CN108504665B

CN108504665B - 一种花椰菜内参基因及其应用

Info

Publication number: CN108504665B
Application number: CN201810614138.9A
Authority: CN
Inventors: 林珲; 朱海生; 刘建汀; 薛珠政; 李大忠; 张前荣; 温庆放
Original assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108504665A

Abstract

本发明提供一种花椰菜内参基因及其应用，属于分子生物学领域，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。用于制备所述基因的克隆引物为：BoACT‑F：CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT；BoACT‑R：AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT。该基因可作为花椰菜的内参基因用于荧光定量PCR中标定其他新基因。寻找合适稳定的花椰菜内参基因，对提高荧光定量PCR实验的重复性、稳定性和实验数据的可靠性意义重大，对锚定花椰菜新基因，相关基因功能的表达分析将起到不可估量的作用。

Description

一种花椰菜内参基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种花椰菜内参基因及其应用。

背景技术

近年来，随着分子生物学的飞速发展，基因组学研究进入一个新阶段，挖掘新基因，明确其生物学功能和在有机体代谢过程中的调控机理是科研工作者的重要任务。实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR），是一种反应灵敏度高、特异性强、重复性好的新型核酸定量技术，是在普通PCR基础上发展起来研究有机体中不同组织基因表达的重要生物学手段之一。实时荧光定量PCR实验获得的数据，容易受到PCR 扩增效率、逆转录、RNA 质量及cDNA 合成等因素的影响，使得获得的数据和检测基因的真实数据有所偏差。为了解决这个关键问题，内参基因作为校正和标准化数据，被应用到实际操作中，以减小样品数据的误差。一般来说，理想的内参基因是在不同的RNA提取方法下、在有机体的不同器官、不同的发育时期都能稳定表达的一类看家基因。常见的内参基因包括微管蛋白基因(tubulin，TUB) 、泛素基因（ubiquitin，UBQ）、肌动蛋白基因（actin，ACT）、甘油醛－3－磷酸－脱氢酶基因(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH) 等。acitn作为细胞骨架蛋白分子存在与高等植物有机体中，它在细胞进化过程中是高度保守的一种重要蛋白。actin 在有机体内不同的器官和组织，病理或生理状态下都持续恒量表达，并能高水平表达，且易于被引物扩增，具有高度保守性。因此，actin基因常常作为内参基因被广泛应用于植物的基因表达研究中。

花椰菜 (Brassica oleracea L. var. botrytis L.)原产于地中海沿岸，19世纪传入我国南方地区，是十字花科芸薹属甘蓝种中的变种，以花球为食用器官，在南方福建、浙江、江苏等地均有栽培。花椰菜富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、食物纤维、矿物质等营养成分，有很高的食用价值。此外，它还含有类黄酮化合物、硫代葡萄糖苷、黑子芥酶等多种生物活性成分。花椰菜作为药食兼用的蔬菜深受消费者喜爱。随着生物技术发展的日新月异，科研工作者对花椰菜基因组学方面的研究不断深入，基因表达分析是其中必不可少的研究项目之一。目前，还未见关于花椰菜内参基因的使用和筛选的报道，也没有关于花椰菜BoACT 的克隆及其作为内参基因的研究。本发明克隆了花椰菜 BoACT 基因作为内参基因，为攻克花椰菜实时荧光定量 PCR 检测中无内参基因的难题，在此基础上设计了1对实时荧光定量 PCR 引物，旨在为开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究有重要的理论意义和实践价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花椰菜内参基因及其应用，对开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究有重要的理论意义和实践价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种花椰菜内参基因及其应用，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。用于制备所述基因的克隆引物，所述引物序列为：

BoACT-F：CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT；

BoACT-R：AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT。

以所述花椰菜肌动蛋白基因的核苷酸序列为基础，设计用于检测花椰菜的实时荧光定量PCR引物，引物序列为：RTACT-F：ATCCTCAGCGAGACGAAG；

RTACT-R：TTGTCACAGACGATGGGT。

所述基因作为内参基因在花椰菜基因表达分析中的应用。

本发明的优点在于：

本发明提供了花椰菜 BoACT 基因作为内参基因，为攻克花椰菜实时荧光定量PCR 检测中无内参基因的难题，在此基础上设计了1对实时荧光定量 PCR 引物，旨在为开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究有重要的理论意义和实践价值。本发明对花椰菜不同组织、不同品种、花球不同时期和干旱处理下的花椰菜样本进行检测，并以 BoACT 为内参基因，花椰菜5个干旱处理为材料，进行花椰菜转录因子BoMYB ₁₂ 基因的表达分析，来进一步验证 BoACT 作为花椰菜持家基因的稳定性，结果表明，BoACT 基因在这些样本中均能稳定表达。

