CN110699480B - 用于杂交莲瓣兰est-ssr标记的引物组及筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于杂交莲瓣兰EST‑SSR标记的引物组，所述的引物组包括4对引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SED ID NO.1～SED ID NO.8所示；本发明还公开了用于杂交莲瓣兰EST‑SSR标记的引物组的筛选方法，通过本发明方法获得的用于杂交莲瓣兰EST‑SSR标记的引物组具有多态性丰富、扩增稳定、便于统计的优点，可以用于杂交莲瓣兰植物品种的种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及相关的分子研究。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组及筛选方法。
背景技术
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
EST(Expressed sequence tags)是指通过对cDNA文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5'或3'端序列，长度一般在150～500bp。这些已测序得到的EST都被提交到在线的生物数据库中，可以从公共数据库中共享这些EST序列，从中经电子筛选鉴别出SSR，并进一步开发成EST-SSR分子标记。利用EST开发的分子标记比起一般的分子标记如RFLP、RAPD、AFLP和gSSR等具有较高的信息量、通用性好、开发简单，快捷，费用低等优点。近年来，随着EST计划在不同物种件的扩展和研究内容的深入，在很多有重要经济价值的植物和模式植物中都积累了大量的EST，快速增长的EST数据为SSR标记的开发提供了丰富的来源，在大麦、黑麦、甘蔗、小麦、水稻、猕猴桃、葡萄、棉花、云杉、杏树、苜蓿等多种植物中都建立了EST-SSR标记，但是目前未见有研究基于莲瓣兰与其它兰花品种杂交得到的杂交莲瓣兰品种的EST-SSR标记，所以利用杂交莲瓣兰植物品种的基因数据信息开发EST-SSR引物，将会对杂交莲瓣兰植物品种的遗传多态性等研究起到推动作用。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组及筛选方法，可以快速筛选出用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物，并且所得到的引物具有多态性丰富、扩增稳定、便于统计的优点。
本发明是采用如下技术方案实现的：
用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组，其包括以下引物对中的任意一项或多项组合：
引物对A，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为CATCATGGTTTGACTGACGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示为TCAGAAACTGTATTCCCGCC；
引物对B，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示为CACTTCGGATTCATTCATGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示为GACGACTGGCTGATACGGTT；
引物对C，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示为GACACTTCACCCTCCTCAGC，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示为GGTGGAAATGGAAAGCGTTA；
引物对D，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示为CCACACTAAGCCCAACCCTA，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示为CAGATCACTGCTATCGGCAA。
上述用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其包括如下步骤：
(1)获取目标杂交莲瓣兰样本的原始基因数据库；
(2)对步骤(1)中所述原始基因数据库进行SSR位点搜索，其中一、二、三、四、五、六核苷酸的重复数目分别至少为10、6、5、5、5、5次；
(3)将步骤(2)中搜索得到的SSR位点的上下游序列作为目标序列，使用Primer5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；
(4)分别选择8个不同品种的兰花样本，并且按照常规方法提取DNA作为模版，使用所述候选引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析，初步筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的初筛分PCR引物；然后提取与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰的DNA为模版，使用初筛分PCR引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析，筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的引物，即可得到用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组。
一种用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的试剂盒，所述试剂盒包括引物对A、引物对B、引物对C和引物对D中的任意一项或多项组合。
进一步的，步骤(1)是按照常规方法对目标杂交莲瓣兰样本的RNA进行转录组测序获得EST标签序列，然后使用MISA软件获得所有重复序列所在序列区段，建立重复序列数据库作为目标杂交莲瓣兰样本的原始基因数据库。
进一步的，步骤(1)中所述目标杂交莲瓣兰样本为目标杂交莲瓣兰的生根组培苗，或者是目标杂交莲瓣兰的一年生植株或两年生植株的叶片；步骤(4)中所述的兰花样本为兰花的生根组培苗，或者是兰花的一年生植株或两年生植株的叶片。
进一步的，步骤(4)中是提取45种以上与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰，分别用初筛分PCR引物进行PCR扩增；所述与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰是莲瓣兰与以下品种杂交得到的杂交莲瓣兰：墨兰、蕙兰、春兰、建兰、春剑、寒兰。抽取45种以上的杂交莲瓣兰品种进行PCR扩增来验证筛选得到的引物代表性强，能够适用不同品种的杂交莲瓣EST-SSR标记。
进一步的，步骤(3)中所述候选引物的设计参数为：引物长度为20bp，GC含量为35％～60％，退火温度为60℃，PCR扩增产物预期片段长度为110bp～300bp。
