CN106987648A - 一种高通量的植物器官发育相关ssr分子标记方法 - Google Patents

一种高通量的植物器官发育相关ssr分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分子生物学领域的一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法。通过本发明方法，以月季的花为例，可以一次性得到十几万对SSR引物，并从中找到3387对SSR引物与月季花发育过程中表达的功能基因相关。选出的SSR分子标记数量多，具有多态性，适合不同应用的选择，能够很好的为分析发掘相关基因提供遗传背景、了解中国古老月季的驯化历史、月季的栽培驯化、月季种质资源多样性，还能为其他蔷薇科蔷薇属植物的亲缘关系鉴定及遗传图谱构建提供一套SSR分子标记体系。本发明的方法几乎完全依赖计算机的模拟与计算，摆脱了实验室的条件限制与不可控因素的影响，且得到的分子标记数量巨大、可靠、多态性好。

Description

一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法。
背景技术
月季(rose)属于蔷薇科蔷薇属(Rosaceae)植物，是全球第一大切花，具有较高的观赏价值。经过长期的自然选择和复杂的栽培驯化，月季从野生种演化到古老月季，进而由古老月季演化到现代月季。自1867年创造出第一个四季开花的现代月季“法兰西”开始，至今现代月季栽培品种已约有33000种。现代月季一般为四倍体，多数是由中国月季与欧洲其他原有的蔷薇品种反复杂交而选育的新品种。因此，遗传多样性及群体结构研究是月季生物学研究的重要内容，是进行月季重要性状基因发掘和遗传进化研究的基础。然而我国目前对月季资源利用不充分，遗传多样性研究较少，严重制约了我国月季种植资源的高效利用。
分子标记是以个体遗传物质的核苷酸序列变异为基础的遗传标记。分子标记技术现已广泛应用于遗传图谱构建、系统发生分析、群体遗传分析等方面，是研究遗传多样性的重要工具。近年来，分子标记的方法在杂种鉴定上的应用也开始越来越普遍。相对于形态学鉴定，分子标记鉴定快速、准确、重现性好。随着分子技术的发展，分子标记鉴定的方法越来越多，已经发展起来的分子标记多达60多种，包括以传统的Southern杂交为基础的分子标记，如RFLP、SS-CP-RFLP、DGGE-RFLP等；以PCR为基础的标记，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR等；以基因组序列为基础的标记，如SNP、InDel、cSSR等。
随着分子生物学和遗传学的发展，DNA分子标记经历了三个阶段。第一代DNA分子标记主要有RFLP标记和RAPD标记，这两种标记方法主要用于基因连锁图谱的构建，但RFLP标记对DNA多态性检出的灵敏度不高，RAPD标记技术由于随机引物和低退火温度导致其具有不稳定性。第二代DNA分子标记以SSR标记为代表，SSR标记具有以下三个优点：(1)整个基因组都存在具有差异的微卫星序列，可以设计的分子标记数量丰富，多态性高；(2)SSR分子标记是共显性标记，能把多个等位基因都标识出来提供的信息量高且更加准确；(3)简单、快速、省时省力，不受环境影响，序列相对稳定，重复性好，不同的实验室可以相互交流合作开发引物。第三代DNA分子标记以SNP标记为代表，但是SNP标记对实验条件要求很高，并且成本大，不具有普适性。
尽管之前针对于月季的SSR分子标记的开发已经有过报道，但是前人的研究都是基于传统的分子标记开发方法，即通过southern blotting原理发现SSR序列，在通过测序获得序列信息，再设计引物，但是这种方法一般一次实验只能得到几十对可用SSR引物，效率低下且价格昂贵。
发明内容
本发明为了解决现有技术中月季SSR分子标记的开发效率低下且价格昂贵的问题，提出了一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法。具体技术方案如下：
一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法，包括如下步骤：
(1)对植物的基因组和器官转录组进行测序，经过质量控制和重新拼接(de novoassembly，即在没有可参考基因组的条件下，将测序得到的短Reads还原成更长的一致性序列的过程)分别生成基因组片段序列和转录本序列；
(2)找出所述基因组片段序列与所述转录本序列中的微卫星序列，在微卫星序列两端设计引物，获得基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(3)以步骤(1)中所述基因组片段序列为模板，将步骤(2)所获得的SSR引物进行电子PCR，并筛选产物扩增长度为100-1000bp的基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(4)将步骤(3)中筛选的转录组SSR引物所对应的独立转录本序列进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物；
(5)以步骤(1)中所述转录本序列为模板，将步骤(3)中筛选的基因组SSR引物进行电子PCR，将基因组SSR引物锚定的转录本序列进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物；
(6)步骤(4)中成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物和步骤(5)中成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物即为器官发育相关SSR分子标记。
进一步地，所述植物为月季。
进一步地，所述器官为花、根、茎或叶。
进一步地，所述测序为二代测序；所述质量控制为碱基质量值高于Q30(即仅采信准确率高于99.9％的测序数据用于进一步拼接及分析)；所述重新拼接的方法为利用SOAPdenovo软件对基因组进行组装，利用Trinity软件对器官转录组进行组装。
进一步地，所述找出所述基因组片段序列与所述转录本序列中的微卫星序列的方法为通过MISA软件。
进一步地，步骤(2)中引物的退火温度为59℃-61℃，PCR产物在100-400bp间。
进一步地，所述注释的数据库为NCBI的NR数据库。
一种高通量的月季花器官发育相关SSR分子标记方法，包括如下步骤：
(1)通过二代测序对月季的基因组和花器官转录组进行测序，经过质量控制和重新拼接分别生成基因组片段序列和转录本序列；
