KR20120049738A - 심비디움 속 식물에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

심비디움 속 식물에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심비디움 속 식물(Cymbidium spp.)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법 및 품종 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 심비디움 속 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 심비디움 속 식물의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 심비디움 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 심비디움 속 식물의 품종을 판별할 수 있다.

Description

심비디움 속 식물에서 유래한 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도 {SSR primer derived from Cymbidium spp. and use thereof}
본 발명은 심비디움 속 식물(Cymbidium spp.)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법 및 품종 동정 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류?동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 마이크로세틀라이트마이크로세틀라이트(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 마이크로세틀라이트 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 마이크로세틀라이트 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕(Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다(Tang et al. Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 심비디움(Cymbidium)에서는 SSR 마커가 아직 전혀 개발된 바 없다.
이에 본 발명자들은 심비디움의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 다양한 심비디움 계통들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 심비디움 속(Cymbidium spp.) 식물의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법 및 심비디움 속 식물의 품종 동정 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출용 키트 및 심비디움 속 식물의 품종 동정용 키트를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 심비디움 속 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 심비디움 속 식물의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 심비디움 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 심비디움 속 식물의 품종을 판별할 수 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 14쌍의 SSR 프라이머를 이용하여 96개 심비디움 품종들의 다형성 분석 결과로부터 상기 계통 및 품종의 유연관계를 분석한 계통수를 나타낸 것이다. 아라비아 숫자는 표 4에 나타낸 심비디움 품종 번호를 나타낸 것이다.
본 발명은 심비디움 속 식물의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공한다.
본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al. Mol. Eco. Note, 5:736-738) 방법으로 심비디움 속 식물로부터 SSR 마커를 개발하였다. 심비디움 속 식물에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 심비디움 속 식물로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션하였다.
라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 프라이머와 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 심비디움 속 식물의 마이크로세틀라이트를 포함하고 있는 525개의 DNA 단편을 수득하였다.
상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 5개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 마이크로세틀라이트를 증폭할 수 있는 양방향 프라이머 206쌍을 디자인 하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 심비디움 품종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 14쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 SSR 프라이머쌍은 KNU-CC-42 (서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-32 (서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-43 (서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-Slt-019(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-34 (서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-40 (서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-52 (서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-01 (서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-71 (서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-76 (서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-30 (서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-25 (서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-35 (서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍) 및 KNU-CC-203 (서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 마이크로세틀라이트에 존재하는 반복 모티브(repeat motif), 증폭되는 마이크로세틀라이트의 크기, Tm(℃) 및 마이크로세틀라이트가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.
본 발명의 SSR 프라이머쌍 및 이로부터 증폭되는 마이크로세틀라이트의 특성
프라이머명 서열 서열번호 반복 모티브 증폭되는 마이크로세틀라이트의 크기의 범위(bp) Tm
(℃)		 대립인자의 수
KNU-CC-42 aF: GGGATGAGAACAACAAACAGA 1 (CTC)4 110-248 55 15
bR: TCTTCCGCTGGATCTCAA 2
KNU-CC-32 F: AAAACCTTGATCCTCACAAGA 3 (AG)27 114-248 55 25
