUGCCCUAGACUAUGAGCAAGAGCUAGAGACUUCCAAAACAAGCUCCUCUGUUGAGAAAAGCUACGAGCUUCCCGAUGGCCAAGUGAUCACCAUUGGCGCGGAGCGUUUCCGGUGCCCCGAGGUUCUUUUCCAGCCGUCGAUGAUUGGAAUGGAAGCGGCGGGAAUUCACGAGACCACUUAUAAUUCUAUCAUGAAGUGUGAUGUGGAUAUCAGAAAAGAUCUCUACGGAAACAUUGUGCUCAGUGGUGGUUCGACCAUGUUUCCGGGCAUUGCUGAUAGAAUGAGCAAGGAAA-3’

根据测序结果推断内参基因tub的成熟RNA片段的序列如下所示(SEQ ID NO.6)。

5’-GGCGACUCCGAUCUCCAGCUUGAGCGUGUCAAUGUCUACUACAACGAGGCCAGUUGCGGCCGGUUCGUCCCGCGUGCCGUCCUCAUGGACCUCGAGCCCGGUACCAUGGACAGCGUCCGCUCCGGCCCCUACGGCCAGAUCUUCCGCCCCGAUAACUUCGUGUUUGGACAGUCUGGUGCUGGGAAUAAUUGGGCGAAAGGGCAUUAUACCGAGGGCGCCGAGCUUAUUGAUUCGGUUCUCGAUGUCGUUCGAAAAGAGGCUGAAAAUUGUGACUGCCUACAAGGGUUUCAGGUGUGCCAUUCUCUGGGAGGAGGGACAGGAUCGGGGAUGGGGACGCUGUUGAUAUCGAAGAUAAGGGAGGAGUAUCCGGACCGAAUGAUGCUGACUUUCUCUGUGUUUCCAUCACCAAAGGUGUCCGAUACUGUGGUAGAACCAUACAACGCUACACUCUCCGUCCACCAGCUUGUUGAGAAUGCUGAUGAGUGUAUGGUUUUGGACAACGAGGCACUCUAUGAUAUCUGCUUCCGUACUCUCAAGCUCACUACUCCCAGCUUUGGAGAUCUGAACCACUUGAUUUCUGCCACCAUGAGUGGUGUGACUUGCUGCCUUCGCUUUCCCGGUCAACUCAACUCAGACCUUCGCAAGCUUGCAGUCAACCUCAUCCCAUUCCCACGACUCCACUUCUUCAUGGUCGGCUUUGCACCGCUCACGUCACGUGGCUCCCAGCAAUACCGCGCCCUCACCGUUCCCGAACUCACCCAACAGAUGUGGGACUCCAAGAACAUGAUGUGUGCCGCUGAUCCCCGUCACGGUCGCUACCUCACGGCAUCAGCAAUGUUCCGUGGAAAAAUGAGCACGAAGGAGGUGGAUGAACAGAUGAUAAACGUGCAGAACAAGAACUCGUCGUACUUUGUUGAGUGGAUCCCCAACAAUGUGAAAUCAACUGUUUGUGACAUCCCUCCAACGGGUCUCAAAAUGGCUUCGACGUUUAUUGGGAACUCUACUUCCAUACAAGAGAUGUUUAGGAGGGUGAGUGAACAGUUCACGGCUAUGUUCCGUAGGAAGGCUUUCUUGCAUUGGUACACAGGAGAGGGGAUGGACGAGAUGGAGUUUACCGAGGCAGAG-3’

根据数据可信息，GAPDH基因成熟RNA片段的序列如下所示(SEQ ID NO.7)

