CN102732511A - 稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP及其方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP及其方法与应用。该分子标记由Pi7-1FNP和Pi7-2FNP组成，分别由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pi7的等位基因序列与SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6序列比对，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi7功能特异性的2个单碱基差异，再通过设计，分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，分别得到Pi7功能特异性分子标记Pi7-1FNP和Pi7-2FNP。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP及其方法与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。
到目前为止，已经有15个水稻稻瘟病抗性基因被分离克隆，其中包括位于第11染色体长臂端Pik簇上的3个具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因：Pik-m(Ashikawa et al.2008.Genetics 180：2267-2276)、Pik(Zhai et al.2011.NewPhytologist 189：321-334)以及Pik-p(Yuan et al.2011.Theor Appl Genet 122：1017-1028)。研究表明，这3个等位基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类型的抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含这3个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为K型；当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同)。
此外，申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning)，在水稻供体品种IRBL7-M(Compbell et al.2004.Development of co-dominant amplifiedpolymorphic sequence markers in rice that flank the Magnaporthe grisea gene Pi7(t)in recombinant inbred line 29.Phytopathology 94：302-307)中分离、鉴定到了一个具有独特抗谱的稻瘟病抗性基因Pi7。申请人在Pi7的精细定位过程中发现，在包含Pi7位点的基因组区域中，Pi7供体品种IRBL7-M与Pik-m，Pik以及Pik-p的供体品种具有相似的基因组结构，即与参考序列日本晴之间存在着大片段的插入/缺失。进一步的功能互补实验结果证明了Pi7属于第5个分离得到的Pik簇的等位基因(申请人未发表数据)。然而，Pi7所具有的独特抗谱(同上，Compbell et al.2004.Phytopathology 94：302-307)，使之可以广泛地应用于稻瘟病抗性育种计划中。
因此，为了加快Pi7在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pi7与其他功能基因的聚合育种、以及转基因育种等，开发出准确有效的Pi7功能特异性分子标记显得尤其重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法。
本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP，它由Pi7-1FNP和Pi7-2FNP组合而成，分别由引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi7呈特异性带型的分子标记；
所述引物对的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1(5’-3’)：gcaggtcagccaagcaat；
SEQ ID NO.2(5’-3’)：caaccgttgttttgcctcc；
SEQ ID NO.3(5’-3’)：cgtggaagttcaacaaaagg；
SEQ ID NO.4(5’-3’)：cagcacctgtattatcccat；
优选的，所述的水稻品种为IRBL7-M；
所述的稻瘟病抗性基因Pi7包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pi7-1和Pi7-2，2个编码基因的DNA序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述的特异性酶切指的是由引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2得到的PCR产物通过限制性内切酶Mse I酶切；由引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4得到的PCR产物通过限制性内切酶Nde I酶切
所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pi7的等位基因序列与如SEQ ID NO.5及SEQ IDNO.6所示的序列比对，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi7功能特异性的2个单碱基差异(SNP)，再通过引物设计分别得到引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，分别得到Pi7功能特异性分子标记Pi7-1FNP和Pi7-2FNP，优选包括以下步骤：
(1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pi7等位基因的编码区DNA序列；
(2)将步骤(1)所获得的序列比对，得到Pi7抗性基因所特异的2个功能特异性单碱基差异(single nucleotide polymorphism，SNP)Pi7-1SNP和Pi7-2SNP；
(3)根据步骤(2)所得到的2个SNP，分别设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，并用这2组引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物A和扩增产物B；然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，得到与稻瘟病抗性基因Pi7呈特异性带型的核苷酸片段Pi7-1FNP和Pi7-2FNP；
(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi7抗性基因的功能特异性的分子标记Pi7FNP(由Pi7-1FNP和Pi7-2FNP组合而成)。
优选的，
步骤(1)中所述的水稻品种包括IRBL7-M、K60、Kusabue以及Tsuyuake；
步骤(2)中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对；