附图说明

图1 花椰菜肌动蛋白基因凝胶电泳图。

图2花椰菜BoACT 与其它植物actin 的进化树图。

图3花椰菜不同组织器官中 6 个持家基因的C_T值图。

图4 BoACT 基因在花椰菜不同组织器官中的表达量图。

图5BoACT 基因在花椰菜不同品种中的表达量图。

图6 BoACT 基因在花球不同时期中的表达量图。

图7 BoACT 基因在花椰菜干旱处理中的表达量图。

图8 BoACT 和 BoMYB₁₂ 溶解曲线图。

图9 BoMYB₁₂ 基因在花椰菜干旱处理中的表达分析图。

具体实施方式

实施例1

1 材料与方法

1.1实验材料

花椰菜‘庆农65天’于2017年8月中旬播种于实验室培养箱，10月上旬定植于福建省农业科学院蔬菜中心研究基地。从田间筛选表面完好、无病虫害、无机械损伤的不同发育时期的花球，用无菌袋采回，后用无菌刀选取中间部位备用。

共设置4个实验：

（1）不同组织部位：采集‘庆农65天’花椰菜的根、茎、叶、花、花球和种子；

（2）：不同品种：分别取金色花菜、绿宝塔、庆农65天、鹭美80天、天山雪、雪丽雅、玉如意、雪白80天花椰菜三叶一心时期的小苗叶片；

（3）采集庆农65天花椰菜不同花球的发育时期：花球初期I，花球初期II，花球初期III，花球中期I，花球中期II，花球中期III，商品球。

（4）对花椰菜三叶一心时期的小苗进行干旱处理，采集干旱1天，干旱2天，干旱3天，干旱4天和复水期的叶片。

实验设3次重复，将采集的样品迅速液氮速冻后放置-80℃超低温冰箱保存，备用。

实验试剂

实时荧光定量PCR仪（ABI 7500）购自美国ABI公司，通用植物总RNA提取试剂盒购于北京百泰克公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于美国Omega公司，Taq DNAPolymerase、dNTPs、DNA Marker DL 2000、pMD18-T simple、PrimeScriptTM 1st StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒、PrimerSTAR HS DNA Polymerase试剂盒、荧光定量试剂盒SYBR® Premix EX TaqTM II均购于大连宝生物公司，其他生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯级。

BoACT引物的设计及PCR扩增

花椰菜不同组织总 RNA 的提取参照百泰克试剂盒说明书步骤进行。CDNA 按照大连宝生物公司的 PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒的方法合成。每个样品所需的RNA 的用量，根据所提取的RNA浓度确定其比例，以确保每个组织样品的mRNA含量保持一致。

从本实验室已得到的 actin部分序列以及NCBI数据库中已公布的甘蓝、甘蓝型油菜和芜菁等芸薹属蔬菜的 actin基因设计1 对引物，能够扩增出完整的actin的开放阅读框(Open Read Frame)，所用的引物碱基序列见表1。

反应体系: 总体积为25μL，含100 ng DNA、0.4μmol·L^－1 BoACT-F 正向引物、0.4μmol·L^－1BoACT-R 反向引物、0.2 mmol·L^－1dNTP、1.0 U Taq DNA 聚合酶、1. 5 mmol·L^－1含MgCl₂的10 × PCR 缓冲液 2.5 μL，其余成分为灭菌的超纯水。PCR 反应程序为:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35 个循环；最后72℃延伸5 min；在4℃下保存。PCR 扩增产物经1%的琼脂糖电泳检测后，回收纯化连接到 pMD19-T载体上，转化，挑取阳性克隆子，PCR 检测后测序，获得的基因全长序列后利用生物信息学数据库和互联网上的软件进行分析。

生物信息学分析

基因生物信息学分析所使用到的软件主要有：DNAMAN V6软件；EditSeq 5.01软件；序列处理在线工具包（SMS）（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）；多序列比对和进化树的构建采用Clustal W2软件和MEGA 4.0软件；翻译后蛋白修饰MotifScan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_ scan）；蛋白的一级结构分析采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）软件；亚细胞定位分析采用Wolf Psort Prediction软件（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）。

荧光定量引物设计及荧光定量分析

根据前人研究结果和已获得的研究数据，选取出常用的持家基因6个用于内参基因的选择研究，采用Primer Premier 5.0软件，并遵循定量PCR引物设计的原则设计出荧光定量特异引物，具体引物见表1。使用赵风治等使用的β- actin作为参考基因。同时设计了一个控制花椰菜类黄酮生物合成途径的转录因子基因BoMYB ₁₂的引物（见表1），探讨BoMYB ₁₂在花椰菜干旱处理中的表达量。