5’-AAGAAGAUCAAGAUCGGGAUCAAUGGCUUUGGAAGGAUCGGUCGUCUUGUAGCUAGGGUUGCUCUCCAGAGAGACGAUGUUGAACUCGUUGCUGUUAACGAUCCCUUCAUUACCACUGAUUACAUGACAUAUAUGUUCAAGUAUGACAGUGUUCACGGCCAGUGGAAGCAUCAUGAGCUUAAGGUUAAGGACUCUAAGACCCUUCUUUUCGGUGAGAAACCAGUUACUGUUUUUGGCCACAGGAACCCGGAAGAAAUCCCUUGGGGUGAAACCGGAGCUGAGUUUGUUGUUGAGUCUACUGGAGUGUUCACUGACAAGGACAAGGCUGCUGCCCACUUAAAGGGUGGUGCAAAGAAGGUGGUCAUCUCUGCCCCAAGUAAGGAUGCUCCUAUGUUUGUUAUGGGUGUUAAUGAGAAAGAAUACAAGCCCGAUCUUCACAUUGUCUCCAAUGCUAGCUGCACUACUAACUGUCUUGCUCCGCUUGCCAAGGUCAUCAAUGAUAGGUUUGGCAUUGUUGAGGGUCUUAUGACAACCGUUCACUCCAUCACGGCCACUCAGAAGACUGUUGAUGGACCAUCAAGC-3’

根据数据可信息，ACTIN基因成熟RNA片段的序列如下所示(SEQ ID NO.8)

5’-GCUGGCCGUGACCUAACUGAUGCCCUCAUGAAAAUCCUUACGGAGCGUGGGUACUCUUUCACCACCACAGCCGAGCGUGAAAUCGUGAGGGACAUGAAGGAGAAGCUAGCCUACAUAGCCCUGGACUACGAGCAAGAGUUGGAAACUUCCAAGACUAGCUCUUCCGUUGAGAAAAGCUACGAGUUGCCUGAUGGACAGGUGAUCACCAUCGGGGCUGAGCGUUUCCGCUGCCCGGAAGUCCUUUUCCAGCCAUCCAUGAUUGGAAUGGAGGCAGCGGGCAUCCAUGAGACCACAUACAAUUCCAUCAUGAAGUGUGACGUGGAUAUUAGGAAGGACCUUUACGGAAACAUCGUUCUCAGUGGUGGGUCAACCAUGUUCCCUGGAAUUGCUGAUAGAAUGAGCAAGGAAAUAACAGCGUUGGCCCCGAGCAGCAUGAAAAUAAAGGUGGUGGCUCCACCAGAGAGGAAGUACAGUGUUUGGAUCGGAGGAUCCAUCCUCGCAUCCCUCAGUACCUUCCAGCAGAUGUGGAUUGCAAAGGCAGAGUACGAUGAAUCUGGACCGUCCAUUGUGCACAGGAAAUGCUUC-3’

根据数据可信息，HIS基因成熟RNA片段的序列如下所示(SEQ ID NO.9)

5’-UUAUUACAGAAGAAGAGUAGUUUCCUUGCAUUCGAAAGCGAUCUCGGAUUCUCCAAUUCAAUGGCUCGUACCAAGCAAACUGCUCGUAAGUCUACUGGAGGCAAGGCGCCAAGGAAGCAGCUUGCUACCAAGGCUGCUCGGAAGUCUGCCCCUACUACUGGAGGAGUCAAGAAGCCCCACAGAUACAGACCUGGAACUGUUGCUCUUCGUGAAAUUCGCAAGUAUCAGAAAAGUACUGAACUCCUAAUCAGGAAGUUACCAUUCCAGAGGCUUGUUCGUGAGAUUGCUCAAGAUUUCAAGACUGACCUGAGGUUCCAGAGCCAUGCAGUCUUGGCACUGCAGGAGGCAGCAGAGGCAUACCUUGUUGGGUUGUUUGAAGAUACUAAUCUGUGUGCAAUUCACGCCAAGCGUGUCACUAUUAUGCCCAAGGAUAUUCAGCUUGCCAGGAGAAUUAGGGGGGAGAGGGCU-3’

实施例2：内参基因在ABA胁迫处理下表达稳定性分析

选择生长期且长势一致的蓝莓幼苗进行120μM ABA水溶液喷洒叶片处理12h，以同环境下同时种植与成长的未处理的蓝莓幼苗做对照，然后分别取处理后的幼苗叶片和对照幼苗叶片，用锡纸包好，立即用液氮速冻，置于-80℃保存。总RNA提取及cDNA获得均按照植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP432)和HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，R312)，按照说明书的要求进行操作。

