CN104450932A - 稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，所述分子标记Pi2SSR是通过引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记。本发明是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SSR标记，具有特异性高、低成本、高通量的优点，能广泛应用于遗传背景不同的群体中。

Description

稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR及其方法与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病害是对水稻生产危害最严重的病害之一，几乎每年都会造成严重的粮食损失。长期的生产实践表明，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的方法。况且由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的3～5年时间里逐渐丧失，因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。常规抗性基因分析方法需要大量的接种鉴定、抗性遗传及基因等位性分析工作，并且由于不同抗性基因在抗谱上有一定的重叠性，因此常规接种鉴定方法不足以准确、真正地反映出水稻品种的基因型。近一、二十年来，随着水稻抗病分子遗传学的发展，众多的抗性基因得以被精细定位或被克隆，SSR等连锁分子标记的应用大大促进了抗性基因遗传背景的鉴定以及抗病多基因聚合育种的发展(Hittalmaniet al.,2000；Jena and Mackill,2008)。另一方面，基因克隆的结果显示抗病基因往往是成簇存在，且不同复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种材料的功能抗病基因(Zhou et al.,2006；Ashikawa et al.,2008；Yuan et al.,2011；Zhaiet al.,2011；Hua etal.,2012)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。

近年来，有关于Pi2/Pi9等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，王倩等(2012)发现该位点的基因是东北各地区抗性最好、抗谱最广的抗源。张学堂等(2010)和曾凡松等(2011)在各自的研究中也证实Pi2/Pi9等位基因是当前优良的抗性基因。Zhou等(2007)和Dai等(2010)通过对Pi2/Pi9等位位点在5个栽培种及4个野生种的对比研究表明，该位点的基因组结构高度保守，其所属的NBS-LRR类LRR区受到过强正向选择。目前该抗性位点上至今已至少发现有7个不同抗谱的抗性基因(Liu et al.2010；Zhu er al.2012)，并且有至少5个抗性基因的研究比较清楚，它们分别为Pi2、Piz-t、Pi9、Pi-gm和Pi-50(t)(Qu et al.2006；Zhou etal.2006；Deng et a1.2006；Zhu et al.2012),其中Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96％(Qu et al.,2006；Zhou etal.，2006)。Pi2抗谱相当广，对从中国收集的792个稻瘟小种中的绝大部分表现抗性，只有7.55％的小种能侵染携带Pi2的亲本C101A51(Chen et al,2001)，此外，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性(Liu et al,2002)。已有研究开发出一些与Pi2连锁的基于PCR技术的分子标记和基于Pi2基因的dCAPS标记(吴金红等,2002；Jiang等,2012；华丽霞等，2013),用于分子标记辅助选择(MAS)育种或品种鉴定工作。然而，前者由于位于抗性基因Pi2的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况；后者需要酶切验证,不方便大规模抗性育种鉴定。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi2应用到水稻抗性育种工作中，有必要将两者的优势结合起来，开发出准确有效的Pi2特异性分子标记显得尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明目的之一在于提供一种稻瘟病抗性基因Pi2基因功能特异性分子标记Pi2SSR。

本发明目的之二在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的检测方法。

本发明目的之三在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记

Pi2SSR，是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记；

SEQ ID NO.1(5’-3’):GCAGCGGCTAGGGTTTATC；

SEQ ID NO.2(5’-3’)：CACCCAGCAACTGATTTGTCA；

所述的水稻品种为C101A51；

优选的，一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的方法，包括以下步骤:

(1)通过常规PCR法扩增，获得多个Pi2等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；

(2)将步骤(1)所得的序列对比，得到Pi2抗性基因所特有的一处2-4个碱基的差异；

(3)根据步骤(2)所获得的差异核苷酸片断，设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并用该引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片断；

(4)对步骤(3)所获得的核苷酸片断在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi2抗性基因的功能特异性的分子标记Pi2SSR。

进一步优选，

步骤(3)中所述的水稻品种包括抗性品种C101A51(Pi2)、抗性品种IRBL9-W(Pi9)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。

步骤(3)中Pi2SSR的57bp设计特异性下游引物SEQ ID NO.2,而在其上游53bp处设计特异性上游引物SEQ ID NO.1；

步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下：

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

取适量PCR产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180v，1小时。扩增所得到的PCR产物大小为110bp,即为抗性基因Pi2的特异性分子标记。

一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供的分子标记特异性高:Pi2所在的基因组区域存在着包括Pi2在内的至少6个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源，彼此之间在核苷酸水平上的序列一致性范围为71.8％～98.6％(Qu et al.,2006.The broad-spectrumblast resistancegene Pi9encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeatprotein and is a member ofamultigene family in rice.Genetics,172:1901-1914.)；此外，Pi2与该位点上已经克隆的稻瘟病抗性基因Piz-t、Pi9在氨基酸水平上的序列一致性都为96％(Zhou et al.,2006.The eightamino-acid differences within threeleucine-rich repeats between Pi2and Piz-tresistance proteinsdetermine theresistance specificity to Magnaporthe grisea.MPMI,99:1216-1228.)。本发明提供的分子标记是本发明发明人经过不断的进行序列多态性搜查并通过实验验证得到的，能明显地将Pi2与存在于该基因组区域内与Pi2高度同源的旁系同源基因进行区分；也能能成功区分Piz-t、Pi9、Ρi2以及被定位在Pi2/9位点上的其它稻瘟病抗性基因。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量:目前，常规SSR标记检测一般距离基因较远，准确度差；SNP检测法大部分成本高，速度慢。本发明提供的分子标记只需PCR，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

