CN107227340A - 用于甜瓜果实基因pcr表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法 - Google Patents

用于甜瓜果实基因pcr表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法 Download PDF

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程维舜
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Abstract

本发明公开了一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法，本发明利用甜瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了基因的表达水平和稳定性，从中选择8个表达稳定的基因，同时选用2个在甜瓜中常用的传统内参基因作为对照，比较了10个基因在两个甜瓜品种果实的不同发育时期的表达稳定性，通过使用CmAIN2和CmSPS1基因进行验证，确定MELO3C007745T1基因的表达稳定性最高，是甜瓜果实基因表达实时荧光定量PCR分析的最佳内参基因。

Description

用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的 稳定性验证方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法。
背景技术
基因表达分析是研究基因功能和转录水平调控的重要手段。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)因具有高灵敏性、高特异性、高精确性和成本较低等的特点，被广泛应用于基因表达的定量分析。在qRT-PCR分析中，为了获得目标基因表达水平的真正差异，需要消除不同样本RNA产量、质量以及反转录效率上存在的差异。消除样本间的差异通常情况下是采用内参基因进行校正和标准化，即通过分别测定目的基因以及内参基因的表达量，将内参基因表达量作为一个标准来计算出目的基因的相对表达量，再比较样品间相对表达量的差异。相对定量方法简单、准确、高效，应用十分广泛，但需要选择合适的内参基因。理想的内参基因应该是在所有的样本中均表达稳定，因此，利用qRT-PCR对目标基因进行相对定量的准确性依赖于使用经过系统验证的、表达稳定的内参基因。
甜瓜是葫芦科甜瓜属植物，是一种重要的经济作物。中国甜瓜收获面积和总产量均居世界第一。利用基因表达分析的方法挖掘甜瓜优异基因和调控网络，是进行甜瓜遗传改良的前提。目前在甜瓜基因表达分析中使用的多是传统的内参基因，这些传统内参基因并未经过系统验证，稳定性较差，从而导致甜瓜基因表达分析的准确性较差。
发明内容
本发明的目的是为了提高甜瓜基因表达分析的准确性，从甜瓜果实转录组数据中挖掘出一批表达较稳定的基因，并进一步比较了这些基因在不同果实发育时期中的表达稳定性，最终筛选出适于甜瓜果实基因表达分析的稳定的内参基因。
为实现此目的，本发明所设计的一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，所述内参基因为MELO3C007745T1基因，所述内参基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
上述MELO3C007745T1基因的PCR扩增引物核苷酸序列是：
正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC；
反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA。
一种上述内参基因的稳定性验证方法，其特征在于，它包括以下步骤：
步骤1：在雪里红甜瓜和风味4号甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五个采样时间点，分别选取三个生物学重复的雪里红甜瓜和三个生物学重复的风味4号甜瓜果实，每个生物学重复的雪里红甜瓜选取两株。每个生物学重复的风味4号甜瓜也选取两株，即一共采集30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实；
步骤2：用植物RNA提取试剂分别分离以上30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实的总RNA，每个上述总RNA均需满足A260/A280在1.8～2之间以及A260/A230在1.8～2之间；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的每个cDNA；
步骤3：分析雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据，在雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列：
MELO3C026953T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列见SEQID NO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列见SEQID NO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列见SEQID NO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列见SEQID NO：10，CmRPL和CmRPS15作为候选内参基因；
步骤4：将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80-150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，对每个PCR扩增产物进行凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带；
步骤5：将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，并得到引物的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数；
步骤6：采用geNorm软件分析上述候选内参基因的稳定性，表达最稳定的一对候选内参基因是MELO3C008016T1，MELO3C009005T1，其次是MELO3C007745T1，最不稳定的是CMRPS15；
