CN110408722B

CN110408722B - 用于桑葚物种鉴定的特异性dna区段和引物

Info

Publication number: CN110408722B
Application number: CN201910760641.XA
Authority: CN
Inventors: 桑亚新; 檀建新; 刘紫薇; 兰青阔; 王永; 贾欣月; 刘双; 沈晓玲
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110408722A

Abstract

本发明公开了一种用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段和引物。所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述PCR引物为SS05‑F、SS05‑R，荧光定量PCR和数字PCR引物和探针分别为SS05‑QF，SS05‑QR，SS05‑QP，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明利用了定性PCR技术、实时荧光PCR技术以及数字PCR技术，建立一套桑葚物种特异性定性及定量的检测方法，并针对桑葚纯果汁及桑葚果汁掺杂其他水果的源性成分的情况，建立了桑葚成分较为精准的定性和定量的检测方法。

Description

用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段和引物

技术领域

本发明涉及分子生物学物种鉴定技术领域，具体涉及一种用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段和引物。

背景技术

随着近年来常见水果品种的普及，人们越来越喜爱如桑葚、树莓、车厘子等第三代水果。由于三代水果口感好，营养丰盛，富含具备保健功能的营养因子，所以，无论鲜食还是用于食品或保健品的开发，价格都相当昂贵。因此，其产品常会出现以假乱真、以次充好的现象，如某些桑葚加工品中不含桑葚，用廉价水果加香精来达到以假乱真的效果，这不单单欺骗了消费者，也极大地扰乱了市场秩序。

当前国内外的关于掺假现象的鉴定方法主要分为感官鉴别法、常规理化法和新型理化检测技术。

(1)感官鉴别法

判官食品的真伪主要根据食品的外观、气味、风味和质地来进行判断的。传统的感官鉴别法主要依靠鉴别师的感官判断能力和实际经验，因此，这种感官判断不够客观，而且随着科技的进步，在加入某种物质后也可能会出现以假乱真的情况，所以人们根据这种情况研发了色度仪、质构仪等仪器设备更加客观有效的进行判断。

(2)常规理化法

常规理化法是主要用于检测和分析一些特征性的化合物物质，然后对对食品的质量和品质进行评估。例如糖类鉴别法、有机酸鉴别、酚类物质鉴定、酮类物质鉴定、果胶物质鉴别还有一些无机类物质的鉴定等，这些都是根据化学反应现象对食品中的物种进行鉴定检测，但是当食品中添加同种化合物时，也会产生相同的化学反应，例如在检测牛奶中蛋白含量时，往牛奶中加入含氮化合物也会造成氮含量升高，所以该检测方法存在一定弊端。

(3)新型理化检测技术

新型的理化检测技术主要包括质谱技术和色谱技术，色谱技术又包括高效液相色谱技术和气相色谱，质谱技术又包括稳定性同位素质谱法、MALDI-TOFMS法、热裂解质谱法。但是，这种方法检测设备昂贵，检测分析周期长，不适合大规模推广应用。

目前对于桑葚的物种特异性研究未见报道，国内外研究较少。所以利用分子生物学方法对桑葚物种特异性方面的研究还存在许多问题：(1)桑葚特异性序列经文献查阅未见报道，所以特异性序列需要自己查找。(2)利用分子生物学鉴别果汁的定性及定量研究方法较少。(3)水果DNA中含有大量多酚类物质及糖类，所以提取水果DNA的难度较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段和引物。

用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段，所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

用于桑葚物种特异性鉴定的PCR引物，所述引物为SS05-F、SS05-R，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

用于桑葚物种鉴定的荧光定量PCR和数字PCR的引物和探针，所述引物为SS05-QF、SS05-QR，探针为SS05-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