以前述步骤合成的样品cDNA为模板，根据SEQ ID NO.5到SEQ ID NO.9所示的内参基因成熟RNA片段序列，分别设计5个内参基因(肌动蛋白基因(ACTIN)、HIS基因、β-微管蛋白基因(TUB)、GAPHD基因和actin7基因)的荧光定量引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物，利用BIO-RAD实时荧光定量PCR仪对前述cDNA分别进行qRT-PCR扩增反应。

PCR反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)10μL，正向引物(10μM)0.4μL，反向引物(10μM)0.4μL，cDNA 0.8μL，ddH₂O 8.4μL。

PCR反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；延伸阶段收集信号，从60℃到95℃，采集溶解曲线荧光信号。

actin7基因对应引物：

正向引物3(SEQ ID NO.10)：5’-ATACGCACTCCCACACGCC-3’；

反向引物3(SEQ ID NO.11)：5’-CCTCACGATTTCCCGCTCT-3’。

TUB基因对应引物：

正向引物4(SEQ ID NO.12)：5’-CCCCGATAACTTCGTGTTTGG-3’；

反向引物4(SEQ ID NO.13)：5’-CGACATCGAGAACCGAATCAAT-3’。

ACTIN基因对应引物：

正向引物5(SEQ ID NO.14)：5’-GAAATAACAGCGTTGGCCCC-3’；

反向引物5(SEQ ID NO.15)：5’-GGAAGGTACTGAGGGATGCG-3’。

HIS对应引物：

正向引物6(SEQ ID NO.16)：5’-AGGAGTCAAGAAGCCCCACA-3’；

反向引物6(SEQ ID NO.17)：5’-ACGAATCTCACGAACAAGCC-3’。

GAPHD基因和对应引物：

正向引物7(SEQ ID NO.18)：5’-CGATGTTGAACTCGTTGCTGTT-3’；

反向引物7(SEQ ID NO.19)：5’-AGCTCATCATGCTTCCACTGG-3’。

利用BestKeeper、NormFinder和RefFinder分析软件和Delta Ct法对前述5个候选内参基因的稳定性进行评价。

NormFinder软件通过计算待选内参基因的稳定值(SV)，SV越小表明基因越稳定。

Normfinder分析结果表明，在ABA处理下，表达最为稳定的内参基因是actin7，表达最不稳定的是GAPHD(表1)。

BestKeeper软件通过计算Ct值的标准偏差(SD)来筛选最稳定的内参基因，SD值越小，稳定越好。

Bestkeeper分析结果表明，在ABA处理中，表达最为稳定的候选内参基因是actin7，最不稳定的内参基因是GAPHD(表2)。

Delta Ct法通过计算ΔCt来评价内参基因的稳定性，ΔCt越小越稳定。RefFinder软件可以综合上述分析方法，以筛选出稳定性较好的内参基因。

Delta Ct法分析结果表明，在ABA处理中，表达最为稳定的内参基因是actin7，表达最不稳定的是GAPHD(表3)。

使用RefFinder分析软件，分数越低越稳定，整合上述3种分析方法，得出5个内参基因在ABA处理中表达的稳定性排名为actin7>TUB>ACTIN>HIS>GAPHD(表4)。因此，确定actin7和TUB是ABA处理下蓝莓中最稳定的内参基因。

表1.NormFinder软件分析5个候选内参基因在蓝莓ABA胁迫下的表达稳定性

表2.BestKeeper软件分析5个候选内参基因在蓝莓ABA胁迫下的表达稳定性

表3.Delta Ct法分析5个候选内参基因在蓝莓ABA胁迫下的表达稳定性

表4.RefFinder法分析5个候选内参基因在蓝莓ABA胁迫下表达稳定性的综合评价

实施例3：蓝莓内参基因的应用

选择生长期且长势一致的蓝莓幼苗进行42℃处理0、4、12和24h，以同环境下同时种植与成长的自然条件下生长蓝莓幼苗做对照，然后分别取热处理后的幼苗叶片和对照幼苗叶片。