步骤7：对上述所有候选内参基因在每个样本中的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数用NormFinder软件计算基因表达稳定值M，根据得到的所有基因表达稳定值M的到上述所有候选内参基因的稳定性的排列顺序依次是：MELO3C008016T1﹥MELO3C007745T1﹥MELO3C009005T1﹥MELO3C002234T2﹥MELO3C013938T1﹥MELO3C021785T1﹥MELO3C015496T1﹥CmRPL﹥MELO3C026953T1﹥CmPRS 15；上述样本为步骤1中采集的30株雪里红甜瓜和30株风味4号甜瓜；
步骤8：使用BestKeeper软件计算所有候选内参基因的扩增达到阈值时的循环数的标准差SD和变异系数CV，以及各候选内参基因间的泊松相关系数R，以此来确定候选内参基因的表达稳定性，标准差SD小于1的候选内参基因被认为是稳定表达的基因，标准差SD越小，变异系数CV越小，该候选内参基因越稳定，泊松相关系数R值越大的候选内参基因越稳定；反之，则越不稳定，上述所有候选内参基因中，MELO3C026953T1基因为最稳定的候选内参，其次是MELO3C008016T1、MELO3C002234T2、MELO3C007745T1和MELO3C009005T1；
步骤9：利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件综合分析各候选内参基因的稳定性排序，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件得到的共同的稳定性最好的前四个的候选内参基因依次是MELO3C008016T1、MELO3C009005T1、MELO3C007745T1和MELO3C002234T2，共同的稳定性最差的前两个候选内参基因顺序依次是CmPRS15和CmRPL。
本发明的内参基因具有如下有益效果：
1、表达稳定性高：本发明利用甜瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了基因的表达水平和稳定性，并从中筛选出了合适的内参基因，而传统的内参基因在转录组分析中表达水平和稳定性不高。因此，本发明获得的内参基因的表达稳定性要优于目前使用的传统内参基因。
2、适用范围广：本发明分析了新内参基因在两个不同风味的甜瓜品种果实不同发育时期的表达稳定性，因此，本发明所获得的内参基因具有广泛的适用性。
附图说明
图1为本发明中候选内参基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为本发明中“风味4号”甜瓜果实中CmAIN2基因在不同候选内参基因中的相对表达量；
图3为本发明中“雪里红”甜瓜果实中CmAIN2基因在不同候选内参基因中的相对表达量；
图4为本发明中“风味4号”甜瓜果实中CmSPS1基因在不同候选内参基因中的相对表达量；
图5为本发明中“雪里红”甜瓜果实中CmSPS1基因在不同候选内参基因中的相对表达量。
图1中，1—MELO3C009005T1、2—MELO3C026953T1、3—MELO3C007745T1、4—MELO3C013938T1、5—MELO3C015496T1、6—CMRPL、7—CMRPS15、8—MELO3C021785T1、9—MELO3C002234T2、10—MELO3C008016T1。
图1中，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp表示对应条带的大小。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：
本发明的一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，所述内参基因为MELO3C007745T1基因，所述内参基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
上述MELO3C007745T1基因的PCR扩增引物核苷酸序列是：
正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC(SEQ ID NO：1所示)；
反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA(SEQ ID NO：2所示)。
一种上述内参基因的稳定性验证方法，它包括以下步骤：
步骤1：在雪里红甜瓜和风味4号甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五个采样时间点，分别选取三个生物学重复的雪里红甜瓜和三个生物学重复的风味4号甜瓜果实，每个生物学重复的雪里红甜瓜选取两株。每个生物学重复的风味4号甜瓜也选取两株，即一共采集30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实；
步骤2：用植物RNA提取试剂(植物RNA提取试剂Plant RNA Extraction Kit为TaKaRa)分别分离以上30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实的总RNA，每个上述总RNA均需满足A260/A280在1.8～2之间以及A260/A230在1.8～2之间表明总RNA浓度和质量达标(用Nanodrop2000检测RNA的浓度和质量，A260/A280和A260/A230的比值)；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测(RNA的完整性采用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳图谱28S，18S条带清晰，表明RNA完整性较好)，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的每个cDNA(1uL总RNA采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒首先进行基因组DNA去除，然后进行反转录(两步法：37℃15min；85℃5s)形成20μL第一链cDNA。两个品种不同处理间样本分别进行反转录，每一份材料都进行重复，作为备份，-80℃保存)；
步骤3：分析雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据，在雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列：
