CN110423747B

CN110423747B - 兰属植物ssr引物，及其在居群遗传多样性分析中的应用

Info

Publication number: CN110423747B
Application number: CN201910659929.8A
Authority: CN
Inventors: 李政; 李志能; 寇帅; 眭顺照; 李名扬; 李先源
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: CN110423747A

Abstract

本发明采用SSR分子标记技术在兰花植物中开发并筛选具有特异性强、多态性高的SSR引物，利用筛选出的引物对采集到的来自9个居群的120株兰花基因组DNA进行检测从而分析其遗传多样性以及居群遗传特性。利用磁珠富集法获得91条具有SSR的DNA序列，并成功设计了72对引物用于多态性引物的筛选，最终筛选出8对扩增稳定、特异性强、多态性高的引物。本发明从分子和形态学层面对兰花的遗传多样性进行分析，揭示兰花遗传分化的主要来源，并对在渝贵川采集的9个野生兰花居群进行聚类分析，以此来说明地理位置对兰花居群遗传分化的影响。

Description

兰属植物SSR引物，及其在居群遗传多样性分析中的应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地说，涉及兰属植物SSR标记及其应用。

背景技术

SSR也被称为STMS、SSRP，是一种微卫星标记。该技术也是以PCR技术为基础的，因其需要提前知道样本DNA序列，因此根据序列设计出的引物具有非常强的特异性。微卫星侧翼序列保守，通过PCR扩增后，并通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物以检测多态性。SSR标记的优点：(1)SSR技术是共显性标记，能够区分杂合子、纯合子，可获得较多信息；(2)多态性高、重复性好、稳定性强。缺点是实验成本高，耗时长，需要大量的人力物力，这也是限制SSR标记发展的一个重要原因。虽然SSR标记技术耗时费力，但因其极高的特异性而广受研究者的欢迎。刘艳丽将SSR分子标记应用到鉴别中草药伪品的研究中，SSR的长度差异以及等位基因数目的变化会显示出伪品与正品之间的差异。徐礼羿等采用SSR标记技术评估了大叶种茶树的遗传多样性以及居群结构，构想了大叶种茶树居群可能的来源。

SSR标记普遍并广泛存在于植物基因组DNA中，因其重复单元的长度、数量等存在多态性，因此可以利用这种特性根据SSR序列两翼的保守序列设计引物，采用PCR技术在植物基因组DNA中扩增出具有多态性的DNA序列片段。SSR标记引物具有特异性，因此必须提前获取所研究植物的基因组序列，利用SSR标记搜索工具找到相对应的SSR标记，才能够设计出成对的具有特异性的SSR引物，因此SSR标记的开发是SSR分子标记技术的难点。由郭大龙对开发SSR标记的方法总结归纳得出：(1)从公共的DNA序列数据库或者已经发表过的文章中获取SSR两翼的保守序列和引物，这种方法最省时省力，也大大缩小了经济成本，但是由于物种基因组信息的缺乏，已获得的序列信息并不能满足SSR引物设计的需求，因此此方法不具有长远性。(2)相同标记实现物种间共用。如在大豆、水稻中获得的专一性SSR引物同样可以应用于柑橘属、芸薹属、猕猴桃属。但目前仍没有确定微卫星引物在不同类群中推广的标准。(3)构建基因文库。此方法技术路线成熟，并且在开发微卫星标记中使用最多的方法。此方法是提前获知基因组信息的前提下与含有SSR的生物素化的探针杂交，检测阳性克隆具体基因序列，根据搜索到的SSR标记的两翼保守序列设计特异性引物。此方法微卫星引物获得的效率低，但是操作简单，易于理解，是开发微卫星引物的经典方法。(4)富集法，即建立微卫星富集文库从而提高阳性克隆的获得率。此方法可分为两种，一种是引物富集法，即利用含有SSR的引物进行微卫星富集；另一种是杂交富集法，即利用含SSR的探针进行微卫星富集。近些年来，采用杂交富集法开发微卫星引物的研究颇多，该方法又分为尼龙膜法和磁珠富集法，尼龙膜法是利用吸附在尼龙膜上的微卫星探针来富集基因组DNA中的微卫星序列，洗脱富集到的片段，进行PCR扩增，连接载体并转入到大肠杆菌，从而挑取阳性克隆进行测序；相比之下，磁珠富集法更受广大研究者的青睐，此方法是先用生物素标记的重复序列的探针与经过酶切后的基因组DNA杂交，因生物素与链霉亲和素有较强的亲和性，因此利用含有链霉亲和素的磁珠与杂交液充分混合，从而利用磁力将含重复序列的目标片段进行富集，从而大大提高了重复序列片段的获得率。富贵等采用磁珠富集法开发微卫星片段，共获得阳性克隆克隆236个，选取其中80个进行测序，其中68条序列为唯一序列，选择40条含有SSR位点的序列成功设计出40对引物，经过筛选，最终获得了20对扩增稳定、多态性高的引物，成功率达到50％。王久利等在开发青藏高原特有珍贵植物西川红景天(Rhodiolaalsia)微卫星标记的研究中利用FIASCO磁珠富集法共获得2500个阳性克隆，随机挑选其中200个阳性克隆进行测序，获得105个含有微卫星位点的序列，并成功设计引物105对，经筛选获得了13对多态性高、稳定性强的引物，并利用这些引物对西川红景天的居群结构进行了进一步研究。(5)省略筛库法，这种方法不需要刻意筛选含SSR的克隆，所获得的SSR在转化成特异性标记时，只需合成一个特异引物，结合已有的锚定引物就可以检测基因组中对应的SSR了。这种方法主要有两种：STMP法和SAM法。这两种方法虽然提高了开发SSR标记的效率，但是操作复杂繁琐。在实际操作过程中如何选择微卫星引物开发方法，需要根据课题的研究方向以及实验室条件来选择。