(3)本发明是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SSR标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将Pi2与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因(Piz-t,Pi9,Ρi26,Pigm)区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供的Pi2特异性分子标记Pi2SSR是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记。本发明可应用于Pi2转基因鉴定，基因聚合以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi2基因内部，因此对Pi2的筛选能力理论值可达100％，这样的筛选能力优于已报道的与Pi2连锁的分子标记。

(4)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi2连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本发明适用于任何遗传背景下的转基因育种，基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。

有益效果：本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记具有重要的应用价值，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。

附图说明

图1是具有Pi2特异性的与4个抗性等位基因及2个感病等位基因的序列对比图；“-”表示Pi2SSR特异性位点的改变。

图2是Pi2特异性分子标记Pi2SSR在21个水稻品种中的验证结果图。

其中:泳道I～21的DNA模板依次为:抗性基因供体品种C101A51(Pi2)、IRBL9-W(Pi9)、9311、T55B、花1B、珍汕97B、博B、冈46B、29B、D702B、优IB、绵香1B、陆财号、粤丰B、培矮64、IR58025B、辐恢838、特青、成恢448、苏御糯、特特普。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均属于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1：Pi2基因特异性分子标记及其引物设计与检测

(1)Pi2特异性SSR差异位点的分析

从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi2及Pi9水稻供体品种的部分基因组序列(Genebank收录号分别为:DQ352453,DQ285630)以及测序品种日本晴(Nipponbare)、9311相对应区域的基因组序列，针对Pi2位点进行序列比对，筛查Pi2特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性差异位点。具有基因特异性差异位点的水稻稻瘟病抗性基因Pi2与IRBLzt-T(Piz-t)、Nip-Pi9和9311的多序列比对结果如下所示:

C101A51-Pi2:GAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGGGAGGGΔ

TCCACTTCCAGCTTAATTAGCCTAG；

IRBLzt-T-Pi2:

GAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGGAGGGGGTCCACTTCCAGCTTAATTAGCCTAG；

Nip-Pi2:

GAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGGG----TCCACTTCCAGCTTAATTAGCCTAG；

9311-Pi2:

GAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGAGGG--TCCACTTCCAGCTTAATTAGCCTAG

其中，加Δ的位置即为鉴定到的Pi2SSR；

(2)设计引物:

根据分子标记的设计原理，在所述SSR位点50-100bp处设计Pi2基因特异性上游引物，在该SSR位点下游50-100bp处设计基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下所示:

SEQ ID NO.1,Fl:5’-GCAGCGGCTAGGGTTTATC-3’；

SEQ ID NO.2,Rl:5’-CACCCAGCAACTGATTTGTCA-3’。

(3)选择水稻代表品种:

选择携带有Pi2基因以及Pi2/9基因族等位基因的代表品种如下:

水稻品种C101A51，为Pi2供体品种(参考“Inukai et al.，1994.Allelismofblast resistancegenes in near-1sogenic lines of rice.Phytopathology,84:1278-1283”)，为阳性对照；

水稻品种IRBLzt-T，为Piz-t供体品种(参考“Zhou et al.,2006.The eight amino-aciddifferences within three leucine-rich repeats between Pi2and Piz-t resistance proteins determine theresistance specificity to Magnaporthe grisea.MPMI 19:1216-1228”)；

水稻品种IRBL9-W，为Pi9供体品种(参考“Tsunematsu et al.,2000.Development ofmonogenic lines ofrice for blast resistance.Breed Scij 50:229-234”)；

水稻品种谷梅4号，为Pigm供体品种(参考“Deng et al.,2006.Genetic characterization andfine mapping ofthe blast resistance locus Pigm(t)tightly linked to Pi2and Pi9in a broad-spectrumresistant Chinese variety.Theor Appl Genet,113:705-713”)；

感病对照品种:日本晴(选育单位：日本，http://www.ricedata.cn/variety/varis/602979.htm)。

感病对照品种:丽江新团黑谷(LTH，粳型常规水稻，http://www.ricedata.cn/variety/varis/610839.htm)。

(4)PCR扩增，获得含有Pi2基因特异性SSR的片段

利用上述引物对Fl和R1，以上述水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增，扩增得到的片段进行测序，得到的结果如图1所示。

扩增反应体系如下:

PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，T载体连接测序(英潍捷基(南京)贸易有限公司)。

测序结果显示，Pi2基因特异性分子标记既能区分抗感等位基因，又能区分Pi2/Pi9位点上所鉴定到的其它抗性基因。也就是说，凡是携带有Pi2的水稻品种，其PCR扩增产物的序列为110bp的特异片段，而在Pi2/9位点上所定位的其它稻瘟病抗性基因以及感病等位基因因以其它大小的序列。