MELO3C026953T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列见SEQID NO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列见SEQID NO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列见SEQID NO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列见SEQID NO：10，CmRPL和CmRPS15作为候选内参基因；
其中，CmRPL和CmRPS15为参考文献中报道的序列(Kong,Q.,et al.,Assessmentof Suitable Reference Genes for Quan titative Gene Expression Studies inMelon Fruits.Front Plant Sci,2016.7:p.1178.)；
步骤4：将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，(上述8个候选内参在NCBI网站中进行引物设计，并将每个引物分别于与雪里红甜瓜转录组数据和风味4号甜瓜转录组数据进行blast序列比对)，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80-150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增(常规PCR程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，31个循环，72℃延伸4min)得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，对每个PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带，cDNA条带为清晰的唯一条带表明该引物具有特异性，候选内参基因的引物序列及扩增特征见表1，其扩增特异性检测结果见图1；
步骤5：将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，并得到引物的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数；
步骤6：采用geNorm软件分析上述候选内参基因的稳定性(geNorm软件通过计算某一基因与其他基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价，M值越大，稳定性越差，反之，越稳定)，表达最稳定的一对候选内参基因是MELO3C008016T1，MELO3C009005T1，其次是MELO3C007745T1，最不稳定的是CMRPS15；
步骤7：对上述所有候选内参基因在每个样本中的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数用NormFinder软件计算基因表达稳定值M，由表2可知根据得到的所有基因表达稳定值M的到上述所有候选内参基因的稳定性的排列顺序依次是：MELO3C008016T1﹥MELO3C007745T1﹥MELO3C009005T1﹥MELO3C002234T2﹥MELO3C013938T1﹥MELO3C021785T1﹥MELO3C015496T1﹥CmRPL﹥MELO3C026953T1﹥CmPRS 15；上述样本为步骤1中采集的30株雪里红甜瓜和30株风味4号甜瓜；与geNorm分析结果相似，排在前3位的基因均为MELO3C008016T1，MELO3C007745T1，MELO3C009005T1，最不稳定的基因均为CmPRS15；
步骤8：使用BestKeeper软件计算所有候选内参基因的扩增达到阈值时的循环数的标准差SD和变异系数CV，以及各候选内参基因间的泊松相关系数R，以此来确定候选内参基因的表达稳定性，标准差SD小于1的候选内参基因被认为是稳定表达的基因，标准差SD越小，变异系数CV越小，该候选内参基因越稳定，泊松相关系数R值越大的候选内参基因越稳定；反之，则越不稳定，由表3可知，上述所有候选内参基因中，MELO3C026953T1基因为最稳定的候选内参，其次是MELO3C008016T1、MELO3C002234T2、MELO3C007745T1和MELO3C009005T1；
步骤9：利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件综合分析各候选内参基因的稳定性排序如表4所示，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件得到的共同的稳定性最好的前四个的候选内参基因依次是MELO3C008016T1、MELO3C009005T1、MELO3C007745T1和MELO3C002234T2，共同的稳定性最差的前两个候选内参基因顺序依次是CmPRS15和CmRPL；
步骤10：分析上述所有样本的蔗糖代谢相关的基因CmAIN2和CmSPS基因的表达模式，通过对CmAIN2和CmSPS的表达分析来验证筛选出的内参基因的稳定性；
按照上述步骤2中的方法进行总RNA的分离，第一链cDNA的合成。由筛选软件geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析结果得知，MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，MELO3C007745T1为比较优质的内参基因，CmRPS15是最不稳定的候选内参基因；
在CmAIN2和CmSPS基因的表达中，用CmPRS15作为内参基因时，表达量差异幅度较大，可能导致目标基因的表达量估计不准，利用单独基因MELO3C007745T1，2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合作MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1为内参基因时表达量正常，考虑到2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1更复杂，不利于简化实验操作所以确定单独基因MELO3C007745T1作为筛选得到的最终内参基因。