一种定性鉴定桑葚物种的试剂盒，包含上述引物SS05-F、SS05-R。

一种定量鉴定桑葚物种的试剂盒，包含上述引物SS05-QF、SS05-QR和探针SS05-QP。

本发明的有益效果：本发明用生物信息学分析的方法从下载的60套植物基因组中，经过多轮筛选得到鉴定桑葚的特异性DNA区段SS05，并根据此段序列设计了普通PCR引物SS05-F/R和一套实时荧光、数字PCR的引物和探针SS05-QF/QR/QP。本发明建立了桑葚物种特异性定性和定量检测方法，经试验检测桑葚物种特异性普通PCR的灵敏度可达0.05％，且重复性高。并对桑葚汁和橙汁混合果汁样品进行检测，样品中的桑葚成分均能检出。桑葚定性PCR和实时荧光PCR检测法、数字PCR检测法都具有良好的特异性，后两种方法灵敏度更高，可以满足对桑葚果汁中目标物种的定性检测需要，可以用来鉴别相关桑葚食品成分及鉴定食品标签的真假。

附图说明

图1为本发明研究的技术路线。

图2为21种高等植物内源基因tRNALue PCR扩增结果；

其中M:DL2000bp Marker，CK：空白对照，1-21分别为：桑葚、苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨和猕猴桃。

图3为普通PCR鉴定法引物SS05-F/R特异性测试结果。

图中，M:DL2000bp Marker；CK:空白对照；1桑葚；2苹果；3车厘子；4杏；5李子；6梨；7网纹甜瓜；8牛油果；9榴莲；10西瓜；11西柚；12柑橘；13橙子；14百香果；15草莓；16蔓越莓；17桃；18火龙果；19龙眼；20凤梨；21猕猴桃。

图4为普通PCR鉴定法灵敏度测试结果。

其中M：DL2000bp Marker；CK:空白对照；1：100％；2：10％；3：5％；4：1％；5：0.5％；6：0.1％；7：0.05％；8：0.01％。

图5为普通PCR对桑葚橙子混合果汁检测；

图中，M：DL2000bp Marker；CK:空白对照；阳：桑葚；S1-S6：桑葚汁与橙汁鲜榨混合果汁样品；S1’-S6’：桑葚橙子巴氏杀菌果汁样品。

图6为实时荧光PCR鉴定法的引物、探针SS05-F/R/Q对桑葚物种特异性检测结果。

图7为实时荧光PCR鉴定法灵敏度的测试结果。

图8为实时荧光PCR鉴定法桑葚DNA的量与Ct值之间的相关性。

图9为桑葚橙子混合果汁实时荧光PCR法的检测结果。

图10为数字PCR鉴定法的引物、探针SS05-F/R/Q对桑葚物种特异性检测结果。

图11为数字PCR鉴定法的桑葚模板DNA量与拷贝数之间的关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。附图1为本发明实验的技术路线图。

实施例1桑葚物种鉴定的定性PCR方法的建立

生物信息学分析

在NCBI数据库中下载桑葚、车厘子、杏、苹果、桃、梨、草莓、猕猴桃、菠萝、榴莲、西瓜、葡萄、粉蕉、甜瓜、枣、石榴、番木瓜、油橄榄、啤酒花、柑橘、甜橙、柚子、香楙、橘子、宜昌橙、葡萄柚、蔓越莓、西番莲、海枣、牛油果、拟南芥31种物种共60套基因组，利用Perl语言程序将每套基因组序列都拆分成100bp的小片段。将拆分好的桑葚基因组与其余59套植物基因组进行BLAST序列比较，运用编写的Perl语言程序，筛选出桑葚特有的单拷贝序列。最终筛选到250bp长的桑葚特异性区段(如SEQ ID NO：1)。

基因组DNA提取和质量验证

利用高效植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取水果样品DNA，用微量紫外可见分光光度(NanoDrop ND-1000)测量提取的桑葚、苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨、猕猴桃样品及果汁样品的DNA浓度和纯度。

采用高等植物内源tRNALue引物(表1)对所提取的样品DNA进行质量验证。反应程序为：94℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min；最后4℃保存。PCR反应体系见表2。

