CN103937789A - 水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s,所述基因特异性分子标记Pita3N5s是以携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种的总DNA为模板，利用引物对F1、R1进行扩增后，将扩增产物经限制性内切酶Hae III酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型的核苷酸片段；所述引物对F1、R1核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s的制备方法和应用。该分子标记可大大提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中利用的效率。

Description

水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s及其制备方法和应用。

背景技术

可持续发展是国家的发展战略，绿色食品安全生产是保证这一战略实施的重要组成部分，农业安全生产技术又是发展绿色食品的前提，利用作物自身的抗性控制病虫害已成安全生产技术的重要组成部分。水稻作为全球最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由异宗配合子囊菌Magnaporthe grisea(Couch and Kohn，2002)引起的稻瘟病是限制水稻稳产和高产的重要因素之一。据估计，该病害每年在东亚国家或地区可造成多达5.5亿美元以上的经济损失(Robert，1991)。20世纪90年代以来，中国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，稻谷损失达数亿公斤(陈彦等，2012)。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，单一抗性品种的持久性(通常是2-4年)会随着病原菌的迅速变异而失去功效(郑钊等，2009)，因此，合理的挖掘和利用广谱抗性基因或者聚合多个抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，不仅依赖于育种者具备的丰富经验和敏锐的观察力，鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响而造成误差，抗性基因的选育效率低下。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的标记物进行分子标记辅助选择，不仅大大加快了育种步伐，也提高了分子育种选择的可靠性。

到目前为止，人们已经鉴定出100多个水稻抗瘟基因(Ballini etal.,2008；Chen et al.,2014)，其中至少23个水稻水稻抗瘟基因已被克隆(Wang et al.,1999；Qu et al.,2006；Hayashi et al.,2010；Jiang et al.，2012；Hua et al.，2012；Das et al.，2012；Lv et al.,2013)。这些稻瘟病抗病基因多数具有富亮氨酸重复-核苷酸结合位点(NBS-LRR)蛋白结构，NBS中心区域的功能与ATP结合/水解相关，C-端LRR区域参与了蛋白的相互作用(Dangl&Jones,2001；Takken&Tameling,2009；Bernoux,2011)。NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers,1998；Leister,2004)。在第12染色体上，目前至少已定位了20个水稻抗瘟基因，其中17个基因成簇分布于Pita位点附近，包括Pi4，Pi6，Pi12，Pi19，Pi20，Pi21，Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi42，Pi48，Pi157，Pita，Pita2，Pitq6，Pita3(Yu et al.,1991；Naqvi et al.,1996；Yu et al.,1996；Zheng et al.,1996；Ahn et al.,1997；Hayashi et al.,1998；Ahn et al.,2000；Bryan et al.,2000；Tabien et al.,2000；Zhuang et al.,2002；Sallaud et al.,2003；Hayashi et al.,2006；Liu et al.,2007；Li et al.,2008；Kumar et al.,2010；Huang et al.,2011；Chen et al.,2014)。这17个水稻抗瘟基因在在着丝粒附近构成了一个大的抗性基因簇，其中只有1个抗病基因Pita被克隆(Bryan et al.,2000)。另外3个水稻抗瘟基因Pi39，Pi51和PiGD-3被定位在第12染色体的长臂上(Liu et al.,2004；Yang et al.,2009；Wang et al.,2012)。但该基因簇中，还有更多的NBS-LRR成员等待人们进一步的挖掘和利用。

发明内容

申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning)，从华南稻区的一个优异抗源品种黄华占(HHZ)中分离、鉴定到了一个具有广谱、持久抗性的水稻抗瘟基因Pita3。通过长片段PCR扩增(Long RangementPCR Amplification)以及染色体步移(Chromosome Working)的方法，获得了Pita3位点区域的候选基因组序列。通过FGenesh预测，该区域包括了5个编码NBS-LRR类蛋白的基因：Pita3-Nbs1～5(Chen etal.,2014)。Pita3位于Pita基因区域，Pita/ta3区域基因位点的整合图谱如图1所示(Chen et al.,2014)。

值得注意的是，同样位于Pita基因区域的Pita3，其对应的专化性小种的抗谱却与Pita的抗谱明显不同，如表1所示。针对各等位基因的结构域测序分析表明，抗病Pita3与感病Pita3-NIP的结构域存在多个氨基酸差异。多年实践证明，Pita3具有广谱、持久的稻瘟病抗性，且遗传力较高，使之更适合广泛应用于稻瘟病抗性育种计划中。因而，为了加快Pita3在抗性育种工作中的应用，开发出Pita3基因特异性分子标记，对于准确有效的分子标记辅助育种(MAS)、基因的聚合育种，显得尤其重要。

表1.Pita3和Pita基因的抗谱比较

"^aS"means susceptible，"^bR"means resistant

为此，本发明的首要目的是提供一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性单碱基差异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分子标记Pita3N5s，以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中利用的效率。