按照实施例2相同的方法分别提取热处理后的幼苗叶片和对照幼苗叶片cDNA为模板，以相同的引物、仪器、试剂盒反应条件，分别针对肌动蛋白基因(ACTIN)、HIS基因、β-微管蛋白基因(TUB)、GAPHD基因和actin7基因进行qRT-PCR扩增反应。

分别采用GeNorm软件进行五个内参基因稳定性分析，稳定值越小越稳定；分别采用NormFinder软件进行五个内参基因稳定性分析，稳定值越小越稳定。再分别采用BestKeeper软件进行五个内参基因稳定性分析。

表5蓝莓42℃高温胁迫下各内参基因稳定性统计表

由表5可知，GeNorm软件分析显示各内参基因稳定性由高到低分别为actin7>TUB>ACTIN>HIS>GAPDH；NormFinder软件分析显示各内参基因稳定性由高到低分别为TUB>actin7>HIS>ACTIN>GAPDH；综合GeNorm软件和NormFinder软件分析稳定性结果，actin7和TUB稳定性最好。再通过BestKeeper软件分析显示actin7和TUB稳定性良好，但actin7相关系数更接近于1。综合上述分析结果，3种分析软件分析结果显示，蓝莓在高温条件下最稳定的内参引物为actin7，而TUB也表现出较高的稳定性，两对内参引物均优于传统的内参引物ACTIN、HIS和GAPDH。

综上，本发明筛选出了蓝莓在ABA和高温环境条件下最稳定的内参基因actin7和TUB，这两对引物的表达稳定性均优于传统内参引物HIS和GAPDH。本发明筛选出的内参引物适合用于蓝莓ABA和高温环境下相关基因的表达谱分析，为以后蓝莓一些逆境环境下的定量PCR实验提供了参考。同时本发明提供的筛选方法具有简便、快捷的优点，对于在不同条件处理下转录组数据中内参引物的快速筛选提供了参考。

实施例4：引物设计和特异性检测

(1)以实施例1获得内参基因的核酸序列为基础，采用前述正向引物3和反向引物3扩增actin7基因的片段(127bp)；采用前述正向引物4和反向引物4扩增TUB基因的片段(101bp)；采用前述正向引物5和反向引物5扩增ACTIN基因的片段(112bp)；采用前述正向引物6和反向引物6扩增HIS基因的片段(127bp)；采用前述正向引物7和反向引物7扩增GAPHD基因的片段(105bp)。

(2)蓝莓总RNA提取及cDNA获得均同实施例1中步骤(2)。

(3)常规PCR检测:以步骤(2)所获得cDNA为模板，以步骤(1)中获得引物进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，反应体系和反应程序同实施例1中步骤(3)，检测结果如图1所示。由图1可知，PCR扩增条带为单一条带，表明引物特异性好，可靠性高，可同于qRT-PCR分析。这也能够说明实施例2和实施例3中能够有针对性地、可靠地判断各个内参基因的稳定性。

(4)qRT-PCR检测：将步骤(2)处理获得的cDNA为模板，以步骤(1)前述正向引物3和反向引物3；前述正向引物4和反向引物4分别进行qRT-PCR扩增反应，利用BIO-RAD实时荧光定量PCR仪检测。

针对actin7基因的反应结果如图2所示，针对TUB基因的反应结果如图3所示，由此可见，该两个内参基因均为单峰曲线，表明引物具有很高的特异性，并且扩增曲线重复性好，说明qRT-PCR结果可靠，可用于表达稳定性分析。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 山东大丰园农业有限公司

<120> 一种蓝莓内参基因及其引物和应用

<130> C1CNCN210158

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagaagatc tggcatcaca c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttccttgct cattctatc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgactccg atctccagct tg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctgcctcg gtaaacacca tc 22