表1 tRNALue的引物

表2 tRNALue PCR反应体系

以tRNALue植物内源引物对21种水果进行PCR扩增。凝胶电泳结果如图2所示，桑葚、苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨和猕猴桃这21种水果均扩增出180bp的目的条带，说明所提取水果基因组为植物基因组，且质量可满足后续试验。

桑葚引物特异性验证：

根据SS05序列，设计引物SS05-F/R，分别用上述21种水果的25ng/μL DNA模板进行PCR扩增。用2％琼脂糖凝胶分离PCR反应产物，通过凝胶成像仪观察PCR反应结果。

由图3可知，引物SS05-F/R只在桑葚样品扩增时出现目的片段，用其他水果基因组进扩增均未出现扩增条带，且目的序列条带亮度高，说明引物对SS05-F/R特异性强，扩增效果好。

桑葚PCR扩增体系和反应程序优化：

调整优化PCR反应程序，使其在50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃的退火温度下，分别对浓度为0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8μmol/L，1.0μmol/L的引物进行PCR扩增，加入桑葚DNA(25ng/μL)模板。采用2％琼脂糖凝胶分离PCR反应产物，通过凝胶成像仪观察PCR反应结果。

结果显示，其扩增条带呈现出不同的亮度，当Tm值为56℃，引物浓度0.6μmol/L时，扩增目的条带整体都比较亮，此时扩增效果最好。

PCR最佳反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μL，SS05-F/R(10μmol/L)各1.5μL，DNA模板(25ng/μL)2μL，ddH₂O 7.5μL，总体积25μL。PCR最佳反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸7min；最后4℃保存。

PCR鉴定法灵敏度测试：

利用优化后的PCR程序对不同浓度的桑葚模板进行扩增，将桑葚DNA模板(25ng/μL)用鲑鱼精DNA稀释至桑葚模板含量的100％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0.01％。采用2％琼脂糖凝胶分离PCR产物，通过凝胶成像仪观察PCR结果。

结果如图4显示，当桑葚DNA质量分数为0.05％及以上时，均能特异性的扩增出241bp的目的片段；当桑葚质量分数为0.05％以下时，PCR反应的扩增效率明显降低。所以该方法的检测桑葚物种的灵敏度为0.05％。

混合果汁中桑葚成分的检测：

将橙汁和桑葚果汁配制成混合果汁，将这种混合果汁样品进行PCR检测。

样品制备：分别准备两种桑葚汁与橙汁配制的混合果汁样品。一种是桑葚橙子混合鲜榨果汁，另一种是桑葚橙子混合巴氏杀菌果汁。其中巴氏杀菌果汁就是将压榨好的果汁在85℃下加热3min进行巴氏灭菌。两种方法加工的果汁分别准备6种样品，桑葚源性成分含量100％(S1：100％桑葚汁)，桑葚源性成分含量90％(S2：90％桑葚汁+10％橙汁)，桑葚源性成分含量80％(S3：80％桑葚汁％+20％橙汁)，桑葚源性成分含量70％(S4：70％桑葚汁％+30％橙汁)，桑葚源性成分含量60％(S5：60％桑葚汁％+40％橙汁)，桑葚源性成分含量50％(S6：50％桑葚汁％+50％橙汁)；再准备6份跟以上相同的桑葚橙子混合果汁样品进行巴氏杀菌(样品名称：S1’、S2’、S3’、S4’、S5’、S6’)。以SS05-F/R对制备的桑葚桃苹果混合果汁的6种样品进行定性PCR检测。

结果显示(如图5)，对于6种桑葚含量分别为100％、90％、80％、70％、60％、50％的桑葚橙子混合果汁和6种桑葚含量分别为100％、90％、80％、70％、60％、50％的桑葚橙子巴氏杀菌混合果汁在SS05-F/R的优化后体系进行扩增，结果均能扩增出桑葚特异性目的序列条带，从图5中也发现，未经巴氏杀菌的混合果汁的目的序列条带要明显比巴氏杀菌后的混合果汁亮，这是因为DNA经加热后会受到损伤，所以影响了果汁DNA的提取效率。