R: TGGGTCGACATGATCTGTT 4
KNU-CC-43 F: TCGCTGCGCCTATACAGT 5 (CT)14 135-295 55 20
R: CTCAGCTGTTGCCTCCAC 6
KNU-CC-34 F: GCGGATGCCCACTATACA 7 (AG)13 169-243 55 7
R: GCTCCTCTTTGAGTTTGGG 8
KNU-CC-40 F: AAGCTCTGTCTTCATCCTTCAA 9 (GA)32 140-260 55 14
R: TGGTGTGGAGAGAGGTTTTT 10
KNU-CC-52 F: GAATTTTGCTGTCCGCTG 11 (GA)9 230-288 55 8
R: GGCGTGTTCGTGTTGAAT 12
KNU-CC-55 F: AAGGTTGCATTTTCCCTCA 13 (CAA)14 105-312 55 12
R: ACTAGGTGGGGTCGGCTA 14
KNU-CC-01 F: CAGAGGTATTGCAGGGGA 15 (GT)10(GA)14 123-181 55 11
R: CCGTTAGGGATTGGGTTT 16
KNU-CC-71 F: GATTTCAGCCCTCGGAGT 17 (CAA)8 105-342 55 14
R: ACTAGGTGGGGTCGGCTA 18
KNU-CC-76 F: GAATTTGGCTGGTGGTGA 19 (TG)14 103-287 55 19
R: TTGTCCTCTTGCTCCCAA 20
KNU-CC-30 F: TTCATATAGCCGACCCCA 21 (TTG)10 116-284 55 12
R: GCAAGAGAAGGGCGAATT 22
KNU-CC-25 F: CGATCCCCTCTTACCCAC 23 (TG)23 122-266 52 7
R: GTGGGTGCAAAGAGATGG 24
KNU-CC-35 F: TCTCAGGCAATGCCGTAT 25 (TC)10, (GT)13 119-263 52 25
R: TTTGTGTGTGGCATTCGA 26
KNU-CC-203 F: AACCTAATCAAGGGTTTCTAACTC 27 (TG)13 136-380 55 25
R: CCACCCAACAAAGCGATA 28
aF: 정방향 프라이머 bR: 역방향 프라이머
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 심비디움 속 식물(Cymbidium spp.)로부터 유래된 것일 수 있다. 이 때 심비디움 속 식물은 Cymbidium goeringii, Cymbidium sinensis 및 Cymbidium hybridium 및 이들의 변종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 심비디움 속 식물에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 심비디움 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법은
(a) 심비디움 속 식물로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 잔디에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 70-75℃, 예를 들면 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성은 90-99℃, 02-97℃ 또는 94-95℃에서 수행될 수 있으며, 증폭은 70-75℃, 71-74℃ 또는 72℃에서 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있는데, 예를 들어 50-59℃, 52-57℃ 또는 55℃로 수행할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 예를 들면, 아가로스 겔(agarose gel), 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)를 이용하여 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행할 수 있다. PCR 증폭 결과는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있어 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 심비디움 속 식물의 품종 동정 방법을 제공한다.
구체적으로 심비디움 속 식물의 품종 동정 방법은
(a) 심비디움 및 대조군 심비디움 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 앞서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 심비디움 및 대조군 심비디움 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대해 시료가 되는 심비디움과 대조군 심비디움 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 심비디움과 대조군 심비디움 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 심비디움은 대조군 심비디움 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 심비디움 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 심비디움과 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 심비디움보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 심비디움에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 심비디움 속 식물의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 심비디움 속 식물은 Cymbidium goeringii, Cymbidium sinensis 및 Cymbidium hybridium 및 이들의 변종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 게놈 DNA 추출
Cymbidium goeringii 로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세하게 설명하면 다음과 같다. 생육 1개월째의 어린 심비디움 식물체로부터 0.5 g 정도의 잎 조직을 채취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액(200 mM Tris-HCl pH8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750 ㎕를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀(phenol):클로로포름(chloroform):이소아밀알코올(isoamylalchol)(25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300 ㎕의 RNase (50 ㎍/㎖)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간 동안 보관하였다.
실시예 2: 어댑터와의 라이게이션( ligation )
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500 ng을 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.4% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 14℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 AP-12 어댑터는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, Promega, 미국)로 5’ 말단을 인산화하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼(Promega, 미국), 50ng AP11 어댑터, 50ng AP12 어댑터, 150ng DNA 단편, 3 Unit T4 라이게이즈(Promega, 미국).
