CN108486131A

CN108486131A - 一种美洲南瓜tua基因及应用

Info

Publication number: CN108486131A
Application number: CN201810515067.7A
Authority: CN
Inventors: 朱海生; 李永平; 刘建汀; 陈敏氡; 王彬; 温文旭; 林珲; 张前荣; 温庆放
Original assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明属于分子生物学领域，提供一种美洲南瓜α‑tubulin（TUA）基因及其作为内参基因的应用。美洲南瓜TUA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该基因序列设计的美洲南瓜实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，本发明所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，具有很高稳定性、可靠性和重复性。研究表明美洲南瓜α‑tubulin在不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，适合在美洲南瓜基因表达研究中作为内参基因。

Description

一种美洲南瓜TUA基因及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种美洲南瓜不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达的α-tubulin（TUA）基因及其作为内参基因的应用。

背景技术

美洲南瓜(Cucurbita pepo L．)，又名西葫芦，为葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属一年生草本植物，原产美洲南部，十九世纪中叶我国开始栽培。美洲南瓜味道鲜美，营养丰富，且具有很好的医疗保健功能，深受大众喜爱，在我国大范围的种植，现已成为仅次于黄瓜的第二大瓜类蔬菜。随着其分子生物学研究的不断深入和发展，基因表达分析正逐渐应用于揭示美洲南瓜基因调控机理的研究中。

实时荧光定量RT-PCR( real-tim e quantitative reverse transcriptionPCR, qRT-PCR)具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达分析。qRT-PCR 关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。微管蛋白(tubulin)是细胞的一种骨架蛋白，参与细胞内胞质环流、形状维持、运动、分裂、分化、物质运输、信号转导以及极性建成等重要的生理活动，可以分为α、β、γ、δ、ε 等多种亚家族，其中α-tubulin 蛋白和β-tubulin 蛋白组成一种异源二聚体蛋白，大量研究表明α-tubulin 基因在多种植物不同器官中是非组成型表达，作为内参基因在分析植物基因表达中应用广泛。但目前关于美洲南瓜α-tubulin（TUA）基因的克隆和作为关于美洲南瓜内参基因的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美洲南瓜不同组织、不同时期及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达的α-tubulin（TUA）基因及其作为内参基因的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种美洲南瓜内参基因，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；根据对美洲南瓜果实转录组Illumina高通量深度测序获得并经验证。

进一步地，以所述内参基因的核苷酸序列为基础，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

且该实时荧光定量PCR引物为：

正向引物5'- TTCTCCCGAATTGACCACAA -3'，

反向引物5'- TCCTTCATCGTCCTCACCCT -3'。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种美洲南瓜内参基因，同时揭露了利用该美洲南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于美洲南瓜基因表达分析时，能够提高美洲南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大提高采用实时荧光定量检测美洲南瓜时的检测效率，并提高检测结果的可信度。

附图说明

图1 是本发明中实施例1的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2 是本发明中实施例2的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图3 是本发明中实施例3的PCR扩增曲线图。

图4 是本发明中实施例3的溶解曲线图。

图5是本发明中实施例4的1% 的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国ABI7500 实时定量PCR 仪，美国ABI Veriti 96-well热循环仪，美国ABI PowerSYBR® Green PCR Master Mix, pMD18-T-vector、cDNA第一链合成试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、Marker DL 2000、Taq DNAPolymerase、dNTP均为宝生物工程（大连）有限公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品，引物合成和克隆测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成，其余生化试剂均为国产分析纯。

实施例1 内参基因的获得

根据本课题组对美洲南瓜果实转录组Illumina高通量深度测序的结果，筛选得到TUA基因全长，在此基础上，设计cDNA开放阅读框（open read frame，ORF）引物进行验证(图1)。具体地，该对引物：正向引物5'- :ATGAGAGAGTGCATTTCAATCC -3'，反向引物5'-CTGGCATATCATCATGTTCA -3'。

PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含25 ng模板、0.4 μmol/L正向引物、0.4μmol/L反向引物、0.15 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5 μL、其余成分为灭菌的超纯水。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸60s，35个循环；最后72℃下延伸7 min；于4℃下保存。

实施例2 实时荧光定量PCR 设计和常规PCR检测

以实施例1获得的美洲南瓜内参基因TUA的核苷酸序列为基础，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为180 bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQ ID NO：2、3所示）：正向引物5'-TTCTCCCGAATTGACCACAA -3'，反向引物5'- TCCTTCATCGTCCTCACCCT -3'。

提取美洲南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、以实时荧光定量PCR引物为引物对进行PCR扩增，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：

PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含25 ng模板、0.4 μmol/L正向引物、0.4 μmol/L反向引物、0.15 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5 μL、其余成分为灭菌的超纯水；

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35个循环；最后72℃下延伸7 min；于4℃下保存。

将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示；由图2可知，PCR扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带，经测序大小为180 bp，符合预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR 引物验证。

实施例3 实时荧光定量PCR 引物验证

提取美洲南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、按照Power SYBR® Green PCR Master Mix说明书在ABI7500 实时定量PCR 仪上进行PCR 反应，PCR 反应的反应体系与反应程序如下：

反应体系为：反应体系的总体积为25μL，12.5 μL Power SYBR® Green PCR MasterMix，1 μL 模板，实施例2中实时荧光定量PCR引物的正向引物0.5 μL（浓度为10 μmol/ L），实施例2中实时荧光定量PCR引物的反向引物0.5 μL（浓度为10 μmol/ L），补蒸馏水至总体积25 μL。

反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共 40个循环；4℃保存；每个反应做3个重复。

反应的结果如图3（其中，ΔRn指荧光强度、cycle指循环数）所示， 3次重复的荧光定量PCR 扩增曲线均很好。且为检验反应的特异性，申请人在PCR 后进行融解曲线分析，分析结果如图4所示，3次重复的平均Tm（溶解温度）分别为83.8℃，且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所设计的一对引物特异性强（即实施例2中的实时荧光定量PCR引物），扩增效率高，特异性强，能够用于美洲南瓜荧光定量PCR的内参引物实验。

实施例4 美洲南瓜TUA基因表达稳定性分析

分别提取美洲南瓜根、茎、花、幼叶、老叶、幼瓜、老瓜、高温处理（38℃）叶片、低温处理（8℃）叶片、干旱处理1天叶片、干旱处理3天叶片的总RNA，之后分别按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，以获得各自的cDNA；利用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对，以获得的11种材料的cDNA 为模板，分别进行PCR扩增，PCR扩增体系与扩增程序如下：

PCR扩增体系：反应体系的总体积为25μL，25 ng模板、0.4 μmol/L正向引物、0.4 μmol/L反向引物、0.15 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5 μL、其余成分为灭菌的超纯水。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸7 min；于4℃下保存。

将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，标识1至12分别为美洲南瓜根、茎、花、幼叶、老叶、幼瓜、老瓜、高温处理（38℃）叶片、低温处理（8℃）叶片、干旱处理1天叶片、干旱处理3天叶片的的PCR扩增反应结果；由图5显示，采用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对时，扩增所得的11个条带亮度基本一致，从而表明在美洲南瓜不同组织、各生长发育阶段、及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，即说明了实时荧光定量特异引物在美洲南瓜基因表达中的稳定性，从而适用于美洲南瓜基因表达的研究。

综上，本发明提供了一种美洲南瓜内参基因，并揭露了利用该美洲南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于美洲南瓜基因表达分析时，能够提高美洲南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高采用实时荧光定量检测美洲南瓜时的检测效率，并提高检测结果的可信度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院作物研究所