实施例2桑葚物种鉴定的实时荧光定量PCR方法的建立

实时荧光定量PCR引物、探针设计：

根据实施例1中结果，选择SS05-F/R扩增后得到的测序拼接序列进行实时荧光引物和探针的设计，利用软件primer express 3.0，设计桑葚种特异性实时荧光的引物与探针(如表3)，探针的3’端用TAMRA进行标记，探针的5’端用FAM进行标记。

表3实时荧光PCR引物和探针

实时荧光PCR法的特异性测试：

以桑葚、苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨、猕猴桃这21种水果的25ng/μL DNA为模板，分别对设计的SS05-QF/QR/QP进行物种特异性验证，每种样品2个平行。

桑葚的物种特异性实时荧光PCR的检测结果显示(如图6)，桑葚特异性引物只对桑葚的DNA模板才有荧光信号，扩增出S型曲线，且Ct值在20左右，说明扩增效率高；苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨和猕猴桃样品均没有荧光信号，证明该PCR扩增体系具有良好的特异性。

实时荧光PCR扩增体系的优化：

在不同的引物和探针浓度组合中，每个平台期信号强度都有所不同，随着引物和探针浓度的增加，扩增效率越来越强。结果显示，引物和探针浓度均在0.4μmol/L时，扩增曲线平稳且扩增曲线峰值居中，所以此时引物、探针浓度为最佳。

实时荧光PCR最佳反应体系为：2×Premix Ex Taq 10μL，SS05-QF/R/P(10μmol/L)各0.8μL，DNA模板(25ng/μL)2μL，50×ROX 0.4μL，ddH₂O 5.2μL，总体积20μL。最佳反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃延伸60s，40个循环，在第二阶段60℃时收集荧光信号。

实时荧光PCR灵敏度测试：

利用优化后的PCR反应程序对不同浓度的桑葚模板进行扩增，将桑葚基因组DNA(10ng/μL)用鲑鱼精DNA进行梯度稀释，分别稀释至桑葚模板浓度含量的100％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0.01％，每个样品设置3个平行进行实时荧光PCR扩增。

结果表明(如图7)，桑葚DNA百分含量为0.01％的Ct值平均值为34.07，在35个循环之前，故均可判定为阳性；当桑葚质量分数为0.01％以下时，扩增曲线Ct值即为35个循环之后。因此确定本方法检测桑葚物种的灵敏度为0.01％。

实时荧光PCR标准曲线的绘制

将桑葚样品用鲑鱼精DNA进行梯度稀释，标准溶液中桑葚成分的浓度分别为30ng/μL、6ng/μL、3ng/μL、0.6ng/μL、0.3ng/μL、0.06ng/μL、0.03ng/μL和0.006ng/μL的桑葚DNA样品，进行实时荧光PCR扩增，根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板浓度的对数绘制标准曲线。

不同浓度的桑葚DNA实施荧光PCR扩增后，建立Ct值与桑葚DNA含量之间的标准曲线。如图8结果显示，桑葚DNA扩增的标准曲线的方程为：y＝-3.529x+127.18，斜率为-3.529在可接受的范围之内(-3.1≥斜率≥-3.6)；R²＝0.995，R²＞0.980；扩增效率E％为92.032％，扩增效率在90％～105％之间，反应的RSD小于25％，表明方法精确度高。

桑葚混合果汁样品测试：

按以上优化好的程序用SS05-QF/QR/QP引物探针对实施例1中制备的桑葚橙子混合鲜榨果汁样品进行实时荧光定量检测。

对6份桑葚橙子混合果汁样品进行检测，结果显示(如图9)，6份样品均能均能扩增出S曲线。当桑葚成分含量为50％时扩增效率明显降低。

实施例3桑葚物种鉴定的数字PCR检测方法的建立

按照表4的PCR反应体系和反应程序以桑葚、苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨、猕猴桃这21种水果的25ng/μL DNA为模板进行桑葚物种特异性验证。

