CN106929587A - 寒兰基因组中含有ssr位点的基因片段的pcr引物设计方法 - Google Patents

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杨柏云
张亚楠
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Abstract

本发明提供了寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该技术方案以寒兰全转录组测序并组装得到的全部68699条Unigene为基础，首先利用MISA工具进行SSR位点筛选，从中得到了9721条含有SSR位点的Unigene。在此基础上，为实现对其有效扩增，本发明基于primer3软件设计了符合上述基因片段PCR扩增特性的批量引物设计方法，通过软件参数的控制，可有效保证所得引物的扩增成功率，同时批量化的获得引物。随机验证发现，本发明所设计的引物在常规PCR扩增条件下获得特异性条带的比率可达56.03％，为寒兰遗传多样性分析、遗传图谱的构建奠定了基础，也为世界范围内寒兰分子生物学数据的对比及统一分析提供了依据。

Description

寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及PCR引物的批量设计，具体涉及寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法。
背景技术
寒兰(Cymbidium kanran)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生草本植物，主要分布于我国安徽、浙江、江西、台湾、福建、湖南、广西、贵州和云南等省区，由于寒兰具有较高的观赏价值和经济价值，因此在近年来成为了备受关注的花卉植物。在寒兰栽培的基础研究中，品种分型和品种改良是重要的研究方向，而这普遍需要用到分子生物学手段，其中分子标记是重要的技术手段之一。
分子标记是以个体间DNA碱基序列变异为基础的遗传标记，具有多态性高、数量多等优点，现有技术中利用分子标记手段进行寒兰基因组分析已经取得了良好的进展。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)，又称微卫星标记，是一类由1～6个碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列。SSR标记主要包括表达序列标签SSR(EST-SSR)和基因组SSR(g-SSR)。EST-SSR标记的多态性可能与基因功能直接相关，并且无需构建基因组文库等，因此，较g-SSR具有更高的通用性，在洋葱、刺梨、梨、辣椒、杜仲等植物的基因研究中均有报道。现有技术披露有研究者利用EST-SSR对103种栽培中国兰花进行了研究，还有学者针对蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)已公布的EST数据进行SSR分析挖掘。
然而，由于现有技术对寒兰基因组中SSR位点的分布类型及特征研究仍不充分，因此极大制约了SSR标记在寒兰基因研究中的应用。此外，即使明确了寒兰基因组中SSR位点的分布类型及特征，还需要对具有SSR位点的基因片段进行有效扩增才能实现实际应用，而对于批量含有SSR位点的Unigene序列而言，采取何种通用的引物设计原则才能批量获得具有更好扩增效果的PCR引物，成为了亟待解决的技术问题。这不仅需要对引物设计工具具有较高的应用水平，而且需要对目的片段的分子生物学特性具有充分的认知才能获得理想的引物设计方法。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，以解决现有技术中缺乏一种针对上述基因片段的批量引物设计方法的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是当对上述基因片段进行批量引物设计时，所设计引物的扩增率较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该方法是利用primer3引物批量设计程序实施的，其中：
所述SSR位点的侧翼序列长度不小于50bp；
程序的输入参数中：退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～300bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。
作物优选，对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，在寒兰Unigene库中进行Blast验证。
作物优选，对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，通过以下PCR扩增步骤验证其有效性：
PCR反应体系为：每25μL PCR反应体系中含5units/μL的Taq DNA聚合酶0.125μL，不含Mg2+的10×buffer 2.5μL，25mM的MgCl2 1.5μL，dNTP Mixture 2μL，10μM的引物1μL，DNA模板50ng，ddH2O定容至25μL；
PCR反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸10min。