实验按照百泰克植物总RNA提取试剂盒的方法提取1.1中所有花椰菜样品总RNA，按照PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA。参照SYBR^®Premix Ex Taq ^TM试剂盒说明书，配制25 μL的反应体系，在荧光定量PCR仪（ABI 7500）上进行扩增，反应体系为：4 μL cDNA模板，10 μL SYBR^® Premix，0.4 μL正向引物RTACT-F（10 μmol · L^-1），0.4 μL反向引物RTACT-R（10 μmol · L^-1），0.4 μL Rox，加ddH₂O至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，40个循环。以上反应均重复3次。在Excel软件中采用2^-∆∆Ct法分析处理数据并得出目的基因的表达情况。

表1 试验使用引物的序列

2 结果与分析

2.1 花椰菜 BoACT cDNA 全长的克隆与结构分析

用反转录后的‘庆农65天’ 花椰菜叶片 cDNA 为模板，使用克隆引物 BoACT-F、 BoACT-R 获得1条1000 bp 左右的特异条带（图1），经测序验证，该DNA序列大小为 1 134bp，与预测结果吻合。

核苷酸分析表明，BoACT含1个长1134 bp的ORF，其编码区的GC含量为52.65%，预测编码377个氨基酸，理论分子量为41.77 kD，等电点为5.396；就氨基酸组成而言，在构成该蛋白的20种氨基酸中，丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）含量最高（7.7%），色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）含量最低(1.1%)；就氨基酸的特性而言，该蛋白包含38种强碱性氨基酸(K，R) 50种强酸性氨基酸(D，E) 126种疏水氨基酸(A，I，L，F，W，V) 87种极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)，脂肪族指数（AI）为85.09，不稳定系数（II）为37.97，预测该蛋白为稳定的蛋白质。

Motif Scan分析发现，55 ~ 65位为肌动蛋白1号特征位点；358 ~ 366位为肌动蛋白特征2号位点；106 ~ 118位为与肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白的特征位点；4 ~ 377位氨基酸经过二次身份验证证实为肌动蛋白。

花椰菜BoACT cDNA 基因的同源性分析

将获得的花椰菜 BoACT（GenBank 登陆号为：MG598643）核苷酸序列在 NCBI 上进行 Blast 比对，结果表明，BoACT 与盐芥（Thellungiella halophila，AK353412.1）等23个物种同源性高达86%，其中，和甘蓝（Brassica oleracea var. oleracea XM_013765231.1）的同源性高达95%，和油菜（Brassica napus，NM_001316010.1）、芜菁（Brassica rapa，XM_009127097.2）、萝卜（Raphanus sativus，XM_018615718.1）、山嵛菜（Eutrema salsugineum，XM_006399401.2）等的相似性分别达到94%，93%，91%，87%，数据说明这个核苷酸序列为肌动蛋白基因。

2.3花椰菜BoACT基因的系统进化分析

为了分析花椰菜BoACT和其他16个植物之间的系统进化关系，笔者从NCBI上下载了这些植物actin基因的氨基酸序列构建了系统进化图（图2）。结果显示，花椰菜肌动蛋白基因和甘蓝肌动蛋白基因（Brassica oleracea var. oleracea ，XP_013620685.1 ）亲缘关系最近；从图中发现，拟南芥（ Arabidopsis thaliana，NP 196543.1 ）、芥菜（Brassica juncea，AJG_03099.1）、板蓝根（Isatis tinctoria，AAW63030.1）肌动蛋白基因和花椰菜肌动蛋白基因组成单独的进化群体，因此它们亲缘关系较近。与白梨（Pyrus×bretschnei - deri，NP_001289215.1）、陆地棉（Gossypium hirsutum，NP_ 001314018.1）、巨桉（Euc alyptus grandis，XP_010027698.1）、草莓（Fragaria×ananassa，AEP31940.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002282516.1）等12种植物的肌动蛋白基因关系较远，它们被分到另一个大分支中，这与传统的植物分类结果相同。

内参基因的荧光定量PCR分析

以花椰菜不同组织部位（根、茎、叶、花球、花、种子）来源的第1链cDNA 为模板，进行实时荧光定量PCR 分析。结果表明，在6个看家基因中，只有actin的RT-PCR实验重复性最好，CT值最为稳定，actin在根、茎、叶、花、花球、种子的CT值基本一致（图3）。