上述技术方案的步骤1中，试验材料为雪里红和风味4号，果实成熟时雪里红没有酸味，风味4号具有独特的酸甜味。在武汉市黄陂区农业生态园武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所塑料温室内进行栽种。随机区组设计，3次重复。重复内每个品种种植60株。于授粉后15、20、25、30、35天，选取长势相近的植株，采摘果实样品。每个点取三个生物学重复，每个重复取两株。选取长势相近的植株，取内层果肉。切成小块，液氮速冻，-80℃保存。
上述技术方案的步骤5中，qRT-PCR采用TransStartTM Top Green qPCR SuperMix(天根生化科技有限公司)作为荧光染料，试验采用12μL上样体系，包括2μL模板(100ng)，前后引物各2μL(5nmol)，6μL的2×TransStart Top Green qPCR SuperMix。qRT-PCR在Roche480实时荧光定量PCR检测系统中进行，PCR循环如下：
在56℃这一步采集荧光。最终的Cp(Crossing point)值包括了所有样本的生物学重复及技术重复。分析引物标准曲线，计算引物扩增效率(E)。通过混合样品cDNA以5倍的浓度梯度依次稀释5个浓度(450，90，18，3.6和0.72ng/uL)，进行qRT-PCR，运用扩增效率的计算公式E＝(10-1//slope-1)×100进行计算。
上述技术方案的步骤10中，在不同内参基因条件下，“风味4号”和“雪里红”的表达量有一定差别(图2～图5)。在发育初期，“风味4号”中CmAIN2的表达量比较高，从20d开始表达下调；“雪里红”中CmAIN2的表达变化略有差异，但变化趋势与“风味4号”基本一致，初期表达量比较高，在成熟期表达量很低。而CmSPS1基因在“风味4号”和“雪里红”中的表达量变化呈现波动趋势，开始先缓慢上升之后在成熟前至峰值时又开始回落，这与蔗糖积累开始较慢之后开始加快在然后在成熟前又开始减慢的变化趋势大体相同的。
表1候选内参基因的引物序列及qRT-PCR的扩增特征
序列表SEQ ID NO：1是MELO3C007745T1引物的正向引物序列。序列表SEQ ID NO：2是MELO3C007745T1引物的反向引物序列。序列表SEQ ID NO：3是MELO3C007745T1基因的核苷酸序列。
表2用NormFinder计算的候选内参基因的稳定值及排序
稳定性排序 基因名称 稳定值(M)
1 MELO3C008016T1 0.017
2 MELO3C007745T1 0.020
3 MELO3C009005T1 0.022
4 MELO3C002234T2 0.024
5 MELO3C013938T1 0.027
6 MELO3C021785T1 0.035
7 MELO3C015496T1 0.040
8 CmRPL 0.044
9 MELO3C026953T1 0.045
10 CmPRS 15 0.047
表3 Bestkeeper软件分析10个候选内参基因的表达稳定性
表4利用geNorm，NormFinder，BestKeeper综合分析结果
本说明书未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
<110>武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所
<120>用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法
<211>23bp
<212>cDNA
<213>MELO3C007745T1引物的正向引物序列
<400>1
TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC
<210>2
<211>23bp
<212>cDNA
<213>MELO3C007745T1引物的反向引物序列
<400>2
CGATCAATGACGCAACAAGGCA
<210>3
<211>1508bp
<212>cDNA
<213>MELO3C007745T1基因的核苷酸序列
<400>3
CCAAGAAGGCCCAATACTTTGGACGCTGTTAGTTATCCAGTTTAACGGTTACAGTTATAAACTACTAGATCGGATAAAAG
TCGCGCGTAAATCATTGAATTAATCGGGGTTTTCCCCTCCACTTCGAAGTCCAACTCTTTCCCATTCACCGTGTGAAGTC
AAATCTGTCTTCACTTCCATTTTCTATTCTGAAGGATGGACCTATGTCCCCCTTCCCATGTCTGAGTACAAACCCTAGAT
TCTTGAACTGTCTACACTCTAAAACGATGTCGCTTCCTTTCCAATCCCTTTCACTCACTTCACCTTCTTCTTCAACATTG
TGCTTTTCCACCCTTTTTTCTAGAAATCCGAGCGTGTCTCTTGGATTCCCCCCTAGCCGTTTCCCGAACACCCTGCATTT
CCAAATTCTTGATTACAAGTTTCGAAGCCCTTTTAATTTTGGTTCCATCGATGCCCATCAGTTCTGTCCTCGAGTTTCTA
CTTCTGGAGGAGTAGGTCGGATACCCGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTTCGATATCGATTCTTTACTTTCAGCT
GCCGAGTTGTTTTGCCTTGTTGCGTCATTGATCGGTTCTGTTGGTTTTGCTTTGAATTGCGCGAAAACCAGGTCTAAGAG
CGTGTTCTTGGCGGTGTTTGGTGATGGGGTTCTCGTTGGCGCGATTTTATTTCTGGTTGCTGGGGTTGCGATTGGTGCTT
GGATTCGTAGGCGGCAGTGGAATCGAGTTTTTCGAGAGACAGTGAAGGGCGTTTTAGAGGTGAATTTGATGGAAAAGACT
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AATGTGCAATTTAACGAGAAATGAACGTTGCACCAAGAGAAAGTGTAAAGCGGCAGGGGAATTGTAATGGGAGAAATGTA
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CTCCAATTGCTGGCATTTCTTATGTTTCTACGCCAGTGATGGAGGAGGATGAAGTTGTGGATGGTGATTTTTACCTTCTG
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CTTGCGGCTGTATGCTCTTTATCTGGCTGGTGAAAAGCGGAAAGAAGAAGAGGTAGTAGAACTTGAAGGATCATTGGGTA