兰花，是兰科植物的统称，属于被子植物中最大、分布较为广泛的一科，仅次于菊科与豆科且多数为虫媒植物。全世界大约有20000～35000种广泛生存于其他草本植物难以生存的环境，如山岩上、各种落叶枯草覆盖的土壤上甚至树干上，是植物生态多样性中较为独特的重要组成部分。兰科植物在中国大约有将近1300余种，广泛分布于海南、四川、云南、台湾等地，西部高原以及北方温带地区，只有少数种类生存于干旱地区。中国存在很多“世界级”的兰花名品，如独蒜兰属、万代兰属、兜兰属等。按照兰花生活环境的不同，可以将其分为附生兰、地生兰、腐生兰，目前兰花已经被列为濒危植物，《野生动植物濒危物种国际贸易公约》中将所有的兰花品种列入保护的范围内且兰花种群在生物多样性保护中属于重点关注目标。

针对兰花的分类、鉴别，主要从形态学和分子遗传学两方面展开。兰花形态学性状是最主要的分类依据，也是最直接反应种属间差异的参考。形态学性状主要分为宏观形态与微观形态两方面，宏观形态是指直接观察花色、叶片数、花朵大小、习性等指标对兰花进行分类。形态学分类、鉴定虽然能够一定程度上能够区分兰科植物不同种属之间的差异，但这种方法受观察时期、生境的影响较大而具有其局限性。DNA分子标记技术是以植物基因组DNA为基础，能够从本质上反应种属间、种属内的差异，因此采用分子标记技术手段来对兰科植物进行分类、鉴定可靠性较强。目前，分子标记技术应用于兰科植物的有RAPD、RFLP、ISSR、EST-SSR等。RAPD技术因其操作简单、成本低等优点被广大学者采用，甘娜利用RAPD技术检测20份大花蕙兰的遗传多样性，结果显示RAPD技术可以区分所有实验材料，并将其分为4类；RFLP技术是一种操作复杂，实验成本高，但其结果一般稳定性好、可重复性强。武海利用RAPD、ISSR以及RFLP技术3种分子标记对产于贵州的建兰7个种21个品种进行分子鉴定，最终21个品种被分为建兰组和春兰组。ISSR技术相比其它多态性表现较好，因此也被广泛应用于鉴定种质资源方面。卢家仕等将ISSR技术应用到20份兰科植物资源中并将其分为四类，分别为兜兰属、石斛属、兰属和毛兰属。孙叶迎采用ISSR分子标记分析不同花色的灼兰属植物的遗传多样性，并将20个灼兰属植物分为三类，大花杓兰和东北杓兰被聚为第一类，灼兰和山西灼兰被聚为第二类，斑花灼兰单独为第三类。EST-SSR技术能够根据植株形态学所表现出的差异对其特定部位进行SSR的开发，因此该技术开发的SSR标记比普通SSR标记能揭示更多信息。陈程筛选出9对EST-SSR多态性引物并将16个蝴蝶兰品种在遗传相似系数为0.73处分为三类，第一类包括巨宝红玫瑰等10个品种，第二类包括新原美人等4个品种，第三类只包括萨拉黄金一个品种。由于兰花基因组信息缺乏，SSR分子标记难以获取，实验成本高，鲜有看到将SSR分子标记应用到兰科植物的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种兰属植物SSR引物，及其在居群遗传多样性分析中的应用。