본 발명에서 사용한 어댑터
어댑터 명 염기서열 서열번호
AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3' 29
AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAGCACA-3' 30
실시예 3: 마이크로세틀라이트를 포함하고 있는 DNA 단편의 선발 및 분리
<3-1> 마그네틱 비드 준비
마그네틱 비드(magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC(Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6 ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100 ㎕를 넣은 후 30분 이내에 사용하였다.
<3-2> 혼성화
상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500 ㎕가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴(biotin)이 표지된 SSR 프라이머 1.5 ㎕(20ng)와 20x SSC 버퍼 13 ㎕를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 6개의 SSR 프라이머는 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 프라이머는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.
마이크로세틀라이트를 분리하기 위한 프라이머의 서열
서열 서열번호
Biotin-(GA)20 31
Biotin-(AGC)15 32
Biotin-(GGC)15 33
Biotin-(AAG)15 34
Biotin-(AAC)15 35
Biotin-(AGG)15 36
혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 프라이머들과 상보적 결합을 하였고, 이를 SSR 프라이머-템플릿(template) 혼성체(hybrid)라고 한다.
<3-3> 템플릿의 분리
<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 프라이머-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시켰다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 프라이머-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 프라이머-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300 ㎕로 4회 세척한 후 증류수 50 ㎕를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.
<3-4> PCR 반응
<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5 ㎕ 10× 완충용액. PCR 반응은 94℃에서 7분 동안 가열한 후 94℃에서 30초; 53℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클(cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
이와 같은 방법으로 본 발명에서는 마이크로세틀라이트를 함유하고 있는 525개의 DNA 단편을 분리하였다.
실시예 4: 분리된 DNA 단편의 서열분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 3에서 분리된 마이크로세틀라이트를 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 ABI 3100 DNA 서열분석기와 BigDye Terminator 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 5개 이상의 반복 유닛(repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 마이크로세틀라이트를 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 206쌍의 프라이머쌍을 디자인하였다(결과미도시).
실시예 5: SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 심비디움 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 96개의 심비디움 품종에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다. 72 개의 C. goeringii 품종들을 다양한 지역으로부터 수집하여 공주 국립대학교에 보관하였으며, 나머지 품종들은 농촌진흥청 국립원예특작과학원으로부터 얻었다.
SSR 분석에 사용된 심비디움
번호 ID 품종 보관기관 수집장소
1 KNU-049 C. goeringii 공주국립대학교 전남 진도군 의신면 초평리
2 KNU-014 C. goeringii 공주국립대학교 전남 해남군 두륜산 대흥사
3 KNU-024 C. goeringii 공주국립대학교 전남 신안군 암태면 단고리
4 KNU-083 C. goeringii 공주국립대학교 전남 신안군 안좌면 마진리
5 KNU-046 C. goeringii 공주국립대학교 경남 거제시 남부면 갈곶리(해금강)
6 KNU-036 C. goeringii 공주국립대학교 전남 완도군 천연기념물
7 KNU-045 C. goeringii 공주국립대학교 경남 하동군 청암면 내촌리
8 KNU-052 C. goeringii 공주국립대학교 충남 안면도 수목원
9 KNU-039 C. goeringii 공주국립대학교 전남 진도군 운림산방
10 KNU-077 C. goeringii 공주국립대학교 경남 고성군 공룡발자국화석
11 KNU-082 C. goeringii 공주국립대학교 경남 거제시 일운면 와현리 예구 공곶이
12 KNU-070 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 서귀포시 호근동
13 KNU-043 C. goeringii 공주국립대학교 인천 덕적면 부둣가
14 KNU-062 C. goeringii 공주국립대학교 인천 덕적도
15 KNU-003 C. goeringii 공주국립대학교 전남 신안군 자은면 백길해수용장
16 KNU-017 C. goeringii 공주국립대학교 전남 강진군 도암면 석천리
17 KNU-016 C. goeringii 공주국립대학교 전북 남원시 이백면 여원정
18 KNU-019 C. goeringii 공주국립대학교 전북 고창군 신림면 부송리
19 KNU-022 C. goeringii 공주국립대학교 경남 통영시 미륵도
20 KNU-010 C. goeringii 공주국립대학교 경북 포항시 호미곶 고금산 동호사
21 KNU-074 C. goeringii 공주국립대학교 경남 거제시 연초면 오비리
22 KNU-048 C. goeringii 공주국립대학교 경북 포항시
23 KNU-055 C. goeringii 공주국립대학교 경남 통영 수산과학박물관