<120> 一种美洲南瓜TUA基因及应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1826

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaaatgt aaaccactgc ccctcttctt ccgttccatt cggctctcac tataaatacg 60

cttctccatt catttcctta tcgtctatcc gatccaaaat aagggtttct aaggggaagg 120

cgtcttcaca aacgtctttc ttcctgtcgc gagatatttt atttctctcc agttcctttt 180

cagatctctg tttcttcttc ttcattcccc gttcctaagc caaaatgaga gagtgcattt 240

caatccacat tggtcaggcc ggtatccagg tcggaaatgc ctgctgggag ctttactgcc 300

tcgaacacgg tattcagccc gatggccaaa tgccaggcga caccactact ggtggaggcg 360

atgatgcttt caacaccttt ttcagtgaaa ctggtgcggg aaagcatgtt cctcgtgcgg 420

tttttgtcga tcttgaacct acagttattg atgaggtgag gactggaact taccgtcagc 480

tcttccaccc tgaacaactc atcagtggca aggaagatgc cgccaacaac tttgcccgtg 540

gtcactacac cgttgggaag gaaattgttg atctctgctt ggaccgaatc cgcaagctag 600

ctgataactg cactggtctt caaggattcc ttgtgttcaa cgctgttggt ggtggtactg 660

gctctggtct tggctccctc cttttggagc gtttatcggt tgactatgga aagaaatcca 720

agcttgggtt cactgtttac ccctccccac aagtctcaac ctctgttgtt gagccataca 780

acagtgtcct ctcaacccat tccctcttgg aacacaccga tgtcgctgtg ctccttgaca 840

atgaagccat ttacgatatc tgcaggcgct cccttgacat tgagcgaccc aactactcca 900

acctcaaccg cctggtgtct caggttattt catctttaac tgccagtttg aggttcgatg 960

gtgccctgaa tgtggatgtg aacgaattcc agaccaactt ggtcccatac cccagaatcc 1020

acttcatgct ttcctcatat gcaccagtga tctcagccga gaaggcttac catgagcagc 1080

tctcagtggc tgagatcacc aacagtgcct tcgagccatc gtctatgatg gttaagtgtg 1140

acccccgaca tggaaagtac atggcttgct gtctgatgta ccgtggtgat gttgtgccaa 1200

aggacgtgaa tgctgctgtt gctaccatca agaccaagcg taccatccag tttgttgact 1260

ggtgccccac tgggttcaag tgtggtatca actaccagcc accaactgtt gtccctggag 1320

gcgatcttgc ccgggttcag agggctgtct gcaagatctc taactcaacc agcgttgctg 1380

aggtcttctc ccgaattgac cacaagtttg atctcatgta tgccaagcgc gccttcgtgc 1440

attggtatgt cggtgagggt atggaggaag gagagttctc tgaagcccga gaggatcttg 1500

ctgccctcga gaaggattat gaagaagtcg gtgctgagtc ggctgagggt gaggacgatg 1560

aaggagaaga ctattgaaca tgatgatatg ccagatctct cctcattgtt aggagtgggt 1620

tatgtctgtc ccccttcgta tgttggtgct gtctttgtct gttatgtttt tttttcttat 1680

catgaaatgt tatcctgtga taattgtttc caaggctttt gtgaacaaac atctattatt 1740

ctcattttaa tcaatttgcc attttattaa tggcttgtta ttttgctcta ttgtttttta 1800

atctaaagat ttttatctga gtcttc 1826

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttctcccgaa ttgaccacaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccttcatcg tcctcaccct 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagagagt gcatttcaat cc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctggcatatc atcatgttca 20

Claims

1.一种美洲南瓜TUA基因，其特征在于，该基因碱基序列如SEQ ID NO.1 所示。

2.一种美洲南瓜实时定量PCR 引物，其特征在于，以权利要求1中所述内参基因的核苷酸序列为基础，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

且该实时荧光定量PCR引物为：

正向引物5'- TTCTCCCGAATTGACCACAA -3'，

反向引物5'- TCCTTCATCGTCCTCACCCT -3'。

3.如权利要求1所述的基因作为内参基因在研究美洲南瓜基因表达中的应用。