步骤(3)中所述的扩增产物A的大小为134bp，酶切后的大小为117bp；
步骤(3)中所述的扩增产物B的大小为114bp，酶切后的大小为71bp；
步骤(3)中所述的引物是根据dCAPS标记原理，在Pi7-1 SNP位点上游100-200bp处设计功能特异性上游引物Pi7-1FNP-F，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物Pi7-1FNP-R，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；在Pi7-2SNP位点上下游100bp范围内设计功能特异性上游引物Pi7-2FNP-F及功能特异性下游引物Pi7-2FNP-R，分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
步骤(3)中所述的PCR扩增反应，其中Pi7-1FNP的PCR扩增反应体系如下：
ddH2O：14.3μl
10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl
dNTPs(2.5mM each)：1.6μl
SEQ ID NO.1(10μM)：0.5μl
SEQ ID NO.2(10μM)：0.5μl
TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl
DNA模板(20ng/μl)：1μl；
其PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Mse I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：
ddH2O：3.7μl
10×buffer 1：1μl
PCR产物：5μl
Mse I：0.3μl；
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，2小时。扩增所得到的PCR产物大小为134bp，酶切后所得到的产物大小为117bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pi7的功能特异性分子标记Pi7-1FNP。
步骤(3)中所述的PCR扩增反应，其中Pi7-2FNP的PCR扩增反应体系如下：
ddH2O：14.3μl
10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl
dNTPs(2.5mM each)：1.6μl
SEQ ID NO.3(10μM)：0.5μl
SEQ ID NO.4(10μM)：0.5μl
TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl
DNA模板(20ng/μl)：1μl；
其PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Nde I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：
ddH2O：3.7μl
10×buffer 1：1μl
PCR产物：5μl
Nde I：0.3μl；
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，1小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为114bp，酶切后所得到的产物大小为71bp，后者(能被酶切)即为抗性基因Pi7的功能特异性分子标记Pi7-2FNP。
所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的Pi7功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pi7在水稻种质资源中以及育种后代中的鉴定，且不受环境以及人为因素的影响。因此，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。
附图说明
图1是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pi7的组成基因之一Pi7-1与3个Pik簇等位基因的蛋白质序列比对图，黑色星号表示由Pi7-1FNP造成的功能特异性氨基酸的改变。
图2是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pi7的组成基因之一Pi7-2与3个Pik簇等位基因的蛋白质序列比对图，黑色星号表示由Pi7-2FNP造成的功能特异性氨基酸的改变。
图3是验证图，其中：
图A为Pi7功能特异性分子标记Pi7-1FNP在7个水稻品种中的验证图，泳道1：抗性基因供体品种IRBL7-M(Pi7)；泳道2：IRBLk-Ka(Pik单基因系)；泳道3：IRBLkp-K60(Pik-p单基因系)；泳道4：IRBLKM-TS(Pik-m单基因系)；泳道5：IRBLks-S(Pik-s单基因系)；泳道6：感病品种Q1063；泳道7：感病品种龙粳24；泳道M：DNA ladder；
图B为Pi7功能特异性分子标记Pi7-2FNP在7个水稻品种中的验证图，
泳道1：抗性基因供体品种IRBL7-M(Pi7)；泳道2：IRBLk-Ka(Pik单基因系)；泳道3：IRBLkp-K60(Pik-p单基因系)；泳道4：IRBLKM-TS(Pik-m单基因系)；泳道5：IRBLks-S(Pik-s单基因系)；泳道6：感病品种Q1063；泳道7：感病品种龙粳24；泳道M：DNAladder。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：Pi7等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定
通过常规的PCR扩增(Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes.Theor ApplGenet 122：1017-1028)、测序(上海英骏生物技术有限公司，广州分公司)，从4个水稻品种IRBL7-M(Development of co-dominant amplified polymorphic sequencemarkers in rice that flank the Magnaporthe grisea gene Pi7(t)in recombinant inbredline 29，Compbell et al.2004.Phytopathology 94：302-307)、K60(Pik-p供体品种；同上，Yuan et al.2011.Theor Appl Genet 122：1017-1028)、Kusabue(Pik供体品种；Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistancegene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189：321-334)以及Tsuyuake(Pik-m供体品种；Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-bindingsite-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blastresistance.Genetics 180：2267-2276)中获得相应的Pi7等位基因编码区DNA序列[Pik-p(HM035369)，Pik(HM048900)，Pik-m(AB462256)，已经公开于http://www.ncbi.nlm.nih.gov]；利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，通过对这些序列翻译后的蛋白质序列比对分析，鉴定到存在于Pi7-1基因cDNA第686位点以及Pi7-2基因cDNA第1879位点的功能特异性SNP。在第686位点，Pi7编码的第262位点氨基酸为赖氨酸(K)，Pik-p编码的则为天冬酰胺(N)，因此，该位点可以将Pi7与等位基因Pik-p区分开(图1)。而在第1879位点，Pi7编码的第627位点氨基酸为甲硫氨酸(M)，而等位基因Pik和Pik-m编码的则为缬氨酸(V)，因此，该位点可以将Pi7与Pik和Pik-m区分开(图2)。以上2个功能特异性SNP位点的组合使用可以将Pi7与Pik-p，Pik及Pik-m等其他稻瘟病抗性基因区分开。