表4数字PCR反应体系和反应程序

结果显示(图10)，空白对照未出现荧光信号，说明体系未收到污染；只有桑葚样品检测出了荧光信号，说明桑葚的引物和探针特异性良好。苹果、车厘子、杏、李子、梨、网纹甜瓜、牛油果、榴莲、西瓜、西柚、柑橘、橙子、百香果、草莓、蔓越莓、桃、火龙果、龙眼、凤梨、猕猴桃均未检测到荧光信号，且总微滴数均大于10000，试验证明所采用的数字PCR检测方法对桑葚DNA具有极高地特异性。

引物、探针浓度和退火温度的的优化：

以0.75ng/μL的桑葚样品基因组DNA为模板浓度，设置4个引物和探针浓度，进行正交试验，共16种组合，进行数字PCR试验，以筛选出最适宜引物和探针浓度。

微滴数大于10000结果有效，正交形成16个浓度组合，根据阴性和阳性微滴的分离程度，以及微滴的集中程度，最终选择最佳引物浓度为0.4μmol/L，最佳探针浓度为0.4μmol/L。

以0.75ng/μL的桑葚DNA样品为模板浓度，体系中使用上一步优化得到的引物和探针浓度。设置8个温度梯度(64℃、63.5℃、62.3℃、60.4℃、57.9℃、56℃、54.7℃、54℃)，进行数字PCR试验，以筛选出扩增反应的最佳的退火温度。

结果表明随温度升高，阳性微滴和阴性微滴的分离越显著，在57.9℃后趋向于平缓，温度升至57.9℃后进行观察，发现温度升高对反应产生的影响无显著变化，所以选择57.9℃为最适宜温度。

桑葚源性成份定量方法测试：

将6ng/μL桑葚(100％质量百分含量)基因组DNA稀释成6ng/μL、3ng/μL、0.6ng/μL、0.3ng/μL、0.06ng/μL、0.03ng/μL、0.006ng/μL、0.003ng/μL共8个浓度梯度。以稀释后的各浓度的DNA为模板进行各三个平行试验，试验结束后计算PCR扩增的拷贝数浓度值的标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)，以RSD小于25％的模板DNA浓度及其相对应的平均拷贝数浓度计算两者的线性关系和系数。

以不同浓度的桑葚DNA为模板，在进行了数字PCR反应的三个平行试验后，用所得数据计算其平均拷贝数、SD和RSD，结果显示(如表5)，RSD小于25％，在可接受的范围内。以桑葚模板DNA量作为横坐标，目标序列平均拷贝数浓度作为纵坐标，根据表5中的数据制作标准曲线，并得出曲线方程(图11)。

表5桑葚数字PCR定量方法的线性范围测定结果

在6至0.003ng/μL DNA量的区间，桑葚特异性序列拷贝数和模板DNA量显示出正相关性，曲线方程为y＝192.77x-13.003，R²＝0.998。综上所述，试验证明桑葚建立的数字PCR检测方法定量范围广，定量精度高，结果重复性好。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 用于桑葚物种鉴定的特异性DNA区段和引物

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 桑(Morus alba L.)

<400> 1

actctgtagg tttggcttta cctcctgtga acttctatgc gattgcttca cgctatcttc 60

gggagttatc tattcctttg gaaaagattc ttcctcatgc acgccgaatg tatgagtggt 120

caatgcctcc agatttatgg ttgtcaacaa atgaactgag gcttcctact cgtgtttgtg 180

taatgtcaat gctgattgtt gcaataagaa ttctatacaa cattcatggt tttggagaat 240

gggagaagag 250

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtttggcttt acctcctg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcttctccc attctcca 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctatgcgatt gcttcacgct at 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctggaggc attgaccact ca 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaagattct tcctcatgca cgccga 26

Claims

1.用于桑葚物种鉴定的荧光定量PCR和数字PCR的引物和探针在制备定量鉴定桑葚物种的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物为SS05-QF、SS05-QR，探针为SS05-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5 和SEQ ID NO：6所示。