首先，本发明提供一种兰属植物SSR引物，其选自下述引物对中的一对或多对，其中，引物对1的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，引物对2的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，引物对3的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，引物对4的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，引物对5的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，引物对6的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，引物对7的序列如SEQ ID No.13和SEQID No.14所示，引物对8的序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

本发明还提供所述的兰属植物SSR引物在兰属植物居群遗传多样性分析中的应用。

本发明还提供所述的兰属植物SSR引物在兰属植物分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种用于兰属植物微卫星标记试剂盒，其含有权利要求1所述的SSR引物。

本发明利用磁珠富集法获得91条具有SSR的DNA序列，并成功设计了72对引物用于多态性引物的筛选，最终筛选出8对扩增稳定、特异性强、多态性高的引物。

8对SSR引物在9个居群120个个体内共扩增出53个等位基因，平均每个位点的等位基因数为6.625个。在物种水平上，兰花居群的多态性位点百分率均较高，平均多态性位点百分率(PPF)为98.6％。各个居群的期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)均不相同，存在差异，兰花居群存在交配不平衡。Shannon信息多样性指数(I)的变化范围为0.8833～1.3557，兰花居群的遗传多样性水平大小依次为：QJ>WX>TR>ZY>TZ>FL>TJ>HS>CZ，重庆黔江(QJ)的遗传多样性最高。

根据9个兰花居群间的遗传距离，采用UPGMA法获得居群遗传聚类图。重庆黔江(QJ)与贵州桐梓(TZ)两居群的遗传距离为0.1596，亲缘关系最近，通江(TJ)和巫溪(WX)的遗传距离为0.7661，亲缘关系最远。在居群遗传距离系数为0.45的条件下，9个居群分为三类，黔江(QJ)、桐梓(TZ)、铜仁(TR)、黄水(HS)四个居群为第一类，涪陵(FL)、通江(TJ)、遵义(ZY)、崇州(CZ)四个居群为第二类，巫溪(WX)单独为第三类，居群之间的遗传关系与地理位置有很大的相关性。

附图说明

图1所示为MseⅠ酶切电泳图。1：样本DNA；2、3：酶切产物；M：DL2000Marker。

图2所示为不同循环数筛选及最佳循环数下的连接产物预扩增电泳图。a:不同循环数筛选图；14、17、20、23、26为循环数；b:最佳循环数电泳图；1、2：最佳反应条件下的扩增产物；M：DL2000Marker。

图3所示为洗液与洗脱液扩增产物电泳对比图。A：与探针一杂交后磁珠富集情况；B：与探针二杂交后磁珠富集情况；1、2分别为洗脱液⑤、⑥，3为洗液④；M：DL2000Marker。

图4所示为阳性克隆部分检测图。图中编号1至14代表挑取的14个菌斑；M:DL2000Marker。

图5所示为不同重复次数碱基重复单元的序列数量。

图6所示为不同类型碱基重复单元的序列数量。

图7所示为利用引物J-92-5筛选兰花SSR最佳反应体系的电泳图。图中编号1至16为正交试验的16个筛选体系；M:DL2000Marker。

图8所示为10个DNA样本筛选特异性、多态性强的部分电泳图。图中编号1-6、10：蕙兰，7：春兰，8：豆瓣兰，9：多花兰；电泳图中筛选的3对引物依次是YW-19、YW-13、J-8-15；M:DL2000Marker。

图9所示为引物YW-13对部分兰花基因组DNA的扩增电泳图。编号1-31代表采集到的兰花样本，其中1-7、9、13、28为春剑，8、22、25为夏兰，10、14-19、21、23、24、29为蕙兰，11、12、20、26、27、30、31为春兰。

图10所示为基于遗传距离的9个居群的遗传聚类图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecμlar cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1兰属SSR引物的开发及筛选

实验材料

2017年4月，在已经收集好的不同居群的兰花盆栽中随机选取了42株野生兰花用于SSR标记的开发与筛选，其中有30株是来自重庆市东南部黔江区，6株来自重庆市东北部巫溪县，6株来自贵州省遵义。随机选取其中一株长势较好，性状较稳定的兰花植株(即2号样本)作为开发SSR标记的来源植株，选取前10号兰花样本(含2号样本)用于筛选多态性引物，植株材料的详细信息列在表1。

