CN104293778B - 兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒 - Google Patents
兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒。基于建兰转录组信息开发SSR引物，对这些标记进行了通用性和多态性分析，得到了49个兰属多态性标记，这些标记多态性高、重复性好，非常适用于兰属植物的遗传学研究。另外，根据标记在兰属物种中的分辨能力构建了核心指纹标记库。获得的SSR指纹标记库不但标记稳定可靠，而且具有数量较少、物种分辨能力强的特点，能最大限度反映兰属物种间差异（不是种内差异）且便于统计，可用于兰属主要物种的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传领域，涉及利用建兰的基因内部SSR的制备和生物统计的方法开发一个数量少、分辨率高的兰属主要物种指纹标记库。
技术背景
中国兰花通称国兰，属兰科(Oehidaeeae)兰属(Cymbidium)，主要包括春兰、蕙兰、寒兰、建兰和墨兰等。由于其具有很高的观赏价值和经济价值，所以目前国兰爱好者往往通过属内种间和甚至属间杂交，以便创造出更多的种质资源(所谓的科技草)，但同时也造成了兰属物种界限的模糊，在没有开花的时候，很难区分这些物种，这就给国兰的收藏爱好者造成了一定的困扰，而一个没有标准的行业和市场是不健康的。
而分子标记是一种鉴定物种的高效并稳定的方法。微卫星标记(microsatellite,SSR)共显性、重复性好，操作简单和易检测，是目前主流的分子标记之一。
目前，兰属植物的基因组比较大且整体信息未明，如果将基因组的SSR位点对供试种质一一进行分析鉴定，需耗费大量的人力和物力，是不现实的。因此，迫切需要一个数量少而精的指纹库。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种兰属微卫星标记的建立方法、兰属植物核心指纹标记库与试剂盒。
在于从建兰转录组中开发适用于整个兰属植物的SSR标记，以用于后续兰属植物的遗传多样性、亲缘性以及遗传作图等多方面的研究，并从中筛选出若干高物种区分度的SSR标记构建兰属植物的指纹标记库。
一种兰属微卫星标记的建立方法，步骤是：
1)、建兰转录组序列的获得:
选取建兰的花苞，提取总RNA，得到转录组序列片段(Reads)，去除干扰信息后，完成序列拼接，获得建兰的转录组非冗余序列(Unigene)；
2)、建兰转录组非冗余序列中微卫星标记(SSR)位点的鉴定:
采用SSR检索软件对Unigene进行SSR位点查找，从而获得一系列SSR位点，同时，分析Unigene的开放阅读框，然后根据这些开放阅读框来进一步确认SSR的位置；
3)、建兰SSR引物的设计:
选取进化选择压力小的SSR位点，进行引物设计，从而获得一系列SSR引物；
4)、建兰SSR引物的扩增与筛选:
利用步骤3)得到的建兰SSR引物对多个建兰品种的基因组进行PCR扩增；供试样的基因组采取CTAB法进行提取，然后PCR扩增，最后制备聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，恒压电泳直至指示剂到达底部，对凝胶进行银染显影，并用扫描仪器进行拍照、记录结果，最后用DNA ladder估算扩增产物的分子量；
5)建兰SSR引物通用性检测：
检验建兰中成功扩增的SSR引物的转移性(通用性)，以其他兰属植物的基因组为模板，检测所述引物在其他兰属植物中的扩增情况，根据扩增结果，筛选多态的SSR引物。
所述的步骤1)以及步骤2)采用Trinity进行序列拼接和开发阅读框分析，步骤2)中采用MSATCOMMANDER进行SSR检索。
步骤3)中所述的进化选择压力小的SSR位点是指位于非开放阅读框区的SSR位点，或者在开放阅读框的三和六核苷酸SSR位点。
步骤3)中，所述的引物设计挑选在非开放阅读框区的SSR位点，或者在开放阅读框的三和六核苷酸SSR位点，同时挑选重复基元多的SSR，采用引物设计软件Primer3.0进行引物设计。
进一步，根据步骤5)所述的多态的SSR引物和现有物种信息，模拟出兰属多个物种的群体，设定最小个体准确归入率(min％Assign to population)和分配严谨度(Assignment stringency LOD)的基础上计算每个标记分辨分数(score或％RelativeScore)，即在兰属中各个物种间的分辨能力，然后进行最优组合，建立兰属植物核心指纹标记库。
所述的兰属植物分子标记包含SSR01-SSR49共49对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQ ID NO:01-SEQ ID NO:98所示。
