CN108085409A - 不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用 - Google Patents

不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法和内参基因的应用，属于荧光定量PCR检测领域。所述筛选方法以甘油醛三磷酸脱氢酶基因、转录延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素基因为候选内参基因，以候选内参基因为模板设计引物；提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；将cDNA为模板进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；根据相对表达量Q值和Ct值采用多个软件对候选内参基因进行稳定性评价；将候选内参基因的稳定性由强到弱排序，选择排序前两位的候选基因作为杉木的内参基因。筛选得到的18S rRNA和/或泛素基因作为杉木不同组织中的内参基因的应用。

Description

不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基 因的应用
技术领域
本发明属于荧光定量PCR检测技术领域，具体涉及不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国最重要的针叶速生用材树种之一，具有生长快、单产高、材质好等特性。杉木的木材纹理通直，结构均匀，耐腐蚀性强，抗虫性较好，被广泛应用于制作家具，建造桥梁、船只等方面。同时，杉木作为常绿针叶树种，树干通直圆满，树冠呈圆锥形，喜光，萌芽更新较好，生长迅速，常作为园林部门推广的优良树种，具有良好的景观和园林欣赏价值。
基因的表达分析现已广泛应用于生物科学的研究中，对于探求基因的表达情况、调控机理的方面均起到至关重要的作用。在转录水平进行基因的表达分析的方法，如实时荧光定量PCR、RNA印迹、基因芯片等，都需要内参基因对目标基因的表达量进行校正与标准化，便于获得真实可靠的结果。然而实时荧光定量PCR结果的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。内参基因稳定性高，能更好的为目的基因的表达进行校正。理想的内参基因是在各个实验条件下，能在各个组织或者细胞中均能恒定表达的基因。而大量研究分析表明，大量潜在的内参基因的稳定性也是均有相对性的，在不同的细胞类型情况下，相同的内参基因的表达并不是恒定不变的。
近年来，植物内参基因的筛选已有许多报道，同时越来越多的学者对杉木的分子调控机制进行研究，分子调控机制很大程度上依赖于目标基因的表达情况，而目标基因的表达情况通常采用实时荧光定量PCR方法进行检测得到，由于杉木基因组与转录组序列的限制，对杉木在不同研究中的内参基因的筛选的报道还较少，也没有关于筛选杉木不同组织中内参基因的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供不同组织中杉木内参基因的筛选方法和内参基因的应用，所述筛选方法能够得到在不同组织中均稳定表达的内参基因，且所述内参能够正确校正目的基因的表达情况。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；
所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18SrRNA、28S rRNA和泛素编码基因；
所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
2)提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；
3)将所述步骤2)中cDNA为模板，用所述步骤1)中引物进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；
Q＝2-△△Ct 式I
4)根据所述步骤3)中相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价；
5)根据所述步骤3)中Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价；
6)根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价结果，将所述候选内参基因的稳定性按照由强到弱进行排序，选择综合排序至少前两位的候选基因作为杉木的内参基因；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制，所述步骤4)和步骤5)之间没有时间顺序的限制。
优选的，所述步骤1)中扩增甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因的引物具有如序列表中SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
特异性扩增转录延伸因子的引物具有如序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
特异性扩增18S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
特异性扩增28S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；
特异性扩增泛素编码基因的引物具有如序列表中SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
优选的，所述步骤3)中qPCR扩增体系如下：2X qPCR反应液10μl，10X正向引物和10X反向引物各0.4μl，模板cDNA2μl，CXR参考染料液0.2μl和ddH2O 7μl。
优选的，所述3)中qPCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环；95℃30s，60℃30s，逐渐升温到95℃。
优选的，所述步骤6)中综合排序的方法如下：
geNorm软件和Normfinder软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的稳定性指数M值由小到大进行排序，M值最小的候选内参基因记为5分，第二最小M值的候选内参基因记为4分，第三最小M值的候选内参基因记为3分，第四最小M值的候选内参基因记为2分，M值最大的候选内参基因记为1分；
BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的标准差和/或变异系数由小到大进行排序，标准差和/或变异系数最小的候选内参基因记为5分，第二最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为4分，第三最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为3分，第四最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为2分，标准差和/或变异系数最大的候选内参基因记为1分；
将三个软件得到的每个候选基因的得分相加，根据各候选内参基因的分值加和由大到小进行排序，选择排序前两位的候选内参基因作为杉木的内参基因。
本发明还提供了18S rRNA和/或泛素编码基因在作为杉木不同组织的内参基因中的应用。
优选的，所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
优选的，所述杉木包括根、茎和叶组织。
优选的，所述杉木苗的树龄为一年生小苗。
优选的，所述内参基因还包括转录延伸因子；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法，以甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素编码基因作为候选内参基因，以候选内参基因为模板设计特异性扩增引物；提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；将所述cDNA为模板进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；根据所述相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价；根据所述Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价；根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价，将所述候选内参基因的稳定性由强到弱进行排序，选择综合排序前两位的候选基因作为杉木的内参基因。本发明提供的筛选方法得到内参基因在杉木不同组织中具有表达稳定性优异的特点，同时所述筛选方法操作简单，结果重复性好，为杉木的内参基因筛选提供了标准化流程。
本发明还提供了18S rRNA和/或泛素编码基因作为内参基因在杉木基因的qPCR检测中的应用。所述18S rRNA和/或泛素编码基因作为内参基因能够正确校正目的基因的表达情况，可以放心应用于目的的表达分析中。
附图说明
图1为实施例1中不同杉木组织中提取的总RNA的琼脂电泳图；
图2为实施例2中候选内参基因溶解曲线；其中图2-1为18S rRNA的溶解曲线；图2-2为28S rRNA的溶解曲线；图2-3为泛素编码基因的溶解曲线；图2-4为转录延伸因子的溶解曲线；图2-5为甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因的溶解曲线。
具体实施方式
本发明提供了不同组织中杉木内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；
所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因(GAPDH)、转录延伸因子(EF1α)、18S rRNA、28S rRNA和泛素编码基因(UBQ)；
所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
2)提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；
3)将所述步骤2)中cDNA为模板进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；
Q＝2-△△Ct 式I
4)根据所述步骤3)中相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价；
5)根据所述步骤3)中Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价；
6)根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价，将所述候选内参基因的稳定性由强到弱进行排序，选择综合排序前两位的候选基因作为杉木的内参基因；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制，所述步骤4)和步骤5)之间没有时间顺序的限制。
本发明根据候选内参基因的核苷选序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18SrRNA、28S rRNA和泛素编码基因；所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因具有如序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
本发明对所述设计引物的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的设计方法即可。
在本发明中，特异性扩增甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因的引物优选具有如序列表中SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；特异性扩增转录延伸因子的引物具有如序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；特异性扩增18S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；特异性扩增28S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.12和SEQ IDNo.13所示的核苷酸序列；特异性扩增泛素编码基因的引物具有如序列表中SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
本发明提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA。
在本发明中，所述杉木苗的树龄为一年生小苗。本发明对所述提取总RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所所熟知的提取RNA的方法即可。本发明实施例中，以TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit试剂盒方法提取总RNA。对总RNA纯度进行测定，260/280值介于1.8～2.1之间，纯度较高，适用于后续试验。