表1引物开发所使用的材料

编号	采样材料品种	样本来源地
			1-6、10	蕙兰(Cymbidium faberi)	重庆市黔江区
7	春兰(Cymbidium goeringi)	重庆市黔江区
			8	豆瓣兰(Cymbidium serratum Schltr)	重庆市黔江区
9	台兰(Cymbidium floribundum Lindl)	重庆市黔江区

引物的开发

基因组DNA酶切与产物连接

(1)基因组DNA酶切

用MseⅠ对基因组DNA进行酶切，酶切体系为25μL，酶切体系:MseⅠ(5U/μL)1μL、10×buffer2.5μL，DNA(500ng/μL)2μL，剩余用双蒸水补齐，37℃酶切2h，使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行效果检测。

图1所示为两管DNA酶切电泳图，从图中可以看出，1、2标记的为酶切后效果，经过MseⅠ酶切产生了100到1000的弥散带，说明基因组DNA酶切效果完全，其中大于200bp的弥散带属于实验最佳使用范围。

酶切产物连接

连接体系为30μL，含酶切产物15μL，MseⅠ接头3uM，T₄DNA ligase(5U/μL)0.2μL、T₄buffer3μL，不足30μL的体积用ddH₂O补充，21℃，过夜连接。MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’。

连接产物预扩增与纯化

(1)连接好的产物用双蒸水稀释10倍以用来进行预扩增。

(2)预扩增。预扩增体系为20μL体系，taq DNA Poly buffer2μL，taq DNA聚合酶(5U/μL)(含mg²⁺)0.16μL，MseⅠ-N primer2μL，dNTPs(2.5μM)1.6μL，稀释的连接产物5μL，不足20μL的体积用ddH₂O补充；预扩增的程序为：94℃30s，53℃60s，72℃60s，循环数需要优化，分别尝试14c、17c、20c、23c、26c，没有常规变性步骤和最有一部延伸。MseⅠ-N引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N＝A，T，C，G。1％的琼脂糖凝胶电泳检测，从而确定最佳循环数。

图2中a为不同循环数下的连接产物预扩增电泳图，由图可知在14个循环下，弥散带分布范围大约在250bp到500bp，虽可以进行后续实验但可用范围较小，而在17、23、26个循环下，DNA弥散带分布不均匀，因此，选择20个循环为最佳反应循环数，弥散范围为250bp～1000bp，分布均匀，效果较好。图2中b为在最佳反应条件下两管连接产物预扩增电泳图，从图中明显看出弥散带长度均大于250bp，且弥散较均匀。

确定最佳循环数后，重新扩增一次，获得浓度较高的扩增产物。之后利用DNA纯化试剂盒纯化扩增产物。

生物素探针杂交和磁珠富集

选择5端生物素化的探针：(AC)₁₅，(AAG)₈，杂交体系为250μL体系20×SSC 52.5μL，10％的SDS1.75μL，探针(10pmol)分别为10μL，6.5μL的纯化后的扩增产物，不足体积用ddH₂O补充至250μL。95℃恒温水浴锅变性5min，58℃(AC探针)和48℃(AAG探针)分两管复性，水浴1.5-2h。

磁珠富集

(1)取600μL磁珠于1.5μL离心管，轻弹管底，使磁珠重悬，用磁场吸附磁珠，小心去上清；

(2)300μL的TEN₁₀₀重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清。重复两次，每次5min；

(3)移去磁铁架，重悬于100μL的TEN₁₀₀；

(4)DNA-探针混合物用600μL的TEN₁₀₀溶液稀释，然后加入盛有磁珠的离心管中，室温温浴30min，期间轻弹管底；

(5)磁铁架吸附磁珠，去上清，同时打开95℃水浴锅；

(6)松弛性洗涤：500μL的TEN₁₀₀轻柔冲洗磁珠，每次5-8min，洗完用磁铁架分离，上清液保留。重复2次并记为洗液①、洗液②；

(7)严谨性冲洗：500μL的严格洗液(0.2×SSC，1％SDS)冲洗磁珠，每次5-8min，洗完用磁铁架分离上清液，上清液保留，重复两次并记为洗液③、洗液④；