一种兰属植物核心指纹标记库，它包含SSR02、SSR07、SSR08、SSR32和SSR49共5对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQ ID NO:03-SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:13-SEQID NO:14、SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:97-SEQID NO:98所示，用于兰属植物的物种区分。
一种兰属植物鉴定的试剂盒，它包括扩增或测序的引物试剂，所述的引物试剂至少包括SSR02、SSR07、SSR08、SSR32、SSR49共5对标记，每对标记包括2个引物序列，分别如SEQ ID NO:03-SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63-SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:97-SEQ ID NO:98所示。
所述的引物包括进行标记修饰、突变或者添附后的引物。
本发明的有益效果：
第一、信息量大。该标记的多态性不仅仅代表着标记等位基因的多态，还意味着所在基因表达或编码的多样性。
第二、通用性好。由于转录本保守性较高，故具有较好的通用性。以此开发的分子标记适用于兰属植物的遗传多样性、亲缘性以及遗传作图等多方面的研究。
第三、建立一个兰属植物核心指纹标记库，其包括两方面内容：第一、指纹库标记集合种间分辨率的保证；第二、指纹库标记数量的控制。因为高物种区分度的分子标记数量影响着兰属物种鉴定的精确性，而数量少的指纹库标记能有效提高检测效率。
附图说明
图1是标记SSR32对48兰属材料进行PCR扩增后电泳图的结果。其中1-48为表1中的供试材料，M为DNA ladder。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
实施例1兰属SSR标记的制备及筛选方法
本实施例为兰属SSR标记的制备及筛选方法，主要包括以下步骤:
1、建兰基因表达序列的获得:
选取建兰的花苞提取总RNA，采用标准的Solexa测序方法，获得转录组Reads，去除低质量、载体和非编码序列(例如rRNA、tRNA和miRNA)，利用Trinity拼接软件完成序列拼接，最终获得101423建兰的非冗余Unigene序列。
2、建兰转录组序列中SSR位点的检索:
利用MSATCOMMANDER分析SSR的发生频率。最小的重复基元数分别设置为单核苷酸10次、双核苷酸6次、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸分别为4次，一共发现了7936个SSRs。Trinity用于分析拼接以后的Unigene的开发阅读框(ORF)，然后根据这些开发阅读框来确认SSR的位置。
3、建兰SSR位点的筛选和引物设计:
根据SSR的位置和重复基元数的数量，对含有SSR位点进行选择，挑选那些在编码区的三和六核苷酸重复，在非编码区选择二、四和五核苷酸重复，同时尽可能选择重复基元多的SSR，另外结合SSR侧翼区域序列，应用Primer3.0软件进行引物设计，引物设计的主要参数包括:GC含量45-65％,Tm值50-65℃，引物长度18–25bp，预期扩增产物长度100bp以上，由此随机选取80对引物进行合成。
4、建兰基因组提取以及SSR的扩增与筛选:
选取12个建兰品种用于检测建兰SSR引物的扩增性。每份材料选取幼嫩叶片约50-100mg置于2.0ml离心管中，并置入直径为0.5cm的钢珠，液氮迅速冻后，在匀浆仪上震荡35s，使组织研磨至粉末状，采用CTAB法抽提基因组。利用Nanodrop检验控制DNA质量，然后稀释至工作浓度为20ug/L。
本实例中，对各材料基因组DNA进行PCR扩增时，采用下述扩增体系：20u1扩增体系中含有：l0u1 2×Taq PCR MasterMix(硕盟生物)，0.5ul的10nmol/L引物(上海英骏)，50ng基因组模板DNA。在Eppendorf热循环仪上(Germany)进行扩增，PCR扩增程序为:
a,94℃预变性4min；
b,94℃变性30s，因引物的具体退火温度退火30s，72℃延伸45s；
c,72℃延伸6min；
d,l6℃保温
PCR扩增反应完成后，加入4u1的6×loading buffer到PCR产物中混匀，8％聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳参数为恒压100v，直至溴酚蓝指示剂至电泳池末端，凝胶采用银染方法显色，利用扫描仪记录结果。依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增61对SSR引物。并用100bp间隔的DNA ladder估算扩增产物的分子量。结果如图1所示。
实施例2:兰属标记的通用性检验
1、实验材料:
选取兰属五个种(春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰)共48份材料，用于检测建兰SSR标记在兰属植物中通用性，具体材料信息，详见表1。