24 KNU-051 C. goeringii 공주국립대학교 전북 부안군 부둣가
25 KNU-004 C. goeringii 공주국립대학교 전북 부안군 변산 고사포 해수욕장
26 KNU-060 C. goeringii 공주국립대학교 전남 장흥군 장편면 경림리
27 KNU-015 C. goeringii 공주국립대학교 경남 거제시 법동리
28 KNU-001 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 애월읍 봉성리
29 KNU-063 C. goeringii 공주국립대학교 전남 여수시 돌산도
30 KNU-056 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 제주시 종산간길
31 KNU-042 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 서귀포시 감귤박물관
32 KNU-018 C. goeringii 공주국립대학교 전북 부안군 개암사
33 KNU-057 C. goeringii 공주국립대학교 전남 완도군 구개등
34 KNU-064 C. goeringii 공주국립대학교 전북 남원시 내동 지리산
35 KNU-053 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 제주시 아라동
36 KNU-035 C. goeringii 공주국립대학교 전남 진도군 서망리
37 KNU-012 C. goeringii 공주국립대학교 전남 완도군 당인리
38 KNU-029 C. goeringii 공주국립대학교 전남 영암군 삼호읍 매자리
39 KNU-031 C. goeringii 공주국립대학교 전남 고흥군 외나로도
40 KNU-079 C. goeringii 공주국립대학교 경남 고성군 문수암
41 KNU-047 C. goeringii 공주국립대학교 전북 보안면 월천리
42 KNU-080 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 애월읍 봉성리
43 KNU-041 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 조천읍 대흘리
44 KNU-044 C. goeringii 공주국립대학교 울산시 북구 정자동
45 KNU-075 C. goeringii 공주국립대학교 전남 신안군 암태면 신석리
46 KNU-020 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 성산읍 수산리
47 KNU-061 C. goeringii 공주국립대학교 전남 진안군 조도면 덕절도
48 KNU-073 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 표선면 하천리
49 KNU-066 C. goeringii 공주국립대학교 전남 순천시 승주읍 학구리
50 KNU-069 C. goeringii 공주국립대학교 충남 서산 팔봉산
51 KNU-025 C. goeringii 공주국립대학교 경남 함양군 서산면 상남리
52 KNU-026 C. goeringii 공주국립대학교 경남 산청군 단성면 정촌리
53 KNU-072 C. goeringii 공주국립대학교 전남 영광군 염산면 두우리
54 KNU-032 C. goeringii 공주국립대학교 전남 영광군 불갑면 모악리 불갑사
55 KNU-067 C. goeringii 공주국립대학교 전북 고창군 아산면 삼인리 선운사
56 KNU-033 C. goeringii 공주국립대학교 전남 함평군 함평읍 자평리
57 KNU-027 C. goeringii 공주국립대학교 전남 함평군 대동면 강운리
58 KNU-030 C. goeringii 공주국립대학교 전남 영광군 법성면 법성리 법성포
59 KNU-022 C. goeringii 공주국립대학교 경남 양산시 천성산 서사면 상남리
60 KNU-065 C. goeringii 공주국립대학교 제주도 한림읍 금악리
61 KNU-068 C. goeringii 공주국립대학교 경남 창원시 양곡동
62 KNU-034 C. goeringii 공주국립대학교 경남 마산시 구산면 반동리
63 KNU-005 C. goeringii 공주국립대학교 경남 진주시 이반성면 수성리 승가사
64 KNU-081 C. goeringii 공주국립대학교 경남 밀양시 하남읍 파서리
65 KNU-071 C. goeringii 공주국립대학교 경남 남해군 이동면 석평리
66 KNU-028 C. goeringii 공주국립대학교 경남 남해군 창선면 창선도
67 KNU-008 C. goeringii 공주국립대학교 전남 광주시 무등산
68 KNU-006 C. goeringii 공주국립대학교 전북 순창군 순창읍 전통마을
69 KNU-011 C. goeringii 공주국립대학교 전북 남원시 주천면 장안리
70 KNU-037 C. goeringii 공주국립대학교 전남 장성군 장성읍 중앙 초등학교
71 KNU-013 C. goeringii 공주국립대학교 전남 장성군 도암면 대초리 운주사
72 KNU-054 C. goeringii 공주국립대학교 전남 담양군 남면 지곡리 소쇄원
73 KNU-084 C. sinensis 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
74 KNU-085 C. sinensis 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
75 KNU-086 C. sinensis 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
76 KNU-087 C. sinensis 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
77 KNU-088 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
78 KNU-089 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
79 KNU-090 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
80 KNU-091 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
81 KNU-092 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
82 KNU-093 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
83 KNU-094 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
84 KNU-095 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
85 KNU-096 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
86 KNU-097 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