进一步的，步骤(4)中所述PCR扩增为两步法PCR扩增，所述两步法PCR扩增包括以下步骤：
第一步PCR扩增，其反应体系的总体积为10μL，并且由以下体积的组分组成：1μL的浓度为20ng/μL的模版，0.1μL的浓度为10μmol/L的上游引物，0.1μL的浓度为10μmol/L的下游引物，5μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH2O；所述第一步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，60℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共20个循环，然后72℃延伸10min得到第一步扩增产物；
第二步PCR扩增，其反应体系的总体积为20μL，并且由以下体积的组分组成：2μL的第一步扩增产物，0.15μL的浓度为10μmol/L的第一步PCR扩增使用的下游引物，0.15μL的浓度为10μmol/L的M13引物，10μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH2O；所述第二步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，52℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸10min；所述M13引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示为TGTAAAACGACGGCCAGT。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
1、本发明是通过获取杂交莲瓣兰品种的原始基因数据库进行特定条件的SSR位点搜索，然后根据得到的SSR位点信息，使用Primer5.0对应设计引物，再对设计的引物进行筛选，最终获得能够对不同的杂交莲瓣兰品种实现EST-SSR标记，有利于杂交莲瓣兰品种的种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及相关的分子研究。
2、本发明中的引物体系筛选方法采用两步法PCR扩增，优化引物配比，在第一步和第二步PCR扩增中配制不同的反应体系，提高扩增成功率和灵敏度，而且方法操作简单，通过本方法筛选得到用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组具有多态性丰富、扩增稳定、便于统计的优点。
附图说明
图1是本发明所述引物对A对应杂交兰A19的扩增产物的电泳谱图。
图2是本发明所述引物对A对应杂交兰A18的扩增产物的电泳谱图。
图3是本发明所述引物对A对应滇梅的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图4是本发明所述引物对A对应玉兔兰花的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图5是本发明所述引物对B对应杂交兰A19的扩增产物的电泳谱图。
图6是本发明所述引物对B对应杂交兰A18的扩增产物的电泳谱图。
图7是本发明所述引物对B对应滇梅的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图8是本发明所述引物对B对应玉兔兰花的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图9是本发明所述引物对C对应杂交兰A19的扩增产物的电泳谱图。
图10是本发明所述引物对C对应杂交兰A18的扩增产物的电泳谱图。
图11是本发明所述引物对C对应滇梅的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图12是本发明所述引物对C对应玉兔兰花的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图13是本发明所述引物对D对应杂交兰A19的扩增产物的电泳谱图。
图14是本发明所述引物对D对应杂交兰A18的扩增产物的电泳谱图。
图15是本发明所述引物对D对应滇梅的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
图16是本发明所述引物对D对应玉兔兰花的杂交后代的扩增产物的电泳谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其包括如下步骤：
(1)按照常规方法对目标杂交莲瓣兰样本的RNA进行转录组测序获得EST标签序列，然后使用MISA软件获得所有重复序列所在序列区段，建立重复序列数据库作为目标杂交莲瓣兰样本的原始基因数据库；所述目标杂交莲瓣兰样本为一年生植株的叶片；
(2)对步骤(1)中所述原始基因数据库进行SSR位点搜索，其中一、二、三、四、五、六核苷酸的重复数目分别至少为10、6、5、5、5、5次；
(3)将步骤(2)中搜索得到的SSR位点的上下游序列作为目标序列，使用Primer5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；所述候选引物的设计参数为：引物长度为20bp，GC含量为35％～60％，退火温度为60℃，PCR扩增产物预期片段长度为110bp～300bp；
(4)分别选择8个不同品种的兰花样本，并且按照常规方法提取DNA作为模版，使用所述候选引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析，初步筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的初筛分PCR引物；然后提取48个与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰的DNA为模版，分别使用初筛分PCR引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析(如图1～12所示4种杂交莲瓣兰分别使用4对引物对进行PCR扩增的结果，其余杂交莲瓣兰品种的扩增结果省略)，筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的引物，即可得到用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组；所述与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰是莲瓣兰与以下品种杂交得到的杂交莲瓣兰：墨兰、蕙兰、春兰、建兰、春剑、寒兰；
所述PCR扩增为两步法PCR扩增，所述两步法PCR扩增包括以下步骤：
第一步PCR扩增，其反应体系的总体积为10μL，并且由以下体积的组分组成：1μL的浓度为20ng/μL的模版，0.1μL的浓度为10μmol/L的上游引物，0.1μL的浓度为10μmol/L的下游引物，5μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH2O；所述第一步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，60℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共20个循环，然后72℃延伸10min得到第一步扩增产物；