本发明对合成cDNA的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的合成cDNA方案即可。本发明实施例中，采用Promega公司的GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem试剂盒合成cDNA的第一条链。得到cDNA的第一条链后，优选用紫外分光光度计检测cDNA第一链的浓度。cDNA第一链的浓度为统一稀释至100ng·uL-1。。
得到cDNA后，本发明将所述cDNA为模板进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；
Q＝2-△△Ct 式I。
在本发明中，所述qPCR扩增体系优选如下：2X qPCR反应液10μl，10X正向引物和10X反向引物各0.4μl，模板cDNA2μl，CXR参考染料液0.2μl和ddH2O 7μl。
在本发明中，所述qPCR扩增程序优选如下：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环；95℃30s，60℃30s，逐渐升温到95℃。本发明对所述qPCR扩增所用的仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的qPCR仪即可。
在本发明中，各候选内参基因的Ct值与其表达量成反比，Ct值越大，表达量越小。qPCR结果表明，所选择的5个候选内参基因的Ct值范围为8.33～34.98，其中28S rRNA的Ct值最低，平均值为10.66，18S rRNA的Ct值最高，其平均值为32.09，表明各个候选内参基因的表达量不同。
本发明根据所述相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价。
在本发明中，所述geNorm软件的下载地址为https://genorm.cmgg.be/。所述Normfinder软件的下载地址为https://moma.dk/normfinder-software。geNorm软件与Normfinder软件均通过计算内参基因的稳定性指数M值进而分析内参基因在不同样品中的表达稳定性，而M值的是由输入的相对表达量Q值在软件不同的计算方式获得。M值越大稳定性越差，反之，稳定性越好。
在本发明中，所述geNorm软件和Normfinder软件对候选内参基因的稳定性评价中，5个候选内参基因的M值由小到大进行排序，M值最低的候选内参基因记为5分，第二最小M值的候选内参基因记为4分，第三最小M值的候选内参基因记为3分，第四最小M值的候选内参基因记为2分，M值最大的候选内参基因即为1分。
在本发明中，geNorm软件对候选内参基因稳定性评价结果：5个候选内参基因的稳定性排序为18S rRNA>28S rRNA>UBQ>EF1α>GAPDH。
Normfinder软件对候选内参基因稳定性评价结果：UBQ>GAPDH>EF1α>18SrRNA>28SrRNA。
本发明根据所述Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价。
在本发明中，BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性评价中，5个候选内参基因的标准差和/或变异系数由小到大进行排序，标准差和/或变异系数最低的候选内参基因记为5分，第二最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为4分，第三最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为3分，第四最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为2分，标准差和/或变异系数最大的候选内参基因即为1分。
在本发明中，BestKeeper软件对候选内参基因稳定性评估结果：18S rRNA>EF1α>UBQ>GAPDH>28SrRNA。
根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价，将所述候选内参基因的稳定性由强到弱进行排序，选择综合排序前两位的候选基因作为杉木的内参基因。
将三个软件得到的每个候选基因的得分相加之和，根据各候选内参基因的和由大到小进行排序，选择排序前两位的候选内参基因作为杉木的内参基因。
得到各个候选内参基因的得分和由小到大排序，得到结果如下：18S rRNA>UBQ>EF1α>28S rRNA>GAPDH。5个候选内参基因中18S rRNA与UBQ在杉木不同组织中较为稳定，可以作为荧光定量PCR试验的内参基因。28S rRNA与GAPDH评价为较不稳定，不适合作为杉木的内参基因。EF1α可以配合其他内参基因一起使用。
本发明还提供了18S rRNA和/或泛素编码基因在作为杉木不同组织的内参基因中的应用。
在本发明中，所述18S rRNA优选具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述杉木优选的包括根、茎和叶组织。
在本发明中，所述杉木优选的为杉木苗，所述杉木苗的树龄优选的为一年生小苗。
在本发明中，所述内参基因优选还包括转录延伸因子；所述转录延伸因子优选具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
下面结合实施例对本发明提供的不同组织中杉木内参基因的筛选方法和内参基因的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选取无性系杉木幼苗的根、茎和叶为本试验研究对象。使用Hoagland营养液沙培培养，营养液pH＝5.8，营养液配方见表1；培养结束后采集杉木的根、茎和叶，液氮速冻后-80℃保存，备用。
表1Hoagland完全营养液
1.2总RNA提取与cDNA合成
以TIANGEN公司的RNAprep Pure PlantKit试剂盒为基础，提取杉木苗根、茎、叶的总RNA，利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性并用-80℃超低温冰箱冻存。
选用Promega公司的GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒，参照试剂盒说明合成杉木根、茎、叶的cDNA一链。用紫外分光光度计(Eppendorf)检测cDNA第一链的纯度，将样品cDNA置于-20℃冰箱冻存备用。
1.3内参基因的选择与特异性引物的设计
根据相关植物内参基因的文献[21,23]，在杉木中挑选6个功能不同的基因作为本实验候选的内参基因，分别是甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)、转录延伸因子(EF1α)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、28S核糖体RNA基因(28S rRNA)和泛素(UBQ)。选用已报道的杉木相关文献中的内参基因选取5个内参基因的引物。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4内参基因的qPCR