(8)DNA洗脱液1：在盛有磁珠的1.5ml的离心管中加入50μLTE，95℃水浴5min，迅速用磁铁架分离上清，并记为洗脱液⑤；

(9)重复(8)，并记为洗脱液⑥；

(10)保留洗液④，洗脱液⑤、⑥，分别加入10％体积的3M的乙酸钠，混匀；

(11)加入1体积的-20℃预冷的异丙醇，室温过夜沉淀；

(12)12000转，4℃离心30分钟，非常小心的弃上清，加上500μL的75％乙醇，上下颠倒小管；

(13)12000转离心15分钟，倒掉乙醇，DNA样室温干燥，并用50μL双蒸水溶解；

(14)以洗液④、⑤、⑥作为DNA模板，使用筛选好的预扩增反应体系分别进行PCR，1％检测胶检测扩增产物；

(15)以最后一次洗液即洗液④为对照，验证洗脱液⑤、⑥的洗脱效果。

图3为通过磁珠富集后产生的洗液④，洗脱液⑤⑥经PCR扩增后的的对比图，DNA洗脱液即为富集在联袂亲和素磁珠上的单链DNA片段，而洗液为未被磁珠富集上的DNA片段，洗液DNA浓度越低，说明在磁珠上洗脱下来的DNA片段纯度越高。由图中可知，与探针一((AC)₁₅杂交后DNA富集洗脱效果(A)比与探针二(AAG)₈杂交后DNA富集洗脱(B)好，但两种结果都可以进行后续实验。阳性克隆的筛选与测序

(1)用纯化试剂盒纯化扩增产物，并将扩增产物与19T载体4℃过夜连接，用热激法将连接产物转入TOP10大肠杆菌感受态细胞中，并将大肠杆菌感受态细胞涂满整个LB固体培养基平板(含氨苄青霉素)，37℃培养过夜；

(2)挑取白色菌落于液体LB培养基中，37℃摇床震荡过夜至液体浑浊；

(3)取振荡浑浊的液体进行菌液检测，检测体系为15μL，mix7.5μL，M₁₃-F 0.15μL，M₁₃-R 0.15μL，DNA 2μL，其余体积用双蒸水补齐，反应程序为：94℃，5mins[95℃1min，50℃90s，72℃90s]35cycles，72℃，7mins。

(4)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测菌液验证扩增产物，凝胶成像系统进行图片拍摄，选择条带大小在500bp-1000bp的菌液送擎科生物技术有限公司测序，使用M13⁺进行正向测序。

由以上富集结果可知，DNA洗脱液的电泳条带均大于200bp，符合期望条带大小将以上两种探针下⑤⑥DNA洗脱液的扩增产物与19T载体连接并转入感受态细胞，挑取片段大小在500-1000bp的阳性克隆用于测序，图4为菌液检测结果选择图中大于500bp的菌液检测显示为阳性的单克隆进行测序。

将已挑取的127个阳性克隆进行测序，去除冗余部分，最终获得97条序列含有SSR，在这些SSR序列中共搜索到150个SSR位点，选择其中SSR长度大于10bp的序列(两碱基重复次数不小于5，三碱基重复次数不小于4，四碱基重复次数不小于3，五碱基的重复次数不小于2)有64条，图5为64条序列中单位碱基不同重复次数下的序列条数，从图中可以看出，碱基重复单元在5到10次之间的数量最多为34条，大于15次的数量最少为6条。图6为不同碱基重复单元类型的数量的柱形图，明显可以看出，两碱基碱基重复单元类型的数量最多，为37个(57.8％)，三碱基的重复单元类型的数量为20个(31.3％)，四碱基和五碱基的数量最少，分别为6个(9.4％)和1个(1.6％)。这也符合文库富集前DNA与探针(AC)₁₅、(AAG)₈杂交理论上应该出现的结果。

引物的合成

在NBCI网站上将测序回来的DNA序列去除载体、接头以及同源序列，将SSR-Hunter软件搜索所得序列的SSR，将核苷酸重复基序分别设为2、3、4、5，其中最低的重复数分别定为6、5、4、3、2，剔除掉重复的SSR位点，根据SSR两翼的保守序列利用Primer5.0设计引物，并送成都市擎科生物科技有限公司引物合成部合成，引物设计严格按照引物设计原则。

兰花SSR反应体系的筛选

设计4水平4因素正交试验对体系进行优化来筛选特异性强的引物。表2，表3为正交设计实验各因素水平及相应反应体系。任选一对能用琼脂糖凝胶电泳跑出目的条带但特异性不强的引物来筛选最佳体系。本着条带明亮、清晰、特异性强、电泳图背景干净、节约实验试剂成本为选择标准，采用给各组条带打分的方式来确定最终的体系组合，分数设置为1～16分，其中最高分为最佳反应体系，反之最低分为最差反应体系。各引物的退火温度根据各自的Tm值最终确定。