87 KNU-098 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
88 KNU-099 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
89 KNU-100 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
90 KNU-101 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
91 KNU-102 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
92 KNU-103 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
93 KNU-104 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
94 KNU-105 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
95 KNU-106 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
96 KNU-107 C. hybridium 공주국립대학교 농촌진흥청 국립원예특작과학원
증폭된 DNA 단편들의 크기를 측정하기 위해 Schuelke의 M13-tail PCR법(Schuelke M., Nature Biotechnology, 18:233-234, 2000)을 이용하여 DNA 단편을 증폭하였다. 각각의 PCR 반응 혼합물 (20㎕)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 심비디움 주형 DNA 40ng, 정방향 프라이머 0.2μM, 역방향 프라이머 0.6μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT, 서열번호 37) 0.6μM, 1X PCR 반응액 (10mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 Tm(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 45초; 및 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 1분의 조건으로 10회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5㎕, Hi-di 포름아미드(formamide) 9.2㎕, 내부 크기 표준시약(Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3㎕을 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.
그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 조 재배형 및 조 품종들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 14쌍을 확인하여 KNU-CC-42 (서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-32 (서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-43 (서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-Slt-019(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-34 (서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-40 (서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-52 (서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-01 (서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-71 (서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-76 (서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-30 (서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-25 (서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-35 (서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), KNU-CC-203 (서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다(표 1 참조).
KNU-CC-42 프라이머쌍은 96개 품종의 심비디움 속 식물들에서 110-248bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 15개였다. KNU-CC-32 프라이머쌍은 114-248 bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 25개였다. 또한 KNU-CC-43 프라이머쌍은 135-295bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 대립 유전자의 수는 20개였다. KNU-CC-34 프라이머쌍은 169-243bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 7개였다. KNU-CC-40 프라이머쌍은 140-260bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 14개였다. KNU-CC-52 프라이머쌍은 230-288bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 8개였다. KNU-CC-01 프라이머쌍은 123-181bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 11개였다. KNU-CC-71 프라이머쌍은 105-342bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 14개였다. KNU-CC-76 프라이머쌍은 103-287bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 19개였다. KNU-CC-30 프라이머쌍은 116-284bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 12개였다. KNU-CC-25 프라이머쌍은 122-266bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 7개였다. KNU-CC-35 프라이머쌍은 119-263bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 25개였다. KNU-CC-203 프라이머쌍은 136-380bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰으며, 관찰된 대립 유전자의 수는 25개였다.