参照Promega公司的GoTag qPCRMasterMix试剂盒qPCR反应体系，在StepOnePlusReal-Time PCR System仪器上进行荧光定量PCR。反应体系为20ul，包括：qPCRMasterMix(2X)10μl，ForwardPrimer(10X)和Reserve Primer(10X)各0.4μl，模板cDNA第一链2μl，CXRReference Dye(with SYBR&ROX)0.2μl以及Nuclease-FreeWater 7μl。PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环；95℃30s，60℃30s，逐渐升温到95℃，速度0.11度/秒，针对扩增结果采用相对表达量Q＝2-△△Ct法来计算目的基因的相对表达水平。实验设置3次生物学重复，设置不添加cDNA模板的阴性对照。
1.5内参基因引物特异性鉴定
收集qPCR反应产物，使用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测内参基因，利用溶解曲线图分析鉴定各个内参基因的特异性。
1.6内参基因表达稳定性分析
选用内参基因稳定性评价软件geNorm和Normfinder软件，根据5个内参基因的相对表达量Q值，对候选内参基因进行稳定性评价；使用BestKeeper软件，更具内参基因的Ct值对候选内参基因的稳定性进行统计分析，分析选择杉木不同组织中合适的内参基因。
2结果与分析
2.1总RNA样品与引物特异性检测
通过1％琼脂糖凝胶电泳显示，各个样品间的总RNA电泳图谱清晰，无条带弥散现象(图1)，且28S rRNA条带比18S rRNA条带亮度高，说明总RNA完整性良好，未出现降解。紫外分光光度计检测显示，各个样品的总RNA的260/280值介于1.8～2.1之间，纯度较高，符合后续试验要求。
以cDNA为模板进行PCR扩增后，收集PCR产物，使用1％琼脂糖凝胶电泳，检测可得，5个候选内参基因的条带单一，无其他杂带，且片段大小符合预期，表明该内参基因确实存在于杉木中。分析qPCR的溶解曲线，5个候选内参基因均由明显的单一溶解峰(图2)，阴性对照则无信号显示(数据为显示)，5个候选内参基因引物均具有较好的特异性。
2.2内参基因Ct值分析
各个基因的Ct值与其表达量成反比，Ct值越大，表达量越小。qPCR结果表明，所选择的5个候选内参基因的Ct值范围为8.33～34.98，其中28S rRNA的Ct值最低，平均值为10.66，18S rRNA的Ct值最高，其平均值为32.09，表明各个候选内参基因的表达量不同(详见表2)。
表2候选内参基因的引物序列与Ct值
2.3内参基因稳定性分析
2.3.1geNorm与Normfinder分析
geNorm软件是根据平均稳定指数M值确定对比的内参基因中的最稳定内参基因，且M值越低，该内参基因的稳定性越高，以M＝1.5为上限，M值低于1.5的内参基因判定为较为稳定的内参基因。Normfinder软件是基于EXCEL软件计算基因的稳定值M，与geNorm软件相同，M值越小则内参基因稳定性越高。geNorm软件分析表明，GAPDH的M值最高，为1.636，大于界限值1.5，该基因判定为不稳定；18S rRNA与28S rRNA的M值最小，其稳定性相对较好。5个候选内参基因的稳定性排序为18S rRNA>28S rRNA>UBQ>EF1α>GAPDH。(详见表3)
Normfinder软件分析表明，5个候选内参基因的稳定性排序为UBQ>GAPDH>EF1α>18S rRNA>28S rRNA，即28S rRNA的M值最高，稳定性最差；UBQ的稳定性值M最低，稳定性最好。(详见表3)
表3geNorm软件与Normfinder软件候选内参基因稳定性评价
2.3.2BestKeeper分析
BestKeeper软件是通过对比各个候选内参基因的标准差(SD)、变异系数(CV)对候选内参基因的稳定性进行综合分析。稳定性较好的基因一般具有较低的SD值、CV值。结果显示，18S rRNA的SD值、CV值在5个候选内参基因中均为最低，18S rRNA相对其他4个内参基因较为稳定；其次是EF1α，而28S rRNA的指标值则居5个内参基因中最高。稳定性有高到低排序分别为18S rRNA>EF1α>UBQ>GAPDH>28S rRNA。(详见表4)
表4BestKeeper软件分析候选内参基因的稳定性
实施例2
检测目的基因表达量
使用18S rRNA作为内参基因检测目的基因，该目的基因为杉木磷转运蛋白的转录因子ClPHR1。采用实时荧光定量PCR检测在供磷(1.0mmol/L KH2PO4)3天情况下，ClPHR1基因在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达情况，结果表明ClPHR1基因在杉木各组织部位均有表达，但在根中的表达量要远高于茎和叶，在茎中的表达量较低。
表5ClPHR1基因在32号杉木不同组织中的表达分析
组织部位 相对表达量
根 0.023842
茎 0.000181
叶 0.000366
实施例3
使用18S rRNA作为内参基因检测杉木纤维素合成酶基因ClCesA1与ClCesA2在32号杉木家系根、茎、叶中的表达情况，结果表明ClCesA1与ClCesA2基因在杉木各组织部位均有表达，但在茎中的表达量要远高于茎和叶，在叶片中的表达量较低，结果表明ClCesA1与ClCesA2基因主要参与调控杉木茎、根中纤维素的合成，与这两个基因的基本功能相符。
表6 ClCesA1与ClCesA2基因在32号杉木不同组织中的表达分析
组织部位 ClCesA1 ClCesA2
根 0.232233 0.163184
茎 0.626867 0.464569
叶 0.054946 0.065903
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建农林大学
<120> 不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccttct cttctctcct cagatctgcc gcctcctaca cggttgccgc tcctcgccct 60
gactttttct cgtcgccggc gtctgatcat tctaaggtgt tgtcaagtct tggatttagt 120
cgcaacctga agccatcaag attttcttct gggatatctt catctctaca aaatggcaat 180
gcaagaagtg tgcaacccat caaggccacg gctacagaag tgccatctgc agttcgaagg 240
tcaagtagca gtggaaagac aaaggttggg atcaacggtt ttggtcggat tggaaggttg 300