(2)通过软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)辨识出步骤(1)中基因组片段序列与转录本序列中的微卫星序列，在微卫星序列两端设计引物，获得基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(3)以步骤(1)中月季基因组片段序列为模板，将步骤(2)所获得的SSR引物进行电子PCR，并筛选产物扩增长度为100-1000bp的基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(4)将步骤(3)中筛选的转录组SSR引物所对应的独立转录本序列通过NCBI的NR基因数据库进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物；
(5)以步骤(1)中月季花器官转录本序列为模板，将步骤(3)中筛选的基因组SSR引物进行电子PCR，将基因组SSR引物锚定的转录本序列通过NCBI的NR基因数据库进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物；
(6)步骤(4)中成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物和步骤(5)中成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物即为月季花器官发育相关SSR分子标记。
进一步地，步骤(1)中月季为Samantha，是四倍体月季品种。
进一步地，步骤(2)中引物的退火温度为59℃-61℃，PCR产物在100-400bp间。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法，通过所述方法，以月季的花为例，可以一次性得到十几万对SSR引物，并从中找到3387对SSR引物与月季花发育过程中表达的功能基因相关。选出的SSR分子标记，数量多，具有多态性，适合不同应用的选择，能够很好的为分析发掘相关基因提供遗传背景、了解中国古老月季的驯化历史、月季的栽培驯化、月季种质资源多样性，还能为其他蔷薇科蔷薇属植物的亲缘关系鉴定及遗传图谱构建提供一套SSR分子标记体系。
2、本发明的方法几乎完全依赖计算机的模拟与计算，摆脱了实验室的条件限制与不可控因素的影响，且得到的分子标记数量巨大、可靠、多态性好。
附图说明
图1为编号为Geno-MK99266的引物以48份DNA样品(见表1)为模板的扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为根据NEI72遗传分化系数以未加权对群方法分析(Unweighted pair groupmethod analysis,UPGMA)进行聚类所得的结果，图中编号见表1。
具体实施方式
以下实施例便于更好的理解本发明，但不限于本发明。
下述实施例，如无特殊说明均为常规方法。下述试剂如无特殊说明均可通过商业途径获得。
实施例1
萨尔曼萨月季花器官发育相关SSR分子标记方法，包括如下步骤：
(1)通过二代测序对于普遍种植的月季品种‘萨尔曼萨’(samantha)的基因组和花器官转录组进行测序，分别获得了32G和7.2G的原始数据，经过质量控制(仅使用高于Q30，即准确率大于99.9％的测序数据)和重新拼接(de novo assembly，分别利用SOAPdenovo和Trinity软件对月季基因组及花器官转录组进行拼接)分别生成了约300万条基因组片段序列和8万条转录本序列；
(2)通过软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)辨识出步骤(1)中基因组片段序列与转录本序列中所存在的微卫星序列(simple sequence repeat,SSR)，并且在这些微卫星序列两端设计引物，要求引物的退火温度为60℃(上下不超过1℃)，PCR产物在100-400bp之间，共获得基因组SSR引物163680对和转录组SSR引物16345对；
(3)为了保证所设计的引物在实验过程中的可用性，以步骤(1)中测序和重新拼接获得的月季基因组片段序列为模板，将步骤(2)所获得的SSR引物进行电子PCR，结果显示再次测试中有124590对基因组SSR引物和2292对转录组SSR引物扩增单一的长度在100到1000个碱基的产物，保留上述基因组SSR引物和转录组SSR引物，将其它的略去；
(4)将步骤(3)中筛选的2292对转录组SSR引物所对应的2292个独立转录本序列通过NCBI的NR基因数据库进行注释，发现只有33个转录本被比对为数据库中所收录的功能基因，并且被成功注释；
(5)为了进一步增加与月季花器官转录组中的功能基因相关的SSR的数量，以步骤(1)中测序和重新拼接获得的月季转录本序列为模板，将步骤(3)中筛选的124590对基因组SSR引物进行电子PCR，发现有5525对基因组SSR引物可以被锚定到4100条转录本序列上，通过NR数据库比对注释，在这4100条转录本中有2748条与数据库中所记录的基因匹配，其功能被注释，这2748条转录本序列对应了3354对基因组SSR引物；
(6)步骤(4)中筛选的33对转录组SSR引物和步骤(5)中筛选的3354对基因组SSR引物即为月季花器官发育相关SSR分子标记，共3387对SSR引物。
实施例2
(1)基因组DNA的提取
实验材料：29份四倍体现代月季，18份二倍体古老月季和蔷薇属野生种，1份陆地草莓(如表1所示)。
CTAB提取法提取上述48份材料的叶片的DNA作为PCR模板。每个样按1000μl的CTAB提取液+5μl的β-巯基乙醇计，混匀所需CTAB和巯基乙醇，65℃水浴预热CTAB溶液；取约1/3体积的植物叶片放到2ml离心管中，加一颗钢珠，于液氮中快速冷冻后用磨样机将叶片磨碎；加入1ml制备好的CTAB溶液，涡旋混匀，65℃水浴30min(期间每隔几分钟晃动一下)；加入1ml氯仿异戊醇(CI)，颠倒混匀，抽提10min，13000rpm离心10min；吸上清，加入等体积的氯仿异戊醇(CI)，颠倒混匀，抽提10min，13000rpm离心10min；重复步骤5；吸上清(约500μl)至1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h以上；13000rpm离心30min；弃上清，加入1ml 75％的酒精洗涤；重复步骤8，弃上清；通风橱吹干，加入50ulddH2O溶解；测DNA浓度。
表1供测试材料信息
(2)随机抽取36对引物(表2)，其中包含和功能基因相关的以及那些未发现相关的引物，这些引物和(1)中48份独立的DNA样品进行PCR实验。
将(1)中48份独立的DNA浓度稀释到约50ng/μl，然后进行PCR反应。
PCR体系(20μl)：
PCR程序：
产物用浓度2％的琼脂糖凝胶检测。
表2随机抽取的引物
注：“+”表示有多态性；“-”表示无多态性。
PCR结果显示，36对引物均能得到清晰的条带(图1)，其中有33对引物具有多态性(表2)。基于该PCR结果的遗传多样性(NEI72系数)分析显示，通过这些引物的多态性可以明确的将4倍体现代月季，二倍体古老月季及蔷薇属野生种，草莓区分开(图2)。