作物优选，所述dNTP Mixture中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM。
作物优选，所述含有SSR位点的基因片段是使用位点挖掘程序MISA从寒兰Unigene库中进行SSR位点搜索得到的。
作物优选，所述SSR位点搜索的过程中，向程序输入的搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、6、4、3、3和3次。
在以上技术方案中，所述“primer3引物批量设计程序”，是指名称为“primer3”的在线引物设计程序。在本发明中，所述“primer3引物批量设计程序”具体限定为：与2017年4月9日、网址为http://bioinfo.ut.ee/primer3/所提供程序在功能和运算规则上完全相同的软件；也就是说，以2017年4月9日时、网址为http://bioinfo.ut.ee/primer3/所提供的程序为基础，其之前或之后的、在功能或运算规则上存在差异的其他primer3软件版本，不属于本发明所述“primer3引物批量设计程序”所限定的范围。
在以上技术方案中，所述寒兰Unigene库是指以寒兰全转录组序列为基础，利用DeNovo方法进行短序列组装得到的全部基因片段。
在以上技术方案中，所述“位点挖掘程序MISA”，是指由http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/网址发布的、用于批量识别和定位SSR序列的软件。该软件在本技术领域内又称为MISA工具，其使用方法可依据本领域的一般技术常识实现。在本发明中，所述“位点挖掘程序MISA”具体限定为：与2017年4月9日、网址为http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/所提供程序在功能和运算规则上完全相同的软件；也就是说，以2017年4月9日时、网址为http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/所提供的程序为基础，其之前或之后的、在功能或运算规则上存在差异的其他程序版本，不属于本发明所述“位点挖掘程序MISA”所限定的范围。
本发明提供了寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该技术方案以寒兰全转录组测序并组装得到的全部68699条Unigene为基础，首先利用MISA工具进行SSR位点筛选，从中得到了9721条含有SSR位点的Unigene。在此基础上，为实现对其有效扩增，本发明基于primer3软件设计了符合上述基因片段PCR扩增特性的批量引物设计方法，通过软件参数的控制，可有效保证所得引物的扩增成功率，同时批量化的获得引物。随机验证发现，本发明所设计的引物在常规PCR扩增条件下获得特异性条带的比率可达56.03％，为寒兰遗传多样性分析、遗传图谱的构建奠定了基础，也为世界范围内寒兰分子生物学数据的对比及统一分析提供了依据。
在优选技术方案中，所限定的引物扩增效果验证方法，更符合含SSR位点的Unigene的扩增条件，因此其验证结果与实际应用效果更为贴近、验证效果更好。所限定的MISA工具运行参数，是依据寒兰Unigene库的特征设计的，充分考虑了寒兰基因中SSR的分布类型和核苷酸构成特征，因此该优选技术方案对SSR位点的筛选更加准确，为后续引物的设计奠定了基础。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中编号为D117的引物扩增后的电泳图；
图中：1～15号位置依次为寒兰1～15号样品DNA的条带；M位置为GM347 DNAMarker的条带。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1转录组数据来源
寒兰转录组数据来源于本课题组2015年对培养于江西省重点实验室大棚的寒兰进行Illumina高通量深度测序的结果。测序时取其根、茎、叶、花四部分，提取RNA并等量混匀后建库，委托华大基因公司进行转录组测序，并通过De Novo方法组装得到68699条Unigene，作为分析背景数据。
2材料
用15个野生寒兰居群对筛选出的引物进行多态性检测。从1到15号分别为贵州省榕江，江西省齐云山，湖南省靖州，湖北省来凤，广西省桂林，福建省武夷山，江西省龙南，江西省寻乌，浙江省云和，江西省宜丰，江西省大余，江西省井冈山，浙江省杭州，湖北省恩施，云南省保山。
3实验方法
3.1DNA提取
取寒兰当年萌发的新苗顶叶。使用植物基因组DNA提取试剂盒(TianGen,DP305-02,Beijing)提取寒兰DNA。1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整度、纯度以及浓度。将检测合格的DNA于-20℃保存。
3.2转录组SSR位点鉴别及SSR引物开发
使用位点挖掘工具MISA(MIcroSAtellite identification tool)程序(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行SSR位点搜索，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、6、4、3、3和3次。