gtcctccgca ttgcaacatc aagggatgat attgaggttg tagcagtgaa tgacccattc 360
attgatgcca agtacatggc ttacatgttg aagtatgatt ctactcatgg aaatttcaag 420
ggaagcatca atgtcattga tgattctact ttggagatca atgggaagaa ggtcaatgtt 480
gtcagcaaga gagatccatc tgagatccca tgggctgatc ttggagctga ttatgttgtt 540
gagtcttccg gtgtattcac caccctgtca aaggctgcat cccatttgaa gggcggtgcc 600
aagaaagtta taatttctgc cccttctgct gacgcaccta tgtttgttgt tggagtaaac 660
gagcacacat accaaccaaa catggatata gtctccaatg caagttgtac caccaattgt 720
cttgcccctc ttgccaaggt ggtgcatgag gaatttggta ttcttgaagg cttgatgaca 780
actgtccacg caactacagc tactcagaaa actgttgatg ggccatcaat gaaggactgg 840
agaggaggtc ggggcgctag tcaaaacatc attcctagct caaccggcgc cgcgaaggct 900
gtaggtaaag ttcttccaga actgaatggg aaacttacgg gaatggcctt ccgtgtacca 960
acatcgaatg tttctgtggt ggatttaact tgtcgacttg agaagggtgc ctcttacgaa 1020
gatgttaagg cagccattaa gcatgcctca gaaggacctc ttaaaggcat tctcgggtac 1080
acagatgaag atgtcgtctc caatgatttc gtcggtgatt caaggtccag tatctttgac 1140
gccaatgctg gtattggatt gagcaagtcc tttgtgaaac ttgtctcttg gtacgacaac 1200
gaatggggtt acagcaaccg agttcttgac cttatagagc acatggcttt ggtagctgcc 1260
agccactaa 1269
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgctctcat atttctcaca ttttcgtagc cgcaagactc ctttcagatt cttacttgca 60
gctatgggta aagagaagtt tcacattaac attgtggtca ttggtcatgt tgattctgga 120
aaatcgacca caactggtca cttgatctat aagcttggtg gtattgacaa gcgtgtcatc 180
gagaggttcg agaaggaggc tgctgagatg aacaagaggt ccttcaagta cgcatgggtg 240
ttggacaaac ttaaggccga gcgtgagcgt ggtattacca tcgatattgc tctatggaag 300
ttcgagacca ccaagtacta ctgcacagtc attgatgccc caggacatcg tgatttcatc 360
aagaacatga ttactggtac ctcccaggct gattgtgctg ttcttatcat tgactccacc 420
actggaggtt ttgaggctgg tatctctaag gatggtcaga cccgtgagca cgctcttctt 480
gctttcaccc ttggtgtcaa gcagatgatt tgctgttgta acaagatgga tgccaccacc 540
cccaaatact ccaaggctag gtacgatgaa atcatcaagg aggtgtcttc atacctgaag 600
aaggtcggat acaaccctga caaaatccca tttgtgccaa tctctggatt cgagggagac 660
aacatgattg agaggtcaac caaccttgac tggtacaagg gaccaactct tcttgaggct 720
cttgaccaga tcaacgagcc caagaggcca tcagacaagc cccttcgtct tccacttcag 780
gatgtctaca agattggtgg tattggaacg gtgccagtgg gacgtgttga gactggtatg 840
atcaagcctg gtatggttgt tacctttgct cccacagggt tgaccactga ggttaagtct 900
gttgagatgc accacgagtc tcttcttgag gcacttcccg gtgacaatgt tggattcaat 960
gtcaagaatt ttgctgtcaa ggatcttaag agaggatacg ttgcctctaa ctccaaggat 1020
gatccagcta agggtgccgc caacttcacc tcccaggtca tcatcatgaa ccaccctggt 1080
cagattggta acggttacgc cccagttctc gattgccaca cctctcacat tgcagtcaag 1140
ttctctgaga tcttgaccaa gattgacagg cgttctggta aggagattga gaaggagccc 1200
aagtttttga agaatggtga cgctggtatg gttaagatga ccccaaccaa gcccatggtt 1260
gttgagactt tctccgagta cccacctttg ggacgtttcg ctgttaggga catgaggcag 1320
accgttgctg ttggtgttat taagagcgtg gacaagaagg acccaactgg agccaaggtc 1380
accaaggctg cagtgaagaa gggtgccaaa tgatgagact ttcgttatga tcgactctct 1440
tatggttttc tttggttctt aaaactttga tggcgtttga gcctttttct tttttctctt 1500
tatttctgtg actttctctc tccctccttt ttggatatct ctgagacttt ttattatggt 1560