表2兰属SSR反应体系的正交设计因素水平

单位：μL

表3根据兰花正交设计因素水平相对应的反应体系

单位：μL

不同植物的SSR-PCR的反应体系不同，要找到适合所研究植物的最佳PCR反应体系是后续筛选引物的关键。PCR体系中任何一个因素的改变都可能引起扩增效果的不同。根据表3所设计的4×4正交试验，琼脂糖凝胶电泳图显示的扩增效果如图7，16个反应的得分结果为：9，13，13，15，1，6，11，11，4，1，2，13，1，7，1，7。从得分情况来看，第四个反应体系为最佳反应体系，即Taq DNA polymerase(5U/μL)0.20μL，dNTP(10mmol/L)0.4μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA(50ng/μL)1μL，mg²⁺(25mm)0.4μL，其余体积用双蒸水补齐。

由于设计的引物较多，为了提高筛选效率，选取4个DNA样本(包括2号样本)，并按照筛选出来的最佳体系，筛选条带清晰、扩增稳定的引物；然后利用10个样本，其中2号样本扩增条带为标准带，在扩增条带清晰度和稳定性高的引物中筛选多态性高的引物用于后续试验。目前由于兰属植物的倍性非常混乱，因此以引物来源样本的带型为标准带，其它样本的带型均对照标准带进行读带。判定引物是否有多态性的标准：(1)若与标准带带型一致，视为没有多态；(2)主带型在标准带大小不一致，且偏离标准带50bp范围内，判为特异性扩增；(3)主带型模糊不清，数量过多或没有主带以及有主带但与标准带相差超过50bp的为非特异条带。

图8为10个DNA样本筛选出的3对引物的电泳图，从图中可知，3对引物均存在非特异条带，但是其目的条带清晰且有较强的多态性和特异性，符合引物筛选标准。经过两次聚丙烯酰胺凝胶电泳的筛选，在72对引物中，初筛筛选出了10对目标引物(表4)，复筛筛选出8对特异性和多态性强的引物分别为YW-19，J-7，J-8，J-92-5，J-8-15，KK-5，KK-22，YW-13。

表4筛选出的10对引物的具体信息

从表5中可知，8对SSR引物在120个个体(材料具体信息见实施例2)内共扩增出53个等位基因，平均每个位点的等位基因数为6.6250个，其中扩增出等位基因数最多是引物YW-13(图9)，共扩增出11个等位基因。相反，扩增出等位基因最少的引物是J-8，共扩增出4个等位基因。平均有效等位基因为4.1680，有效等位基因最大的为YW-13，最小的为J-7。所有位点的观测杂合度为0.0769～0.6050，平均值为0.3165，期望杂合度的范围为0.3171～0.8697，平均值为0.7009.期望杂合度与观测杂合度的值相差较大，排除取样时产生的误差，说明了兰花个体间的交配不是随机的，存在交配上的不平衡现象。Nei′s多样性指数H的范围为0.3158～0.8661，均值为0.6979，说明所筛选出的引物在兰花的居群中表现出了较高的多态性，也表明了兰花在物种水平上存在较高遗传多样性。

表5 8个SSR位点的遗传多样性分析

实施例2基于SSR分子标记的兰花居群遗传多样性

2018年4月，再次取样78株，取样地点、取样方式与实施例1的材料地点相同，但每个样本均取自不同于实施例1中样本取样的植株，结合第一次取样，共有120个不同单株的兰花样本参与实验。120个样本分别来自重庆市、四川省和贵州省三个省份的不同居群，样本具体信息见表6。分别取每个植株健康叶片，用干净的布将叶片上的尘土擦拭干净，并用剪刀减碎叶片，包于带有标号的锡箔纸中，并于-80℃冰箱中保存。

表6实验材料基本信息

居群名称	个体标号	样本数
			黔江(QJ)	1-53	53
巫溪(WX)	54-62	9
			黄水(HS)	63-69	7
涪陵(FL)	70-75	6
			通江(TJ)	76-82	7
遵义(ZY)	83-89	7
			铜仁(TR)	90-101	12
桐梓(TZ)	102-114/	13
			崇州(CZ)	115—120	6

提取采集的材料的DNA，并将其浓度全部统一稀释至50ng/μL，根据实施例1筛选出的8对多态性引物，采用已优化的体系，利用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来对120份材料全部进行检测。