实施例2：Pi7功能特异性分子标记及其引物设计与检测
根据dCAPS标记(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences；Neff etal.2002.Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.Trends in Genetics 18：613-615)的设计原理，利用Primer Premier 5.0软件工具(http://www.premierbiosoft.com)，在Pi7-1SNP上游100-200bp处设计功能特异性上游引物Pi7-1FNP-F，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物Pi7-1FNP-R，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；分别在Pi7-2 SNP位点上下游100bp范围内设计功能特异性上游引物Pi7-2FNP-F及功能特异性下游引物Pi7-2FNP-R，分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。通过这2组引物对携带有Pi7基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增，扩增出的核苷酸片段经特异性酶切之后，即分别为Pi7-1FNP和Pi7-2FNP。
Pi7-1FNP的PCR扩增反应体系如下：
ddH2O：14.3μl
10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl
dNTPs(2.5mM each)：1.6μl
SEQ ID NO.1(10μM)：0.5μl
SEQ ID NO.2(10μM)：0.5μl
TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl
DNA模板(20ng/μl)：1μl；
其PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Mse I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：
ddH2O：3.7μl
10×buffer 1：1μl
PCR产物：5μl
Mse I：0.3μl；
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，2小时。扩增所得到的PCR产物大小为134bp，酶切后所得到的产物大小为117bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pi7的功能特异性分子标记Pi7-1FNP。
Pi7-2FNP的PCR扩增反应体系如下：
ddH2O：14.3μl
10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl
dNTPs(2.5mM each)：1.6μl
SEQ ID NO.3(10μM)：0.5μl
SEQ ID NO.4(10μM)：0.5μl
TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl
DNA模板(20ng/μl)：1μl；
其PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶Nde I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：
ddH2O：3.7μl
10×buffer 1：1μl
PCR产物：5μl
Nde I：0.3μl
在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，1小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为114bp，酶切后所得到的产物大小为71bp，后者(能被酶切)即为抗性基因Pi7的功能特异性分子标记Pi7-2FNP。
实施例3：抗性基因Pi7功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用
采集含有不同的稻瘟病抗性基因的7个水稻品种，分别为：IRBL7-M、IRBLk-Ka、IRBLkp-K60、IRBLKM-TS(Kobayashi et al.2007.Development of newsets of international standard differential varieties for blast resistance in rice (Oryzasativa L.).JARQ 41：31-37)，以及Q1063和龙粳24(Longjing24)(同上，Zhai etal.2011.New Phytologist 189：321-334)的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例2中描述的Pi7-1FNP和Pi7-2FNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pi7功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。电泳结果分别如图3A和图3B所示。
如附图说明的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi7功能特异性分子标记可在鉴别Pi7基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP，其特征在于：它由Pi7-1FNP和Pi7-2FNP组合而成；分别通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi7呈特异性带型的分子标记；
所述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：5’-gcaggtcagccaagcaat-3’；
SEQ ID NO.2：5’-caaccgttgttttgcctcc-3’；
SEQ ID NO.3：5’-cgtggaagttcaacaaaagg-3’；
SEQ ID NO.4：5’-cagcacctgtattatcccat-3’。
2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP，其特征在于：所述的水稻为水稻品种IRBL7-M。
3.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pi7包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因，为如SEQ ID NO.5所示的Pi7-1和如SEQ ID NO.6所示的Pi7-2。