tttcaattat gcagtttccg gataattttg cttgaaactt atttaggagt tgtgttacaa 1620
agttgctgtc tttcttgaaa aaaaaaaaaa aaa 1653
<210> 3
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgaggc cgtatgggat taaagtgaac aagagaaagg agagagaaga gaggtatgat 60
aaggaagaag atgaagtaga ggagcaacca aagtttgagc aaaaacaaaa ggcaagagaa 120
agttcgaaga aagctaaaaa agaaagcact tcaagagcag aggaagataa tgacgaggag 180
gaagtaactg tggaagcaac tgcagcagca gaggatattg tgggagggat acctattgtc 240
cttaatgctc ctaacaagga aaagtctggc attgtattcg tgcttgagaa ggcctctctt 300
gaagttgcca aagttggaaa gacttaccag ctactgaact cggatgatca tgctaatttc 360
ttgaaaaaga ataacagaaa tccggctgat taccgaccag acattactca tcaggcgctt 420
cttatgattt tggatagtcc ggttaataaa gctgggaggt tgaaagctgt ttatgttaga 480
acagaaaaag gtgtcctttt tgaagttaag ccacatgttc gtataccaag aactttcaaa 540
cgatttgccg gaatcatgtt gcaactgcta caaaagctga gcattactgc agttaacagc 600
cgtgagaagc ttctacggtg tgtcaagaac cctatcgaag aacatcatct accggttaac 660
tcccacagaa taggcttctc gcatagctct gagaaactcg tcaatatgca gaaacaccta 720
gctactgtat gtgatgatga tagagacaca gtttttgtgg taggcgcaat ggcacacggg 780
aaaatagact gcaactatat cgatgaattt gtgtcggttt cagagtatcc attgagcgca 840
gcctactgta tctcaagaat ctgcgaggca ttagcaacaa attggaatat tatataa 897
<210> 4
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attggagaat caattgtttt atgattatga ggtggattct cagttaataa tgctacatta 60
aaccgatttt attcatttca ttttatttta ccttttatta ttttattttt agtattaatt 120
catttaatat ttttacacag tacaggatca actaatccaa taggattaaa tagtaatata 180
aataagattc cttttaatcc ttattatgtt attaaagatc tacttggatt tattattata 240
ttatttagat taattttaat ttgttttttt aatccttata tactttctga tcca 294
<210> 5
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcagattt ttgtcaagac tttgacaggc aaaaccatca ctttggaggt tgaaagttct 60
gatactattg acaatgttaa ggctaagatc caggataagg aaggaatccc tccggatcag 120
cagaggctta tctttgccgg taagcagctt gaagacggtc gcacactcgc tgattacaac 180
atccaaaagg agtccaccct ccatttggtg cttcgtctca gaggtggtat gcagatattt 240
gtgaagaccc tcactggaaa gacaatcact ttggaggttg agagctcaga caccatcgat 300
aacgtgaagg ctaagattca ggacaaggaa ggtatcccac cagaccaaca gagactcatc 360
ttcgctggga aacagcttga ggatggtcgc acacttgctg acaatatcca gaaggagtct 420
acgcttcacc ttgtgttgcg tcttcgtggt ggtatgcaaa tctttgtgaa aactttgaca 480
ggcaagacca ttaccttgga ggttgagagc tcagacacaa ttgataatgt caaagctaag 540
attcaggata aggaatggat cccaccagac caacagagac tcatctttgc tggtaaacag 600
ctcgaggatg gaaggacttt ggctgattac aacatccaga aagagtctac tcttcacctt 660
gtattgcgtc ttcgtggtgg tatgcaaatc tttgtgaaaa ctttgacagg caagacaatt 720
accttggagg ttgagagctc aggcacaatc gataacgtca aggctaagat acaggacaag 780
gaggggattc caccagacca acagagactc atcttcgctg ggaaacagct cgagggagga 840
ccgggggggg gggggggaca cttccaaaag gcagaagcat tggctttttt ggctgattac 900
aacatccaga aggaatcgac tcttcacttg gttcttcgtc ttcgtggtgg aagcttctga 960
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacctatgt ttgtggttgg agta 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgtcttct gtgtagctgt tgtt 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggcaaggag cttgagaaag aaccca 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accccaacag caacagtctg acgcat 26