将每对引物的电泳图谱统一标准，并按照分子量大小，将每对引物扩增图谱中分子量最大的条带记为A，次大的记为B，再次的记为C，以此类推，D、E、F……，将图谱中显示一条带的看做纯合子，记为AA，BB，CC等形式，两条带的看做杂合子，记为AB、BC等形式。用EXCEL表将120个样本的基因型全部统计完后，按照POPGENE32软件的数据格式输入软件进行数据分析，获得一系列数据指标，包括等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、Shannon信息多样性指数(I)、多态位点百分率(PPF)、居群间遗传距离、遗传一致度、莱特固定指数(Fis)、基因分化系数(FST)、基因流(Nm)等。根据POPGENE32软件计算出的Neiˊs遗传距离，利用NTsys2.10软件的SAHN Clustering进行不加权平均配组法(UPGMA)对9个兰花自然居群进行聚类，并绘制树形聚类图。由于重庆市黔江的样本较多，大约为其他居群的3倍，为了实验的严谨性，因此在数据处理上，分3次随机抽取黔江居群的20个基因型，与其他8个居群的基因型一起输入POPGENE32软件进行数据分析，并分别用UPGMA法做居群聚类图，以此来验证最初的数据分析结果以及居群聚类分析结果。

1. 9个兰花自然居群的遗传多样性分析

表7为Popgene32软件分析结果，结果显示8对SSR引物在9个野生居群的扩增呈现丰富的多态性。在物种水平上，9个兰花居群的多态性位点百分率均较高，除去四川省崇州的多态性位点百分率为87.5％，其余8个居群均为100％，因此平均多态性位点百分率为98.6％。兰花各居群的平均等位基因数(Na)为3.917，平均有效等位基因(Ne)为2.748，其中重庆市黔江(QJ)的Na和Ne最大，分别为6和3.698；四川省通江县(TJ)和崇州(CZ)的Na相同，分别为3.375；重庆市黄水镇(HS)的Na和Ne最低，为3和2.2384。各个居群的期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)均不相同，存在差异，说明兰花居群存在偏离，个体间不是随机交配的，存在交配不平衡，其中重庆黔江(QJ)的(He)最高为0.6595，重庆黄水(HS)的(Ho)最高为0.4107，四川崇州(CZ)的(He)最低为0.5133，重庆巫溪(WX)的(Ho)最低为0.2413。Shannon信息多样性指数(I)常用作评价遗传多样性的重要指标，分析可知，(I)的变化范围为0.8833～1.3557，由此可得9个兰花居群的遗传多样性水平大小依次为QJ>WX>TR>ZY>TZ>FL>TJ>HS>CZ，重庆黔江(QJ)的遗传多样性最高。

表7基于8对SSR引物的9个野生兰花群体的遗传多样性水平

2.兰花自然居群的遗传聚类分析

根据9个兰花居群间的遗传距离(表8)，采用UPGMA法获得居群遗传聚类图(如图10)。从图中可以看出，重庆黔江(QJ)与贵州桐梓(TZ)两居群的遗传距离为0.1596，亲缘关系最近，通江(TJ)和巫溪(WX)的遗传距离为0.7661，亲缘关系最远。在居群遗传距离系数为0.45的条件下，将9个居群分为三类，黔江(QJ)、桐梓(TZ)、铜仁(TR)、黄水(HS)四个居群为第一类，涪陵(FL)、通(TJ)、遵义(ZY)、崇州(CZ)四个居群为第二类，巫溪(WX)单独为第三类。

表8居群间遗传相似度和遗传距离的Nei无偏估计值

居群	QJ	WX	HS	FL	TJ	CZ	ZY	TR	TZ
										QJ	****	0.6473	0.7484	0.6567	0.6916	0.6832	0.7730	0.8468	0.8525
WX	0.4349	****	0.4824	0.6683	0.4648	0.5176	0.7010	0.5376	0.6137
										HS	0.2898	0.7289	****	0.5808	0.5547	0.5458	0.5265	0.7236	0.5721
FL	0.4205	0.4030	0.5433	****	0.8340	0.6389	0.7745	0.5726	0.6855
										TJ	0.3687	0.7661	0.5894	0.1815	****	0.6862	0.8065	0.5404	0.6640
CZ	0.3809	0.6585	0.6055	0.4480	0.3765	****	0.6788	0.4920	0.7783
										ZY	0.2574	0.3552	0.6415	0.2556	0.2150	0.3874	****	0.6219	0.7100
TR	0.1663	0.6207	0.3235	0.5576	0.6154	0.7094	0.4749	****	0.7081
										TZ	0.1596	0.4883	0.5584	0.3776	0.4094	0.2506	0.3424	0.3452	****