表达模式分析

2.5.1 不同组织

荧光定量PCR分析结果（图4）表明，BoACT在‘庆农65天’花椰菜的不同组织根、茎、叶、花、花球和种子中均有表达，图中结果说明，BoACT在各组织中的表达量基本一致。

2.5.2 不同品种

BoACT在所选的8个花椰菜品种中表达量见图5，在‘金色花菜’、‘绿宝塔’、‘庆农65天’、‘鹭美80天’、‘天山雪’、‘雪丽雅’、‘玉如意’、‘雪白80天’8个花椰菜品种中，BoACT表达量趋于一致。

2.5.3 花球不同时期

‘庆农65天’花椰菜在花球初期I，花球初期II，花球初期III，花球中期I，花球中期II，花球中期III，商品球7个花球不同发育时期的RT-PCR结果显示（见图6），BoACT在花球发育的7个不同时期，表达量均一稳定。

2.5.4 干旱处理

‘庆农65天’花椰菜在干旱1天，干旱2天，干旱3天，干旱4天，复水5个干旱处理的RT-PCR结果显示（见图7），BoACT在花椰菜干旱处理5个不同时期，表达量均一稳定。

BoACT 标定BoMYB ₁₂在花椰菜干旱处理中的表达

以 BoACT 为内参基因，花椰菜干旱1天、干旱2天、干旱3天、干旱4天和复水，5个干旱处理为材料，进行花椰菜转录因子BoMYB ₁₂(GenBank 登录号为MH234397)基因的表达分析，来进一步验证 BoACT 作为花椰菜持家基因的稳定性。

实时荧光定量 PCR 的熔解曲线和试验结果见图8和图9。图8显示 Boactin和BoMYB ₁₂的熔解曲线均为单峰曲线，表明两个引物特异性较好，可以用于 qRT-PCR 试验。

RT-PCR 试验结果显示，BoMYB ₁₂在干旱1天、干旱2天、干旱3天、干旱4天和复水中的表达量呈上调模式，其中在干旱1天中的表达量最高，干旱3天中次之，在干旱2天和干旱4天中的表达量较低，BoMYB ₁₂在复水中的表达量最低（图9）。

试验结果与 BoMYB ₁₂可以调控类黄酮生物合成代谢相吻合，因此可知 BoACT 作为花椰菜干旱处理研究中的内参基因是可行的。

讨论

肌动蛋白（actin）基因是分析功能基因表达研究的依据，一般作为内标基因研究发现的新基因或外源基因。花椰菜在基因组学方面的研究起步较晚，目前，还未看到关于花椰菜 BoACT 内参基因克隆方面的相关报道。申请人根据甘蓝、甘蓝型油菜、芜菁等芸薹属蔬菜的actin 基因序列，克隆了一个花椰菜 actin 基因，其基因大小为1143 bp。从同源性分析发现，BoACT和甘蓝（Brassica oleracea var. oleracea XM_013765231.1）的同源性高达95%，和油菜（Brassica napus，NM_001316010.1）、芜菁（Brassica rapa，XM_009127097.2）、萝卜（Raphanus sativus，XM_018615718.1）、山嵛菜（Eutrema salsugineum，XM_006399401.2）等的同源性高达90%以上，说明 actin 基因为高度保守的基因。在花椰菜 actin 基因与其他植物 actin 基因序列同源性比较结果中发现，该基因和其他植物 actin 基因序列存在一定的差异性。因此，有必要进行花椰菜 Boactin 基因的克隆，直接使用其他同源性高的近缘种的 actin 基因为内参基因是不可取的。本申请从本实验室已得到的 actin部分序列以及NCBI数据库中已公布的甘蓝、甘蓝型油菜和芜菁等芸薹属蔬菜的 actin基因，利用 Primer 5.0 软件设计了1 对引物，能够扩增出完整的actin 的开放阅读框 (Open Read Frame) 。本申请为了验证内参基因的稳定性，对花椰菜不同组织、不同品种、花球不同时期和干旱处理下的花椰菜样本进行检测，并以 BoACT 为内参基因，花椰菜5个干旱处理为材料，进行花椰菜转录因子BoMYB ₁₂基因的表达分析，来进一步验证 BoACT 作为花椰菜持家基因的稳定性，结果表明，Boactin 基因在这些样本中均能稳定表达。因此，该基因可作为花椰菜的内参基因用于荧光定量 PCR 中标定其他新基因。据报道，2 个或 2 个以上的内参基因更有助于校正基因表达分析的结果，对微末的差异更具灵敏性，这对微小差异的数据就能得出不同结论的荧光定量 PCR 实验意义重大。但花椰菜其他持家基因UBQ、TUB、18s RNA、GAPDH、EF1α 等基因的克隆未见报道。寻找更稳定的花椰菜内参基因，对提高荧光定量PCR实验的重复性、稳定性和实验数据的可靠性意义重大，对锚定花椰菜新基因，相关基因功能的表达将起到不可估量的作用，这是今后笔者要研究的方向。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院作物研究所