第二步PCR扩增，其反应体系的总体积为20μL，并且由以下体积的组分组成：2μL的第一步扩增产物，0.15μL的浓度为10μmol/L的第一步PCR扩增使用的下游引物，0.15μL的浓度为10μmol/L的M13引物，10μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH2O；所述第二步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，52℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸10min；所述M13引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示为TGTAAAACGACGGCCAGT。
按照本实施例所述方法筛选得到以下4对引物：
引物对A，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为CATCATGGTTTGACTGACGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示为TCAGAAACTGTATTCCCGCC；
引物对B，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示为CACTTCGGATTCATTCATGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示为GACGACTGGCTGATACGGTT；
引物对C，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示为GACACTTCACCCTCCTCAGC，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示为GGTGGAAATGGAAAGCGTTA；
引物对D，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示为CCACACTAAGCCCAACCCTA，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示为CAGATCACTGCTATCGGCAA。
实施例2：杂交莲瓣兰EST-SSR标记的多态性分析
对本实施例1所述方法筛选得到的4对用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物对进行多态性分析，结果见表1。
表1杂交莲瓣兰EST-SSR标记多态性分析表
| 引物对名称 | 长度(bp) | 总条带 | 多态性条带 | 多态性信息含量 |
| 引物对A | 248 | 73 | 6 | 0.563 |
| 引物对B | 222 | 73 | 3 | 0.446 |
| 引物对C | 174 | 75 | 3 | 0.4 |
| 引物对D | 274 | 74 | 5 | 0.605 |
根据上述结构分析，4对引物能够扩增出17个条带，多态性条带数在3～6个之间，平均每对引物扩增到4.25个多态性条带，各引物的多态性比率均为100.00％。其多态性信息含量分别范围为0.4～0.605，充分证明了EST-SSR标记在杂交兰种质中具有较丰富的遗传多态性。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所(广西亚热带农产品加工研究所)
<120> 用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组及筛选方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
catcatggtt tgactgacgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tcagaaactg tattcccgcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cacttcggat tcattcatgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gacgactggc tgatacggtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gacacttcac cctcctcagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggtggaaatg gaaagcgtta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ccacactaag cccaacccta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cagatcactg ctatcggcaa 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tgtaaaacga cggccagt 18
Claims (1)
1.用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组，其特征在于：由以下引物对中的任意一项或多项组合：
引物对A，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为CATCATGGTTTGACTGACGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示为TCAGAAACTGTATTCCCGCC；
引物对B，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示为CACTTCGGATTCATTCATGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示为GACGACTGGCTGATACGGTT；
引物对C，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示为GACACTTCACCCTCCTCAGC，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示为GGTGGAAATGGAAAGCGTTA；
引物对D，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示为CCACACTAAGCCCAACCCTA，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示为CAGATCACTGCTATCGGCAA；
所述莲瓣兰为滇梅的杂交后代、玉兔兰花的杂交后代、杂交兰A18以及杂交兰A19。
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