注：*上为遗传相似度，*下为遗传距离

3. 3次重复抽样的验证结果分析

表9为3次在黔江区取样并分析的结果，因只有黔江样本数发生变化，分析结果只有黔江与初始结果有差异，故表中只列出了关于黔江区3次重复的数据。初始结果结合三次重复可知(遗传相似度和遗传距离的Nei无偏估计值表和居群聚类结果见附录)，黔江居群的多态性位点(NPF)、多态性百分比(PPF)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon信息多样性指数(I)均最高，说明黔江的多样性高于其它居群，黄水的观测杂合度最高为0.4107，巫溪的期望杂合度和黔江的相近，说明两居群的多态性比例相近。由聚类结果可知，在距离系数为0.45的条件下可将9个居群分为三类，黔江和桐梓、铜仁两个居群的亲缘关系最近，并且这三个居群与黄水并为第一类，涪陵和通江亲缘关系最近并与遵义、崇州并为第二类，在不同的取样条件下，崇州和桐梓也会被并为一类，说明两类之间存在交叉，桐梓和崇州以及黔江的遗传距离相近。巫溪独分为一类，说明巫溪与其它居群的遗传距离较大，亲缘关系较远，这可能是因为巫溪的地理位置决定的。这样的分类与居群之间的地理位置有着很明显的关系，黔江(QJ)、桐梓(TZ)、铜仁(TR)、黄水(HS)四个居群地理位置较集中，都属于重庆中南部与贵州北部，两省位置接壤，通江、涪陵、遵义、崇州在在地理位置上属于渝贵川西部，而巫溪(WX)处于重庆东北部，与其他居群的位置相隔较远，这样以不同方向划分的区域的聚类结果极有可能是因为气候环境、土壤成分、光照强弱等在这些区域不同导致的。因此野生兰花居群类群的划分受其地理因素的影响较大。

表9基于8对SSR引物的重庆黔江(QJ)居群3次随机抽样的遗传多样性水平

4.兰花居群的遗传分化分析

由表10可知，兰花自然居群的基因分化系数(FST)的变化范围为0.1268～0.3465，居群的平均分化系数为0.2003，这表明兰花9个居群79.97％的遗传分化存在于居群内，20.03％的遗传分化存在于居群间，说明居群内的变异高于局群间。基于Fst测得基因流(Nm)的范围为0.4714～1.7213，平均值0.9979，Nm<1，说明遗传漂变在兰花的遗传分化中起一定的作用。

表10对SSR引物位点的种群遗传分化系数和基因流

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 兰属植物 SSR引物，及其在居群遗传多样性分析中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 1

agggagattt tggctcatgg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 2

caacacacca cacttagccc g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 3

gctttatgcg acatctgc 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 4

cgtcggttcc atgcacatc 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 5

aaactaagaa aactacagag aaagg 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 6

cccgagaata aatcagagag g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 7

gagtagtgtg tttggggcat t 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 8

ttgtccagcc attgagagg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 9

ccatctatct cccttcgctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 10

gcgtgagtta cggctagctt 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 11

tggttcatca ctgctgttat cg 22

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 12

tcattgggtt atgcttccg 19

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 13

ctgttggtat gtcctgactt tagc 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 14

gcagcataca tctcatatcg tacc 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 15

agggagattt tggctcatgg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 16

caacacacca cacttagccc g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 17

gcacaaggga aatcatcaac 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 18

atcatcctgt gtgtgtgtgt gt 22

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 19

attgatgagt cctgagtaag gttgg 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 20

gctatccctt tgatgttggt agact 25

<210> 21

<211> 14

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 21

tactcaggac tcat 14

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 兰花(Cymbidium sp.)

<400> 22

gacgatgagt cctgag 16

Claims

1.一种兰属植物SSR引物，其特征在于，选自下述引物对中的一对或多对，其中，引物对1的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，引物对3的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，引物对4的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，引物对5的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，引物对6的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，引物对7的序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，引物对8的序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

2.权利要求1所述的兰属植物SSR引物在兰属植物居群遗传多样性分析中的应用。

3.权利要求1所述的兰属植物SSR引物在兰属植物分子标记辅助育种中的应用。

4.一种用于兰属植物微卫星标记试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的SSR引物。