실시예 6: SSR 마커를 이용한 계통 분석
상기 실시예에 의해 분석된 다형성 결과를 바탕으로 심비디움 품종들 사이에서의 계통유연관계를 조사하였다. PowerMarker에 포함된 MEGA4 소프트웨어(Tamura et al. 2007)를 이용하여 뿌리 없는 계통도(unrooted phylogram)를 작성하였다. 쌍을 이루는 품종들간의 각각의 유전적 거리는 유전적 분석 패키지 POPGENE Version 1.31 (Yeh et al. 1999)을 이용하여 분석하였다.
앞서 분석된 다형성으로부터 96개 심비디움 품종들 사이의 계통유연관계를 분석한 결과, 도 1에 나타나듯이, 본 발명의 SSR 프라이머에 의해 심비디움 품종이 그들의 특성에 따라 명확하게 식별됨을 확인할 수 있었다.
<110> Kongju National University Industry-University Cooperation Foundation <120> SSR primer derived from Cymbidium spp. and use thereof <130> P101214 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-42 foward primer <400> 1 gggatgagaa caacaaacag a 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-42 reverse primer <400> 2 tcttccgctg gatctcaa 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-32 foward primer <400> 3 aaaaccttga tcctcacaag a 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-32 reverse primer <400> 4 tgggtcgaca tgatctgtt 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-43 foward primer <400> 5 tcgctgcgcc tatacagt 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-43 reverse primer <400> 6 ctcagctgtt gcctccac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-34 foward primer <400> 7 gcggatgccc actataca 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-34 reverse primer <400> 8 gctcctcttt gagtttggg 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-40 foward primer <400> 9 aagctctgtc ttcatccttc aa 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-40 reverse primer <400> 10 tggtgtggag agaggttttt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-52 foward primer <400> 11 gaattttgct gtccgctg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-52 reverse primer <400> 12 ggcgtgttcg tgttgaat 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-55 foward primer <400> 13 aaggttgcat tttccctca 19 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-55 reverse primer <400> 14 actaggtggg gtcggcta 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-01 foward primer <400> 15 cagaggtatt gcagggga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-01 reverse primer <400> 16 ccgttaggga ttgggttt 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-71 foward primer <400> 17 gatttcagcc ctcggagt 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-71 reverse primer <400> 18 actaggtggg gtcggcta 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-76 foward primer <400> 19 gaatttggct ggtggtga 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-76 reverse primer <400> 20 ttgtcctctt gctcccaa 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-30 foward primer <400> 21 ttcatatagc cgacccca 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-30 reverse primer <400> 22 gcaagagaag ggcgaatt 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-25 foward primer <400> 23 cgatcccctc ttacccac 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-25 reverse primer <400> 24 gtgggtgcaa agagatgg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-35 foward primer <400> 25 tctcaggcaa tgccgtat 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-35 reverse primer <400> 26 tttgtgtgtg gcattcga 18 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-203 foward primer <400> 27 aacctaatca agggtttcta actc 24 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KNU-CC-203 reverse primer <400> 28 ccacccaaca aagcgata 18 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-11 adaptor <400> 29 ctcttgctta gatctggact a 21 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-12 adaptor <400> 30 tagtccagat ctaagcaaga gcaca 25 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA primer <400> 31 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGC primer <400> 32 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagc 45 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGC primer <400> 33 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggc 45 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAG primer <400> 34 aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaag 45 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAC primer <400> 35 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaac 45 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGG primer <400> 36 aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggagg 45 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 37 tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR(simple sequence repeat) 프라이머쌍.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25과 26로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR 프라이머쌍.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 심비디움 속 식물(Cymbidium spp.)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
  4. (a) 심비디움 속 식물로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출 방법.
  5. (a) 심비디움 및 대조군 심비디움 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 심비디움 및 대조군 심비디움 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 심비디움 속 식물의 품종 동정 방법.
  6. 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 심비디움 속 식물의 DNA 다형성 검출용 키트.
  7. 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 심비디움 속 식물의 품종 동정용 키트.
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