<120> 一种花椰菜内参基因及其应用

<130> 17

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1809

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttatctg ttcttgtggt cgaaatgatt cgtccctgtc gattattatt tattttttga 60

aaggccgaaa ataaagttgt acagataata aacccgccta tttaaattca acattgtttc 120

tccctctttg aattgtctct cgttatcctc agcgagacga agaaagaaag agagagagag 180

agagaggaag actaagcgag aagaaagaga gagagagaga atcgtcttga ttccttagtt 240

cttcttcgat ctcttcttct tcttccgatc tttctaattc aagcttatta aaaaaatggc 300

tgaggctgat gacattcaac ccatcgtctg tgacaatggt accggaatgg tcaaggctgg 360

tttcgccggc gacgatgctc ccagggctgt tttccccagt gttgttggca ggccaaggca 420

tcacggtgtc atggttggga tgaaccagaa ggatgcctac gtcggtgacg aggcacagtc 480

caagagaggt atcctcacct tgaagtaccc gatcgagcac ggtgttgtga gcaactggga 540

tgacatggag aagatctggc atcacacttt ctacaatgag ctccgtatcg ctcctgaaga 600

gcacccggtt cttcttaccg aggctcctct taacccaaag gctaacagag agaagatgac 660

tcagatcatg tttgaaactt tcaactctcc ggctatgtat gttgctattc aagctgttct 720

ctccttgtac gccagtgggc gtaccaccgg tattgtgctc gactctggtg atggtgtgtc 780

tcacaccgtg ccgatctacg agggttatgc tcttcctcac gctatcctcc gtctcgatct 840

cgcgggtcgg gacctcactg attccctgat gaagattctc accgagagag ggtacatgtt 900

caccaccacc gccgagcgag aaatcgtccg tgacattaaa gagaagcttg cttacgtggc 960

tctcgactac gagcaagagc tggagacggc taagagcagt tcttcggtgg agaagaacta 1020

cgagctacct gatggacaag tcatcaccat cggagctgag agattccgtt gccctgaagt 1080

actcttccag ccgtcgctcg tggggatgga agctcctgga atccatgaga caacttacaa 1140

ctccatcatg aagtgtgatg tggatatcag gaaggatctg tatggaaaca tcgtcctcag 1200

tggtggttcg accatgttcc ctggaatcgc tgaccgtatg agcaaagaga tcacggcgct 1260

cgcaccaagc agcatgaaga tcaaggtggt cgcaccgcct gagaggaagt acagtgtctg 1320

gattggagga tccatccttg catccctcag cactttccaa cagatgtgga tctcgaaggg 1380

agagtacgat gagtcgggtc catccatcgt ccacaggaaa tgcttctaag tgtttctgcc 1440

ttctggttcg tggtggtgag tgtggtacga tctatatcca tccccttgtt gagatgggga 1500

ttgaaactat atgttgttat tgtggttgtt tctttttatt atttttggtc tctttagaac 1560

cccttttgaa tgtctctcga gtctttctat gtactttagt ttttaccttt gtttcttatt 1620

tctctttaag gatgcttgtg atgatgctct ggtccttaag taagcaaaaa aaaaaaaagt 1680

cattttatat tttgcatgtc tttggttttc tttttgccgc tggtaacaat tttttaattt 1740

gtattggaca actgcccata ttcttcaatt gctatgcagt tattatggta attgttattc 1800

tcgacatat 1809

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaatcatac tcaaaagaag agtt 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggattcaat ccagccacag gtt 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcctcagcg agacgaag 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttgtcacaga cgatgggt 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgaaatggc tgacaagaag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcatgtactc ggtggtgatg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccgagcgtg agcgtggtat 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cagcacaatc agcctgggag 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cagcgttgga gaaggattat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcagacagca ggagacagat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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actcttccga taaataaatc cacc 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgcaaaca acttcccaga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctcctctta acccaaaggc 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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cacaccatca ccagaatcca gc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aaggttcttg gcggtctttg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aagggaatgc aacttgacga 20

Claims

1.一种花椰菜内参基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述基因作为内参基因在花椰菜基因表达分析中的应用。