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggaacatta tcacggacag catcaac 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcgactaat ggtccagata gactcct 27
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtttgtaga agcgtcctca g 21
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcgccccct tcca 14
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aataaatgct tcaaatgtca ggcta 25
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgagatggtc tggtgatgtc gtgg 24

Claims (10)

1.不同组织中杉木内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计引物，得到特异性扩增候选内参基因的引物；
所述候选内参基因分别是甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因、转录延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素编码基因；
所述甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
2)提取杉木苗的根、茎、叶组织的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA；
3)将所述步骤2)中cDNA为模板，采用所述步骤1)中引物进行qPCR扩增，得到Ct值和相对表达量Q；所述相对表达量Q按照式I计算得到；
Q＝2-△△Ct 式I
4)根据所述步骤3)中相对表达量Q值，采用geNorm和Normfinder软件对所述候选内参基因进行稳定性评价；
5)根据所述步骤3)中Ct值，采用BestKeeper软件对候选内参基因进行稳定性评价；
6)根据geNorm软件、Normfinder软件和BestKeeper软件做出的稳定性评价结果，将所述候选内参基因按照稳定性由强到弱进行排序，选择综合排序至少前两位的候选基因作为杉木的内参基因；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制，所述步骤4)和步骤5)之间没有时间顺序的限制。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中特异性扩增甘油醛三磷酸脱氢酶编码基因的引物具有如序列表中SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示的核苷酸序列；
特异性扩增转录延伸因子的引物具有如序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
特异性扩增18S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
特异性扩增28S rRNA的引物具有如序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；
特异性扩增泛素编码基因的引物具有如序列表中SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中qPCR扩增体系如下：2XqPCR反应液10μl，10X正向引物和10X反向引物各0.4μl，模板cDNA2μl，CXR参考染料液0.2μl和ddH2O 7μl。
4.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，所述3)中qPCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环；95℃30s，60℃30s，逐渐升温到95℃。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤6)中综合排序的方法如下：
geNorm软件和Normfinder软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的稳定性指数M值由小到大进行排序，M值最小的候选内参基因记为5分，第二最小M值的候选内参基因记为4分，第三最小M值的候选内参基因记为3分，第四最小M值的候选内参基因记为2分，M值最大的候选内参基因记为1分；
BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性评价结果中，5个候选内参基因的标准差和/或变异系数由小到大进行排序，标准差和/或变异系数最小的候选内参基因记为5分，第二最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为4分，第三最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为3分，第四最小标准差和/或变异系数的候选内参基因记为2分，标准差和/或变异系数最大的候选内参基因记为1分；
将三个软件得到的每个候选基因的得分相加，根据各候选内参基因的分值加和由大到小进行排序，选择排序前两位的候选内参基因作为杉木的内参基因。
6.18S rRNA和/或泛素编码基因作为杉木不同组织中的内参基因的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述18S rRNA具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；所述泛素编码基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述杉木不同组织包括根、茎和叶组织。
9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述杉木的树龄为一年生小苗。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述内参基因还包括转录延伸因子；所述转录延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
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