本发明的另一目的在于提供所述Pita3基因特异性单碱基差异分子标记Pita3N5s的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述Pita3基因特异性单碱基差异分子标记Pita3N5s的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s,所述基因特异性分子标记Pita3N5s是以携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种的总DNA为模板，利用引物对F1、R1进行扩增后，将扩增产物经限制性内切酶Hae III酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型的核苷酸片段；所述引物对F1、R1核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种为抗源品种黄华占。

优选的，所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s的制备方法，包括步骤：

1)利用多序列比对软件工具，对Pita3基因及其等位基因进行核苷酸比对，筛查Pita3中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基差异位点；

2)利用步骤1)获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物F1，在SNP下游100-200bp处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物R1，所述引物对F1、R1核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

3)利用步骤2)中引物对F1、R1，以携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物经限制性内切酶Hae III酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型的核苷酸片段，即为所述水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s。

进一步，还包括步骤4)，利用步骤2)所述的引物对，对不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增，获得Pita3基因簇抗源品种对应于Pita3特异SNP位点的片段，与步骤2)获得的DNA片段进行比较，从而确定Pita3基因特异性的分子标记Pita3N5s。

水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在检测水稻抗瘟基因Pita3及其等位基因的应用。

水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在检测普栽水稻品种中水稻抗瘟基因的应用。

本发明的原理：SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)是指基因组同一位点不同等位基因之间由单个核苷酸差异所引起的DNA序列多态性。SNP在基因组中数量多，分布广，为分子标记的开发提供重要的资源。通过常规PCR扩增结合限制性内切酶酶切的方法来实现SNP的检测大大地扩展了SNP位点检测的实用性，其在检测成本上远远低于荧光显色、测序等等。限制性内切酶可以识别DNA的特异序列，并能够在识别位点对双链DNA进行切割，当识别位点发生突变时，限制性内切酶则因无法识别突变的位点而不能完成对双链DNA的切割。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明中基因特异性分子标记Pita3N5s属于抗病基因功能性标记，具有重要的分子育种应用价值，相比抗病基因连锁标记，利用此标记可以有效提高该基因在水稻分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的利用效率；

2、利用本发明中开发的基因特异性分子标记Pita3N5s进行水稻抗病基因分子检测，可以快速实现水稻抗瘟基因Pita3等位基因的基因检测，操作简单，检测结果容易辨别，实用性强。

附图说明

图1为本发明Pita3和Pita基因位点的整合图谱；

图2为本发明Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在Pita3基因区域不同水稻抗瘟基因的验证；

其中，M为DNA ladder，泳道1-7的DNA模板依次为抗性基因供体抗源品种黄华占(HHZ)、感病品种丽江新团黑谷(LTH)、感病品种日本晴(NIP)、抗病品种青六矮(QLA)、感病品种美香占(MXZ)、抗病品种丰华占(FHZ)和感病品种CO39；

图3为本发明Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在27份水稻材料中水稻抗瘟基因型的验证；

其中，M为DNA ladder，泳道1-29的DNA模板依次为抗性基因供体抗源品种黄华占(HHZ)、感病品种日本晴(NIP)、三香B、博B、华农B、谷丰B、七丝银占、粤太B、华育B、新银占、明恢63、广恢880、五山丝苗、粤晶丝苗2号、马坝银占、华占、五山油占、辐恢838、广恢998、深恢7116、广恢290、金航丝苗、胜巴丝苗、巴太香占、玉香油占、桂99、抗白香占、丰丝占和丰八占。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1：水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记及其引物设计与检测

1)特异单碱基差异(SNP)位点的分析：

利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pita3的候选基因区域序列，比较Pita3对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pita3中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基(SNP)差异位点，具有基因特异性SNP的水稻水稻抗瘟基因Pita3与pita3-NIP(日本晴)等位基因侧翼序列的多序列结果如下所示，

Pita3：TCTTGTGCCTACCTTGTTGATATCCCCCCTC TGCC

NBS5-NIP：TCTTGTGCCTACCTTGTTGATATCCCCCCTCCC ACCGTGCC

其中，下划线所示的核苷酸即为鉴定到的Pita3基因特异性单碱基差异(SNP)，由此鉴定到在Pita3-N5部分具有的功能特异性单碱基差异(SNP)，画框的碱基为酶切位点。

2)引物设计：

根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点上游100-200bp处设计基因特异性上游引物F1(SEQ ID NO.1所示)，在该SNP位点下游100-200bp处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物R1(SEQ ID NO.2所示)，引物对碱基序列如下所示：

F1：5’-TGCTCAAAGAATTGGGAGG-3’

R1：5’-CATGGGAAATATACGCAAGCAG-3’