表1本发明中用于进行引物筛选及遗传分析的48份供试材料信息
2、基因组提取以及SSR引物扩增和筛选
每份材料选取幼嫩叶片约200mg置于2.0ml离心管中，并放入直径为0.5cm的钢珠，液氮迅速冷冻后，在匀浆仪上震荡35s，使组织研磨至粉末状，基因组采取CTAB法进行提取。在DYCZ-30型电泳槽(北京六一仪器厂)中制备8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，在100V恒压下电泳直至指示剂到达底部，对凝胶银染法显影，并用扫描仪器进行拍照、记录结果。
利用实施例1中筛选的SSR引物，扩增兰属植物。采用扩增体系如下:20u1扩增体系中含有:l0u1 2×Taq PCR MasterMix，0.5ul的10nmol/L引物，50ng基因组模板DNA。在Eppendorf热循环仪上(Germany)进行扩增，PCR扩增程序为:
a,94℃预变性4min；
b,94℃变性30s,因引物的具体退火温度退火30s,72℃延伸45s；
c,72℃延伸6min；
d,l6℃保温
PCR扩增反应完成后，加入4u1的6Xloading buffer到PCR产物中混匀，8％聚丙烯酞胺凝胶检测，电泳参数为恒压100v，直至溴酚蓝指示剂至电泳池末端，对电泳胶采用银染方法显色，利用扫描仪记录结果(图1)。
实施例3:兰属核心标记库的建立
1.SSR引物扩增结果统计及多态性分析
根据实施例2中的步骤(2)电泳结果，不同基因型标记为1、2、3等，然后将其输入Powermarker统计这些标记的多态性。在61对引物中49对存在多态性(49个标记见表2)，在48份供试材料中共检测到了216个基因型，平均每对引物3.7个基因型。说明建兰SSR在兰属中具有很高的适用性，可用于分析兰属植物的遗传多样性、亲缘关系以及遗传作图。
表2本发明中49个兰属多态标记序列以及相关信息
2.SSR引物在兰属内种间分辨力分析:
对以上49个多态性分子标记数据利用convert软件转换格式输入软件whichloci。软件模拟出表4中兰属各个物种的10000个体，设定95％的最小个体准确归入率(min％Assign to population)和1的分配严谨度(Assignment stringency LOD)的基础上计算每个标记分辨分数(score或％Relative Score)，即在兰属中各个物种中的分辨能力，根据计算结果，软件给出了最优的5个标记组合(分别为SSR02、SSR07、SSR08、SSR32和SSR49)(见表3)构建兰属植物指纹标记库。最后对指纹库5个标记和49个多态标记得出的物种遗传距离矩阵进行相关性分析(即Mental Test)，发现两者有很高相关性(相关系数r＝0.775，显著性检测p＝0.008)。进一步证明指纹标记库的兰属物种分辨效率。
表3兰属指纹标记库中的5个标记
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 兰属微卫星标记的建立方法、核心指纹标记库与试剂盒
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cccatacatt acaggcaagc 20
Claims (2)
1.一种兰属植物核心指纹标记库，其特征在于，由SSR02、SSR07、SSR08、SSR32和SSR49共5个标记组成，每个标记包括2个引物序列，分别如SEQ ID NO:03-SEQ ID NO:04、SEQ IDNO:13- SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15- SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63- SEQ ID NO:64、SEQID NO:97- SEQ ID NO:98所示，用于兰属植物的物种区分。
2.一种兰属植物鉴定的试剂盒，其特征在于，它包括扩增或测序的引物试剂，所述的引物试剂由SSR02、SSR07、SSR08、SSR32、SSR49共5个标记的标记引物组成，每个标记包括2个引物序列，分别如SEQ ID NO:03-SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:13- SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15- SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63- SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:97- SEQ ID NO:98所示。
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