实施例2：抗性基因Pi2基因特异性分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用

根据多态性的PCR产物序列，可以把含有目标基因Pi2与其它Pi2/9基因簇上的抗性基因区分开来。如图1所示，根据条带大小可以将Pi2与该位点所鉴定到的其它抗性基因区分开来，110bp表示含有Pi2基因，其它大小表示不含有Pi2。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi2基因特异性分子标记可在鉴别Pi2基因与Ρi2/9基因族等位基因等方面得到应用。

实施例3:抗性基因Pi2基因特异性分子标记在检测其它水稻品种中的应用

选择19个国内重要水稻品种，依次`为:9311、T55B、花1B、珍汕97B、博B、冈46B、29B、D702B、优IB、绵香1B、陆财号、粤丰B、培矮64、IR58025B、辐恢838、特青、成恢448、苏御糯、特特普。

9311,选育单位：德农正成种业有限公司长沙德农正成水稻研究所,

http://www.ricedata.cn/variety/varis/611292.htm；

T55B,选育单位：福建农林大学作物科学学院,

http://www.ricedata.cn/variety/varis/609417.htm；

花1B，选育单位：福建农业大学作物科学学院，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/608899.htm；

珍汕97B，选育单位：温州市农业科学研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/600530.htm；

博B，选育单位：广西博白县农业科学研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/601128.htm；

冈46B，选育单位：四川农业大学，http://www.ricedata.cn/variety/varis/601130.htm；

29B,选育单位：江苏沿海地区农业科学研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/613453.htm；

D702B,选育单位：四川农业大学水稻研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/610201.htm；

优IB,选育单位：湖南杂交水稻研究中心，http://www.ricedata.cn/variety/varis/601138.htm；

绵香1B,选育单位：绵阳市农业科学研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/609485.htm？609485；

陆财号,选育单位：福建省仙游县陆财，http://www.ricedata.cn/variety/varis/600620.htm；

粤丰B,选育单位：广东省农业科学院水稻研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/609799.htm；

培矮64,选育单位：国家杂交水稻工程技术研究中心，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/607604.htm；

IR58025B,选育单位：国际水稻研究所，http://www.ricedata.cn/variety/varis/611226.htm；

辐恢838,选育单位：四川省原子能研究院，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/601150.htm；

特青,品种类型：籼型常规水稻，http://www.ricedata.cn/variety/varis/603325.htm；

成恢448,选育单位：四川省农业科学院作物研究所，

http://www.ricedata.cn/variety/varis/608756.htm；

苏御糯,品种类型：粳型常规糯稻，http://www.ricedata.cn/variety/varis/610853.htm；

特特普,品种类型：籼型常规水稻，http://www.ricedata.cn/variety/varis/608373.htm。

分别提取其基因组DNA，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行PCR扩增及电泳检测。根据产物(条带)的大小，可以把抗性基因Pi2与Pi2/9位点的基因区分开来。如图2所示，在抗谱表型为Pi2型的个体(携带有稻瘟病抗性基因Pi2的抗病品种C101A51，泳道I的样品)中能检测到Pi2SSR基因的特异性分子标记带型，而其他抗谱表型的个体则为其它带型。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi2基因特异性分子标记可在鉴别Pi2基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  淮阴师范学院

 

<120> 稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用

 

<130> 

<160>  3   

<170>  PatentIn version 3.3

 

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gcagcggcta  gggtttatc                                                       19

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cacccagcaa   ctgatttgtc   a                                                  21

 

Claims (8)

1.一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，其特征在于，所述分子标记Pi2SSR是通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的分子标记；

所述的SEQ ID NO.1(5’-3’)序列为：GCAGCGGCTAGGGTTTATC；

所述的SEQ ID NO.2(5’-3’)：序列为CACCCAGCAACTGATTTGTCA。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR，其特征在于，所述水稻品种为C101A51。

3.一种制备权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过常规PCR法扩增，获得多个Pi2等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；

(2)将步骤(1)所得的序列对比，得到Pi2抗性基因所特有的一处2-4个碱基的差异；

(3)根据步骤(2)所获得的差异核苷酸片断，设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并用该引物对对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片断；

(4)对步骤(3)所获得的核苷酸片断在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi2抗性基因的功能特异性的分子标记Pi2SSR。

4.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的稻瘟病抗性水稻品种为抗性品种C101A51、抗性品种IRBL9-W、抗性品种IRBLzt-T、抗性品种谷梅4号、感病品种日本晴、感病品种LTH、感病品种9311中的一种。

5.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方法，其特征在于，步骤(3)中Pi2SSR的57bp设计特异性下游引物SEQ ID NO.2,而在其上游53bp处设计特异性上游引物SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR的反应体系如下：

7.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存；取适量PCR扩增产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180v，1小时；扩增所得到的PCR产物大小为110bp,即为抗性基因Pi2的特异性分子标记。

8.权利要求1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi2特异性分子标记Pi2SSR的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。