AAAGCGATGCTGTAAATCAAGAGCTGGTTTCACTGGAAAGGGAATTATCAACCCTTAGAAAAAATGGCATGATTGACCCC
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CAAATGTGCTCTATGCAAAGGAATGCTTCTCTGCATTGAGCTATCTTGCTCATAGAGTTTTCATGACAGATAAGTATAGA
CCTGAATCTTGCTGCATTATTGGAAATTACTACAGTTTGAAGGGGCAGCACGAAAAGTCAGTTGTGTATTTCAGAAGGGC
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CCATTGATGCCTATCGACGGGCTGTAGATATAAACTCATGTGATTATCGAGCTTGGTATGGATTAGGGCAAGCTTATGAA
ATGATGGGCATGCCTTTTTATGCTCTCCATTACTTCAAGAAATCTGTATTTTTGCAGCCAAACGATTCCAGATTGTGGAT
TGCCATGGCTCAGTGTTACGAGAGCGAACAGCTACGCATGCTGGAGGATGCAATCAAGTGTTACAGAAGAGCTGCAAATT
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AGGAAACGGCTAAGAATTTACTGAGGGGAATGAGAATAGCACAGTCTAGCTTTCCATCAATGGATGTTGAGCTCTTCCCT
CCCTAAATTTTCTTCATTGCAACTTCTGATTTTCTAACATCTTTTTCCAATATTTGGAAACAAATACAGGTCGGTCCATA
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CCTTCTTCCCCTTTCTCTAAAAAGTAAAGGTAATACTGCTCTTATTGCTGCTTCTGGCGGTGATATCTATTTGGTAGATA
GTGATTCGAAGAAGATTATTTGGTCTTTTTCTTCTGGAACACCAATTTACTCGTCATATCAGTCTCCTACTAATTATAAT
AAAGAAAATGCTTCTGGTTCAACCCGCAGCCCCTTCTTTTTTGATTGTGGAGATGATTGGGAGCTCTACATCCACACAGA
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TGACTGGTTCAAGGAAAACCACTGTGTATGAGGTTAATCCTGTTACAGGAAAGTTGATTCGCAATCACTCGTCTGAACTC
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CTGGGTCGGAAGAAGTTTCTTGGAGTTTGAATGTTGCTGACATTGGAGCTACCTTAGTCTGTCCAGATGGTGAGAATCCA
ACAAATAGCGTTCCCTTGGATTCTCAAAATAATGGTAGTTTTGAGTTTGATTTTACTCCGCCCTTGTCTTGTCAATCAGA
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CTATGAAGGTCGACTAGTAGCTGTGAAACGTCTTGTTAAGACTCACCATGATGTTGCTTTTAAAGAAGTTCAAAATCTAA
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TGCAGGACCTATGATTGATTACAAATTGCGTTTGGAGTCTCTCAAGAATGTAATATCAGATCTTAATCTATGGAAAAAAA
ATAGCCGTCCATCACCACTTCTTCTAGGACTCATGAGGGATATGGTTGCCGGGCTCGAGCATTTGCATGAGTTGGGGATA
ATTCACAGGGACTTAAAGCCACAAAATGTGTTGATAACTAAGCAAAAATCTGTACGTGCAAAGCTCTCTGACATGGGTAT
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AACAGCTTCTTCATGGACGACAAACACGTGCAATTGATTTGTTTAGCTTGGGTTGTGTCATCTTCTTTTGCCTCACTGGT
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GGACATTTGCGTACGCTTGCTTTCCTTTATGCTAGTAAAGGGATGAGCTCAAAGGCTCTTGCAATTTGGCGTATCTTGGG
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AGTGGTGGAAACTTCAGTGATGCCTTTAGCCCCCCTCCTAAACAACCAACAGGACTTAAACCTCTAGGTGAAGCTTTGGG
TATGCCCCCATCATCTTTTATGCCTAGTGAATCACCGCCTTTGGTCCACACACCGATTAATGGCGGTGGCGGCATGGGAG
ATGACCTCCATGAGGTGGAACTTTAAGTAGTTAACATGTAAATACCAAGTTTTGTTCCTTAGTTGATCTACACAGATACT
TGAATGCAATCGGTCGTGGCTGCAGCTCTCCTGCATAAAAAGGTCAGTCATATGCACCAGAATATAGAGTTCATTAAAGC
AAGTCCTCAGCAAGGATGTGCCCTTTTTGTTCCCTTTTTTTTTTTTTCTCTTGAAATTTCTTTGTTCCCAACCCTTGAAG
TTTGTGAACACAAATATAGTCGACAATCTTTGTATGTTTATGCTTAGATGTCAGTTCTCACTTTATTCTCCTAGGAGTTT
CCAAACGTATGATACTTCTGGAGCTGGTATTTTACATTAAAAAGCAAAGACAAGAAGGCCTTTGTTGGCACATCATTGTA
CAGTTCATTTGTTTATTTTTTTTCTCCCCTATTTTTCAGAAACTAGAAAAATTGGCCCTCAAGGTGCTTCAAATTGAACA
TCATCAAGATGGAAAAATGTATTGAATT

Claims (4)