4.根据权利要求1～3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法，其特征在于：通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pi7的等位基因序列与如SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示的序列比对，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi7功能特异性的2个单碱基差异，再通过引物设计，分别得到引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQID NO.3和SEQ ID NO.4，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，分别得到Pi7功能特异性分子标记Pi7-1FNP和Pi7-2FNP。
5.根据权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法，其特征在于包含了以下步骤：
(1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pi7等位基因的编码区DNA序列；
(2)将步骤(1)所获得的序列比对，得到Pi7抗性基因所特异的2个功能特异性单碱基差异Pi7-1SNP和Pi7-2SNP；
(3)根据步骤(2)所得到的2个SNP，分别设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，并用这2组引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物A和扩增产物B；然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，得到与稻瘟病抗性基因Pi7呈特异性带型的核苷酸片段Pi7-1FNP和Pi7-2FNP；
(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pi7抗性基因的功能特异性的分子标记Pi7FNP，该分子标记Pi7FNP由Pi7-1FNP和Pi7-2FNP组合而成。
6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的水稻品种为IRBL7-M、K60、Kusabue以及Tsuyuake。
7.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的PCR扩增反应，Pi7-1FNP的扩增反应体系为：
ddH2O：14.3μl、含Mg2+的10×PCR buffer：2μl、2.5mM dNTP：1.6μl、10μM SEQ ID NO.1：0.5μl、10μM SEQ ID NO.2：0.5μl、5U/μl TaKaRa TaqTM：0.1μl、20ng/μl DNA模板：1μl；
温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存；
对于Pi7-1FNP，步骤(3)中所述的酶切的反应体系如下：
ddH2O：3.7μl、10×buffer 1：1μl、PCR产物：5μl、MseI：0.3μl
步骤(3)所述的PCR扩增反应，Pi7-2FNP的扩增反应体系为：
ddH2O：14.3μl、含Mg2+的10×PCR buffer：2μl、2.5mM dNTP：1.6μl、10μM SEQ ID NO.3：0.5μl、10μM SEQ ID NO.4：0.5μl、5U/μl TaKaRa TaqTM：0.1μl、20ng/μl DNA模板：1μl；
温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存；
对于Pi7-2FNP，步骤(3)中所述的酶切的反应体系如下：
ddH2O：3.7μl、10×buffer 1：1μl、PCR产物：5μl、Nde I：0.3μl。
8.根据权利要求5所述的优选的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的扩增产物A的大小为134bp，酶切后的大小为117bp；
步骤(3)中所述的扩增产物B的大小为114bp，酶切后的大小为71bp。
9.权利要求1～3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP的应用，其特征在于：利用所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记Pi7FNP在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。
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|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103215371A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-07-24 | 辽宁省农业科学院 | 一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因pi5的检测方法 |
| CN104404136A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-03-11 | 中国农业大学 | 鉴定猪frzb基因中snp位点基因型的方法 |
| CN113122649A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-07-16 | 武汉科技大学 | 一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物和方法 |
| CN114410819A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-29 | 天津市农业科学院 | 用于鉴定水稻Pik座位多个稻瘟病抗性等位基因的功能标记组、引物组合及其应用 |
| CN116640774A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-25 | 江苏省农业科学院 | 水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25及其应用 |
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-
2012
- 2012-03-08 CN CN2012100606671A patent/CN102732511A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| CN116640774A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-25 | 江苏省农业科学院 | 水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25及其应用 |
| CN116640774B (zh) * | 2023-06-14 | 2024-02-09 | 江苏省农业科学院 | 水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25及其应用 |
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