用Primer 3引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计的主要参数为：(1)退火温度(Tm)在55-65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)PCR产物大小在80-300bp；(3)引物长度在18-28bp之间；(4)GC含量在40％-60％之间；尽量避免引物二级结构的出现。对批量设计SSRs引物对在Unigene库中进行SSR引物的Blast验证。
3.3SSR引物有效性检测
随机选取141对SSR引物，由上海生工公司合成。用15个地区的寒兰进行检测。PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶(5units/μL)0.125μL，10×buffer(Mg2+free)2.5μL，25mM MgCl2 1.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，引物(10μM)1μL，DNA模板50ng，ddH2O加至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。所需的试剂均购自大连宝生物有限公司。PCR扩增在k960(杭州晶格科学仪器有限公司)型PCR仪进行。扩增产物在10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染显影，照相保存。
3.4数据处理
用SSR出现频率和平均分布距离来描述EST-SSR。在PAGE胶中相同迁移位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为999，构建[1，0]二元数据矩阵。应用Popgen Ver.1.32软件计算等位基因数，有效等位基因数，观测杂合度，期望杂合度，哈格温伯格指数。SSR位点的多态性信息量根据Anderson等提出的公式PIC＝1－∑Pi 2计算，其中Pi表示某一位点的第i个等位变异的基因频率，这一步通过PIC软件计算得到。
4结果与分析
4.1转录组SSR位点的分布
寒兰转录组测序得到62.06Mb总原始读长，对原始读长进行过滤拼接，得到平均长度为863nt的contig 126220条，最后对contig进行组装得到平均长度为867nt的Unigene68699条。通过对寒兰转录组的68699条Unigene(序列总长60.06Mb)序列对比到七大数据库进行注释，检测出9837个SSR位点分布于9721个Unigene中。总体上，SSR发生频率为14.32％，平均每6.25kb出现1个SSR。如表1所示，SSR的类型丰富，单核苷酸至六核苷酸重复类型均存在。其中单、二、三核苷酸重复出现频率占优势，分别占总SSR的14.49％、55.22％和25.37％；四、五、六核苷酸重复类型出现频率较低，分别占总数的1.43％、1.43％、2.06％。所有SSR中，重复次数为5和6的最多，分别占13.49％和16.81％。
寒兰转录组SSR重复单元的重复次数分布在4-111次之间，其中4-10次重复的SSR位点有6072个，占总个数的61.73％；11-20次重复的有3093个，占31.44％；21-30次重复的有539个，占5.48％；30次重复以上的有133个，占1.35％。寒兰转录组SSR的长度范围为12-111bp，12-20bp的多态性中等，有5826个，占59.23％；≥20bp的多态性较高，有4011个，占40.77％。
表1 寒兰EST-SSR的类型及数量
4.2转录组SSR基元重复类型和频率特征
如表2所示，SSR以二核苷酸重复基元为主要类型，在二核苷酸重复基元中，AG/CT重复频率最高，达38.83％；三核苷酸重复频率仅低于二核苷酸，其中以AAG/CTT为主，占总SSR的7.22％；其次是单核苷酸重复基序，以10次以上重复为主，A/T重复基元最多，占14.46％。四、五和六核苷酸重复基元类型较多，但数量较少，出现频率均较低。
表2 寒兰转录组中SSR类型分布
4.3EST-SSR引物的有效性和多态性
对含有SSR位点的9721条序列进行引物设计，共设计出6017对引物。随机挑选合成了141对引物，包括所有核苷酸基元类型。观察聚丙烯酰胺凝胶，其中79对引物能够扩增出条带，占检测引物的56.03％。图1选取引物D117在1-15号寒兰的扩增条带。在这79对引物中，有15对引物能够扩增出清晰且具有多态性的条带(PIC>0.4)，达到10.64％。
如表3所示，采用具有多态性条带的15对引物，对15个地区的寒兰进行PCR扩增，共检测出78个等位变异，每个位点有4-7个等位变异，其中D15和D125检测到最多的等位变异数均为7个。期望杂合值He和观测杂合值Ho得范围分别为0.4989-0.8345和0.3333-1.0000，平均值为0.6552和0.7839。所有标记没有出现显著的哈代温伯格平衡偏离现象(P>0.05)。
表3 筛选得到的15对寒兰SSR引物信息
5、实验结论
本实施例对一个来自寒兰转录组文库中的68699条Unigene进行了SSR搜索，得到了11646个SSR位点，出现频率为16.95％。出现频率高于龙眼(8.28％)，高粱(5.81％)，洋葱(5.57％)，但低于萝卜(23.79％)和蓝靛果忍冬(32.51％)，表明寒兰转录组序列中SSR位点含量是比较丰富的，各物种出现频率不同可能是由物种间的真实SSR信息差异引起的。