1.一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，其特征在于：所述内参基因为MELO3C007745T1基因，所述内参基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，其特征在于：所述MELO3C007745T1基因的PCR扩增引物核苷酸序列是：
正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC；
反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA。
3.一种权利要求1所述内参基因的稳定性验证方法，其特征在于，它包括以下步骤：
步骤1：在雪里红甜瓜和风味4号甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五个采样时间点，分别选取三个生物学重复的雪里红甜瓜和三个生物学重复的风味4号甜瓜果实，每个生物学重复的雪里红甜瓜选取两株，每个生物学重复的风味4号甜瓜也选取两株，即一共采集30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实；
步骤2：用植物RNA提取试剂分别分离以上30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实的总RNA，每个上述总RNA均需满足A260/A280在1.8～2之间以及A260/A230在1.8～2之间；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的每个cDNA；
步骤3：分析雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据，在雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列：
MELO3C026953T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列见SEQ IDNO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列见SEQ IDNO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列见SEQ IDNO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列见SEQ IDNO：10，CmRPL和CmRPS15作为候选内参基因；
步骤4：将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80-150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，对每个PCR扩增产物进行凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带；
步骤5：将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，并得到引物的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数；
步骤6：采用geNorm软件分析上述候选内参基因的稳定性，表达最稳定的一对候选内参基因是MELO3C008016T1，MELO3C009005T1，其次是MELO3C007745T1，最不稳定的是CMRPS15；
步骤7：对上述所有候选内参基因在每个样本中的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数用NormFinder软件计算基因表达稳定值M，根据得到的所有基因表达稳定值M的到上述所有候选内参基因的稳定性的排列顺序依次是：MELO3C008016T1﹥MELO3C007745T1﹥MELO3C009005T1﹥MELO3C002234T2﹥MELO3C013938T1﹥MELO3C021785T1﹥MELO3C015496T1﹥CmRPL﹥MELO3C026953T1﹥CmPRS 15；上述样本为步骤1中采集的30株雪里红甜瓜和30株风味4号甜瓜；
步骤8：使用BestKeeper软件计算所有候选内参基因的扩增达到阈值时的循环数的标准差SD和变异系数CV，以及各候选内参基因间的泊松相关系数R，以此来确定候选内参基因的表达稳定性，标准差SD小于1的候选内参基因被认为是稳定表达的基因，标准差SD越小，变异系数CV越小，该候选内参基因越稳定，泊松相关系数R值越大的候选内参基因越稳定；反之，则越不稳定，上述所有候选内参基因中，MELO3C026953T1基因为最稳定的候选内参，其次是MELO3C008016T1、MELO3C002234T2、MELO3C007745T1和MELO3C009005T1；
步骤9：利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件综合分析各候选内参基因的稳定性排序，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件得到的共同的稳定性最好的前四个的候选内参基因依次是MELO3C008016T1、MELO3C009005T1、MELO3C007745T1和MELO3C002234T2，共同的稳定性最差的前两个候选内参基因顺序依次是CmPRS15和CmRPL。
4.根据权利要求3所述的内参基因的稳定性验证方法，其特征在于：所述步骤9后还包括步骤10，步骤10：分析上述所有样本的蔗糖代谢相关的基因CmAIN2和CmSPS基因的表达模式，通过对CmAIN2和CmSPS的表达分析来验证筛选出的内参基因的稳定性；
在CmAIN2和CmSPS基因的表达中，用CmPRS15作为内参基因时，表达量差异幅度较大，可能导致目标基因的表达量估计不准，利用单独基因MELO3C007745T1，2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合作MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1为内参基因时表达量正常，考虑到2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1更复杂，不利于简化实验操作，所以确定单独基因MELO3C007745T1作为筛选得到的最终内参基因。
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