3)选择水稻代表品种

选择携带有Pita3基因及其等位基因的代表品种如下：

抗源品种黄华占(HHZ)，为Pita3供体品种；

感病对照品种:日本晴(NIP)、丽江新团黑谷(LTH)、美香占(MXZ)、CO39；

测试品种依次为：三香B、博B、华农B、谷丰B、七丝银占、粤太B、华育B、新银占、明恢63、广恢880、五山丝苗、粤晶丝苗2号、马坝银占、华占、五山油占、辐恢838、广恢998、深恢7116、广恢290、金航丝苗、胜巴丝苗、巴太香占、玉香油占、桂99、抗白香占、丰丝占、丰八占。

其中，抗源品种黄华占(HHZ)采集获得；感病对照品种日本晴是日本选育的一个品种，通过国际水稻研究所(http://www.irri.org)的国际共享种质资源库可免费获得。所有遗传资源信息见遗传资源披露表。

4)PCR扩增，获得相应的多态性片段

利用上述引物对F1和R1，分别以上述水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增，扩增产物为157bp的核苷酸片段，所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

扩增反应体系如下：

ddH₂O：13.3μl(补足至20μl)

10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)：2μl

dNTPs(2.5mM each)：1.6μl

F1(10μM)：1μl

R1(10μM)：1μl

TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl

DNA模版(20-50ng/μl)：1μl

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶Hae III对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

ddH₂O：5.5μl(补足至12μl)

10×buffer1：1.2μl

BSA：1.2μl

PCR产物：5μl

Hae III：0.3μl

37℃下酶切3小时后取适量酶切样品在8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时，电泳图谱如图2所示。其中，泳道1即为以抗性基因供体抗源品种黄华占(HHZ)的总DNA为模板，经扩增，酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型基因特异性分子标记Pita3N5s，经检测其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

图2中，低带代表含有Pita3基因，高带为不含Pita3基因。

实施例2：抗性基因Pita3基因特异性分子标记在检测水稻抗瘟基因Pita3等位基因的应用。

根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pita3与其它感病pita3基因等位基因的品种区分开来。如图2所示，Pita3的供体品种及含有Pita3的近等基因系具有基因特异性分子标记的存在，使用限制性内切酶Hae III酶切时可以在特异性分子标记Pita3N5s处切断,而形成低条带；而不含Pita3基因供体品种在特异性分子标记Pita3N5s处因酶切位点不匹配，使用限制性内切酶Hae III酶切时不可以在特异性分子标记Pita3N5s处切断，只有高条带。

如图2所示，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pita3基因特异性分子标记可在检测品种或品系中只是非含有水稻抗瘟基因Pita3基因等方面得到应用。

实施例3：抗性基因Pita3基因特异性分子标记在检测华南地区普栽水稻品种中水稻抗瘟基因的应用

采集27个本研究室收集的、华南地区重要水稻品种，依次为：三香B、博B、华农B、谷丰B、七丝银占、粤太B、华育B、新银占、明恢63、广恢880、五山丝苗、粤晶丝苗2号、马坝银占、华占、五山油占、辐恢838、广恢998、深恢7116、广恢290、金航丝苗、胜巴丝苗、巴太香占、玉香油占、桂99、抗白香占、丰丝占、丰八占，分别提取其基因组DNA,并以此为模板，利用实施例1中开发、确定的实验程序，对抗性基因Pita3基因特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。根据PCR产物(条带)的大小，可以检测该品种或品系中是非含有水稻抗瘟基因Pita3。如图3所示，在抗谱表型为Pita3型的个体中能检测到Pita3N5s基因特异性分子标记的存在，而其他不含Pita3基因的个体则不能检测到该分子标记。

如图3所示，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pita3基因特异性分子标记可在检测生产上普栽品种是否含有水稻抗瘟基因Pita3等方面得到应用。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s,其特征在于，所述基因特异性分子标记Pita3N5s是以携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种的总DNA为模板，利用引物对F1、R1进行扩增后，将扩增产物经限制性内切酶Hae III酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型的核苷酸片段；所述引物对F1、R1核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s，其特征在于，所述携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种为抗源品种黄华占。

3.如权利要求2所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s，其特征在于，所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求3所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s，其特征在于，所述水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)利用多序列比对软件工具，对Pita3基因及其等位基因进行核苷酸比对，筛查Pita3中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基差异位点；

2)利用步骤1)获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物F1，在该SNP下游100-200bp处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物R1，所述引物对F1、R1核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

3)利用步骤2)中引物对F1、R1，以携带水稻抗瘟基因Pita3的抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物经限制性内切酶Hae III酶切后获得的与水稻抗瘟基因Pita3呈特异性带型的核苷酸片段，即为所述水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤4)，利用步骤2)所述的引物对，对不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增，获得Pita3基因簇抗源品种对应于Pita3特异SNP位点的片段，与步骤2)获得的DNA片段进行比较，从而确定Pita3基因特异性的分子标记Pita3N5s。

7.权利要求1-6任一项所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在检测水稻抗瘟基因Pita3及其等位基因的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特异性分子标记Pita3N5s在检测普栽水稻品种中水稻抗瘟基因的应用。