<210> 5

<211> 704

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 5

ggagaagauc uggcaucaca cguucuacaa ugagcuccga guugccccag aggagcaccc 60

uguccuccuu acugaagcac cucugaaccc caaggcuaac cgugagaaga ugacccaaau 120

cauguuugaa accuucaaca ccccugcuau guauguugcu auucaggcug ugcuuucccu 180

auaugcuagu ggucguacaa cuggaaucgu gcuggacucu ggcgauggug ugagccauac 240

ggucccuaua uacgaaggau acgcacuccc acacgccauc cuucgucuug acuuggcggg 300

ccgggaucuc accgaugcuu ugaugaaaau ccuuacugag cgcggcuacu ccuucacuac 360

cacagcagag cgggaaaucg ugagggacau gaaggagaag cucgcuuaua uugcccuaga 420

cuaugagcaa gagcuagaga cuuccaaaac aagcuccucu guugagaaaa gcuacgagcu 480

ucccgauggc caagugauca ccauuggcgc ggagcguuuc cggugccccg agguucuuuu 540

ccagccgucg augauuggaa uggaagcggc gggaauucac gagaccacuu auaauucuau 600

caugaagugu gauguggaua ucagaaaaga ucucuacgga aacauugugc ucaguggugg 660

uucgaccaug uuuccgggca uugcugauag aaugagcaag gaaa 704

<210> 6

<211> 1125

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 6

ggcgacuccg aucuccagcu ugagcguguc aaugucuacu acaacgaggc caguugcggc 60

cgguucgucc cgcgugccgu ccucauggac cucgagcccg guaccaugga cagcguccgc 120

uccggccccu acggccagau cuuccgcccc gauaacuucg uguuuggaca gucuggugcu 180

gggaauaauu gggcgaaagg gcauuauacc gagggcgccg agcuuauuga uucgguucuc 240

gaugucguuc gaaaagaggc ugaaaauugu gacugccuac aaggguuuca ggugugccau 300

ucucugggag gagggacagg aucggggaug gggacgcugu ugauaucgaa gauaagggag 360

gaguauccgg accgaaugau gcugacuuuc ucuguguuuc caucaccaaa gguguccgau 420

acugugguag aaccauacaa cgcuacacuc uccguccacc agcuuguuga gaaugcugau 480

gaguguaugg uuuuggacaa cgaggcacuc uaugauaucu gcuuccguac ucucaagcuc 540

acuacuccca gcuuuggaga ucugaaccac uugauuucug ccaccaugag uggugugacu 600

ugcugccuuc gcuuucccgg ucaacucaac ucagaccuuc gcaagcuugc agucaaccuc 660

aucccauucc cacgacucca cuucuucaug gucggcuuug caccgcucac gucacguggc 720

ucccagcaau accgcgcccu caccguuccc gaacucaccc aacagaugug ggacuccaag 780

aacaugaugu gugccgcuga uccccgucac ggucgcuacc ucacggcauc agcaauguuc 840

cguggaaaaa ugagcacgaa ggagguggau gaacagauga uaaacgugca gaacaagaac 900

ucgucguacu uuguugagug gauccccaac aaugugaaau caacuguuug ugacaucccu 960

ccaacggguc ucaaaauggc uucgacguuu auugggaacu cuacuuccau acaagagaug 1020

uuuaggaggg ugagugaaca guucacggcu auguuccgua ggaaggcuuu cuugcauugg 1080

uacacaggag aggggaugga cgagauggag uuuaccgagg cagag 1125

<210> 7

<211> 582

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 7

aagaagauca agaucgggau caauggcuuu ggaaggaucg gucgucuugu agcuaggguu 60

gcucuccaga gagacgaugu ugaacucguu gcuguuaacg aucccuucau uaccacugau 120

uacaugacau auauguucaa guaugacagu guucacggcc aguggaagca ucaugagcuu 180

aagguuaagg acucuaagac ccuucuuuuc ggugagaaac caguuacugu uuuuggccac 240

aggaacccgg aagaaauccc uuggggugaa accggagcug aguuuguugu ugagucuacu 300

ggaguguuca cugacaagga caaggcugcu gcccacuuaa aggguggugc aaagaaggug 360

gucaucucug ccccaaguaa ggaugcuccu auguuuguua uggguguuaa ugagaaagaa 420

uacaagcccg aucuucacau ugucuccaau gcuagcugca cuacuaacug ucuugcuccg 480

cuugccaagg ucaucaauga uagguuuggc auuguugagg gucuuaugac aaccguucac 540