Claims (10)

1.一种高通量的植物器官发育相关SSR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对植物的基因组和器官转录组进行测序，经过质量控制和重新拼接分别生成基因组片段序列和转录本序列；
(2)找出所述基因组片段序列与所述转录本序列中的微卫星序列，在微卫星序列两端设计引物，获得基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(3)以步骤(1)中所述基因组片段序列为模板，将步骤(2)所获得的SSR引物进行电子PCR，并筛选产物扩增长度为100-1000bp的基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(4)将步骤(3)中筛选的转录组SSR引物所对应的独立转录本序列进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物；
(5)以步骤(1)中所述转录本序列为模板，将步骤(3)中筛选的基因组SSR引物进行电子PCR，将基因组SSR引物锚定的转录本序列进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物；
(6)步骤(4)中成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物和步骤(5)中成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物即为器官发育相关SSR分子标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为月季。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述器官为花、根、茎或叶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序为二代测序；所述质量控制为碱基质量值高于Q30；所述重新拼接的方法为利用SOAPdenovo软件对基因组进行组装，利用Trinity软件对器官转录组进行组装。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述找出所述基因组片段序列与所述转录本序列中的微卫星序列的方法为通过MISA软件。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中引物的退火温度为59℃-61℃，PCR产物在100-400bp间。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注释的数据库为NCBI的NR数据库。
8.一种高通量的月季花器官发育相关SSR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过二代测序对月季的基因组和花器官转录组进行测序，经过质量控制和重新拼接分别生成基因组片段序列和转录本序列；
(2)通过软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)辨识出步骤(1)中基因组片段序列与转录本序列中的微卫星序列，在微卫星序列两端设计引物，获得基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(3)以步骤(1)中月季基因组片段序列为模板，将步骤(2)所获得的SSR引物进行电子PCR，并筛选产物扩增长度为100-1000bp的基因组SSR引物和转录组SSR引物；
(4)将步骤(3)中筛选的转录组SSR引物所对应的独立转录本序列通过NCBI的NR基因数据库进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物；
(5)以步骤(1)中月季花器官转录本序列为模板，将步骤(3)中筛选的基因组SSR引物进行电子PCR，将基因组SSR引物锚定的转录本序列通过NCBI的NR基因数据库进行注释，筛选成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物；
(6)步骤(4)中成功注释的转录本序列对应的转录组SSR引物和步骤(5)中成功注释的转录本序列对应的基因组SSR引物即为月季花器官发育相关SSR分子标记。
9.根据权利要求8所述的高通量开发方法，其特征在于，步骤(1)中月季为Samantha，是四倍体月季品种。
10.根据权利要求8所述的高通量开发方法，其特征在于，步骤(2)中引物的退火温度为59℃-61℃，PCR产物在100-400bp间。
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