从寒兰SSR结构来看，二核苷酸(55.22％)出现频率最高，高于单核苷酸(14.49％)和三核苷酸(25.37％)，属于优势核苷酸，这与蓝靛果等植物的二核苷酸重复频率最高相同，异于以三核苷酸为优势核苷酸的落花生等植物。SSR的频率差异可能是由不同物种自身特殊的遗传背景引起的，也可能是受SSR位点检索条件的影响形成的。从其基元来看，在二核苷酸重复基元中频率最高的是AG/CT，与刺梨，蓝靛果忍冬，胡杨、芝麻中的研究一致。最丰富的三核苷酸重复为AAG/CTT，这与Morgante等的观点相符。与上述众多相关研究比较，寒兰转录组搜索的SSR位点重复基元种类丰富。
根据9721条序列进行引物设计，共设计了6017对SSR位点特异引物。在合成的141对SSR引物中，共有79对引物能够扩增出特异条带，其扩增率为56.03％，其中15对引物能够扩增出具有多态性的条带，占10.64％，这个比率低于红豆杉，与蓝靛果忍冬相当。多态性的高低可能与材料数量及材料之间差异程度有关，基于寒兰转录组开发的EST-SSR标记引物的多态性相对较丰富。从多态性潜能的角度考虑，本研究中设计的6017对SSR引物也具有较高的可用性，用于寒兰的遗传研究是可行的。本研究为进一步开发新的寒兰功能基因SSR标记奠定了基础，也为寒兰遗传多样性分析、遗传图谱构建和功能基因的挖掘等奠定了基础。
实施例2
寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该方法是利用primer3引物批量设计程序实施的，其中：
所述SSR位点的侧翼序列长度不小于50bp；
程序的输入参数中：退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～300bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，通过以下PCR扩增步骤验证其有效性：
PCR反应体系为：每25μL PCR反应体系中含5units/μL的Taq DNA聚合酶0.125μL，不含Mg2+的10×buffer 2.5μL，25mM的MgCl2 1.5μL，dNTP Mixture 2μL，10μM的引物1μL，DNA模板50ng，ddH2O定容至25μL；
PCR反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸10min。
所述含有SSR位点的基因片段是使用位点挖掘程序MISA从寒兰Unigene库中进行SSR位点搜索得到的。
实施例3
寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该方法是利用primer3引物批量设计程序实施的，其中：
所述SSR位点的侧翼序列长度不小于50bp；
程序的输入参数中：退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～300bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.寒兰基因组中含有SSR位点的基因片段的PCR引物设计方法，该方法是利用primer3引物批量设计程序实施的，其特征在于：
所述SSR位点的侧翼序列长度不小于50bp；
程序的输入参数中：退火温度为55～65℃；上、下游引物的Tm值相差不超过2℃；PCR产物大小为80～300bp；引物长度为18～28bp；GC含量为40～60％。
2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，在寒兰Unigene库中进行Blast验证。
3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：对从primer3引物批量设计程序中获得的引物对，通过以下PCR扩增步骤验证其有效性：
PCR反应体系为：每25μL PCR反应体系中含5units/μL的Taq DNA聚合酶0.125μL，不含Mg2+的10×buffer 2.5μL，25mM的MgCl2 1.5μL，dNTP Mixture 2μL，10μM的引物1μL，DNA模板50ng，ddH2O定容至25μL；
PCR反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，34个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求3所述的引物设计方法，其特征在于所述dNTP Mixture中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM。
5.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于所述含有SSR位点的基因片段是使用位点挖掘程序MISA从寒兰Unigene库中进行SSR位点搜索得到的。
6.根据权利要求5所述的引物设计方法，其特征在于所述SSR位点搜索的过程中，向程序输入的搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、6、4、3、3和3次。
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