uccaucacgg ccacucagaa gacuguugau ggaccaucaa gc 582

<210> 8

<211> 585

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 8

gcuggccgug accuaacuga ugcccucaug aaaauccuua cggagcgugg guacucuuuc 60

accaccacag ccgagcguga aaucgugagg gacaugaagg agaagcuagc cuacauagcc 120

cuggacuacg agcaagaguu ggaaacuucc aagacuagcu cuuccguuga gaaaagcuac 180

gaguugccug auggacaggu gaucaccauc ggggcugagc guuuccgcug cccggaaguc 240

cuuuuccagc cauccaugau uggaauggag gcagcgggca uccaugagac cacauacaau 300

uccaucauga agugugacgu ggauauuagg aaggaccuuu acggaaacau cguucucagu 360

ggugggucaa ccauguuccc uggaauugcu gauagaauga gcaaggaaau aacagcguug 420

gccccgagca gcaugaaaau aaagguggug gcuccaccag agaggaagua caguguuugg 480

aucggaggau ccauccucgc aucccucagu accuuccagc agauguggau ugcaaaggca 540

gaguacgaug aaucuggacc guccauugug cacaggaaau gcuuc 585

<210> 9

<211> 468

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 9

uuauuacaga agaagaguag uuuccuugca uucgaaagcg aucucggauu cuccaauuca 60

auggcucgua ccaagcaaac ugcucguaag ucuacuggag gcaaggcgcc aaggaagcag 120

cuugcuacca aggcugcucg gaagucugcc ccuacuacug gaggagucaa gaagccccac 180

agauacagac cuggaacugu ugcucuucgu gaaauucgca aguaucagaa aaguacugaa 240

cuccuaauca ggaaguuacc auuccagagg cuuguucgug agauugcuca agauuucaag 300

acugaccuga gguuccagag ccaugcaguc uuggcacugc aggaggcagc agaggcauac 360

cuuguugggu uguuugaaga uacuaaucug ugugcaauuc acgccaagcg ugucacuauu 420

augcccaagg auauucagcu ugccaggaga auuagggggg agagggcu 468

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atacgcactc ccacacgcc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctcacgatt tcccgctct 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccgataac ttcgtgtttg g 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgacatcgag aaccgaatca at 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaataacag cgttggcccc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaaggtact gagggatgcg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggagtcaag aagccccaca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgaatctca cgaacaagcc 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgatgttgaa ctcgttgctg tt 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agctcatcat gcttccactg g 21

Claims

1.一种用于蓝莓内参基因的实时荧光定量PCR引物对在ABA胁迫状态或高温胁迫状态下的蓝莓目的基因表达丰度分析中的应用，所述PCR引物对包括针对蓝莓actin7基因的PCR引物对和/或针对蓝莓TUB基因的PCR引物对，所述蓝莓的品种为布里吉塔；

所述高温胁迫为40-43℃胁迫；

以SEQ ID NO.5所示RNA序列为模板，设计得到所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对；

以SEQ ID NO.6所示RNA序列为模板，设计得到所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

3.如权利要求1所述的应用，所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

4.一种测定蓝莓目的基因表达丰度的方法，所述方法为测定ABA胁迫状态或高温胁迫状态下所述蓝莓目的基因表达丰度；所述方法的步骤为：以蓝莓actin7基因和/或蓝莓TUB基因为内参基因，以针对所述蓝莓actin7基因的PCR引物对和/或针对所述蓝莓TUB基因的PCR引物对作为扩增所述内参基因的引物对，使用实时荧光定量PCR法测定所述蓝莓目的基因的表达丰度；所述蓝莓的品种为布里吉塔；

所述高温胁迫状态为40-43℃胁迫状态；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述针对蓝莓actin7基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

6.如权利要求4所述的方法，所述针对蓝莓TUB基因的PCR引物对的特异性部分分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。