CN104404136A - 鉴定猪frzb基因中snp位点基因型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：步骤一：以猪基因组DNA为模板利用SEQ ID NO:1所示的序列为正向引物、SEQ ID NO:2所示的序列为反向引物进行PCR扩增获得PCR产物；步骤二：利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切获得酶切片段；步骤三：对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳图，依据电泳图中酶切片段的长度鉴定基因型。本发明应用了3’端错配方法，PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，并且检测方法简单易操作，成本低，酶切的结果容易分辨，是一种鉴定基因型的准确、有效方法。

Description

鉴定猪FRZB基因中SNP位点基因型的方法
技术领域
本发明涉及一种基因型检测方法，具体的，涉及一种鉴定猪FRZB基因中与生长性状相关的SNP位点基因型的方法及其应用。
背景技术
FRZB(Frizzled motif associated with bone development)基因编码分泌型卷曲相关蛋白3(secreted frizzled-related protein 3,sFRP3)，该蛋白富含半胱氨酸结构域(CRD)，该结构域同源于细胞表面卷曲受体(frizzled receptors)的Wnt结合位点,因此FRZB基因通过竞争性结合参与和调控Wnt信号途径。Wnt信号通路在调控细胞的增殖和分化、胚胎发育过程中起着重要作用。研究表明，Wnt信号通路异常与人类的很多疾病有关系。sFRP3可直接结合Wnt蛋白，阻断Wnt信号转导，是Wnt信号的天然拮抗剂。研究表明，sFPR3是一种软骨形成因子，与骨骼发育有关，具有调节骨骼发育功能，在决定髋骨的形状中起着重要作用，调控四肢骨骼肌发育中软骨细胞成熟和长骨发育。以上研究表明了FRZB基因在人和小鼠中生长发育方面的重要作用，目前对于该基因在猪上的研究比较少。
目前有研究发现，淮猪新品系群体中FRZB基因的C-416T位点存在3种基因型。CC基因型个体生长最快，达30kg体重日龄比CT和TT型个体分别缩短4.1d和5.0d，达90kg体重日龄分别缩短12.0d和24.7d，CC基因型的90kg体重日龄与TT型差异显著，可看出C等位基因对提高生长速度是有利的，CC是有利基因型。因此在淮猪新品系猪群中可以选择CC基因型个体进行留种，从而提高猪群的生长速度，加速新品系的选育进程。但是，对于FRZB基因C-416T基因型的鉴定，目前只有PCR产物测序法，价格比较贵。因此，针对C-416T处的SNP位点，需要发掘一种结果准确、操作简单、成本低廉的基因型检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种FRZB基因C-416T(起始密码子上游416bp)处SNP位点基因型的鉴定方法。
为此，本发明提供了一种鉴定猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：
步骤一：以猪基因组DNA为模板利用SEQ ID NO:1所示的序列为正向引物、SEQ ID NO:2所示的序列为反向引物进行PCR扩增获得PCR产物；
步骤二：利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切获得酶切片段；
步骤三：对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳图，依据电泳图中酶切片段的长度鉴定基因型。
优选的，所述限制性内切酶为内切酶Nde Ⅰ。
在本发明中，电泳图显示仅有长度为262bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CC型。
在本发明中，电泳图显示有长度为262bp和289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CT型。
在本发明中，电泳图显示仅有长度为289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为TT型。
优选的，PCR扩增的工作反应程序为：94-95℃预变性3-5min；94-95℃变性20-30s，50-60℃退火20-30s，72℃延伸20-30s，30-36个循环；72℃延伸5-8min。
优选的，所述琼脂糖凝胶电泳的条件包括：利用浓度为1-1.5％的琼脂糖凝胶，在120-130V电压下电泳30-40min。
利用本发明所提供的方法，可以对猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点基因型进行快速、准确的鉴定。
附图说明
图1为猪FRZB基因5’侧翼区序列PCR扩增结果示意图；
M为DM2000 plus Marker，C为阴性对照组，1-9泳道中为待测样品1-9，箭头所指处为250bp。
图2为猪FRZB基因SNP位点基因型鉴定电泳图；
M为DM2000 plus Marker，1-9泳道中为待测样品1-9，箭头所指处为250bp。
图3为样品1、2和4的PCR扩增产物测序结果示意图；
A为样品1PCR扩增产物测序结果示意图；B为样品2 PCR扩增产物测序结果示意图；C为样品4 PCR扩增产物测序结果示意图；虚线画出的部分为SNP位点。图中标出的SNP位点与说明书中描述的”FRZB基因起始密码子上游416bp处SNP位点”和序列表中描述的“259mutation”是一致的位点。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明的一种鉴定猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：
步骤一：以猪基因组DNA为模板利用SEQ ID NO:1所示的序列为正向引物、SEQ ID NO:2所示的序列为反向引物进行PCR扩增获得PCR产物；
步骤二：利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切获得酶切片段；
步骤三：对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳图，依据电泳图中酶切片段的长度鉴定基因型。
根据本发明所提供的方法，SEQ ID NO:2所示序列的反向引物的3’末端倒数第一位碱基与猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点(多态位点C-416T，所述多态位点位于猪FRZB基因5’侧翼区)的碱基相邻。本发明的发明人为了能够在PCR产物中引入限制性内切酶可以识别和剪切的序列，在设计引物时创造性的引入了错配碱基，具体的，在SEQ ID NO:2所示序列的反向引物的3’末端倒数第三位碱基引入错配碱基T、倒数第五位碱基引入错配碱基C。由于在该反向引物序列中倒数第三位碱基T和倒数第五位碱基C为错配碱基(倒数第三位碱基在猪FRZB基因序列中的相应位置反向序列为A，倒数第五位碱基在猪FRZB基因序列中的相应位置反向序列为T),因此，错配后PCR扩增产物中多态位点附近序列由TAAAT更改为CATAT(其中第一个和第三个碱基为错配碱基)，而CATAT序列可以与扩增产物中多态G等位基因形成CATATG结构，从而使得扩增产物中多态位点C等位基因片段可被识别CATATG序列的限制性内切酶识别，即C等位基因片段可被内切酶NdeI切开，而T等位基因片段由于没有形成能够被限制性内切酶识别的序列所以不能被切开，因此在酶切后不同的基因型会产生长度不同的酶切片段。本发明通过引物上的错配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先确定的限制性内切酶识别的序列，因此，利用本发明所提供的方法可以克服原序列不具备内切酶识别位点的缺陷，此外，本发明的方法可以通过选择错配的位置来选择价格便宜的内切酶，降低检测SNP的成本，本发明所引入的内切酶识别位点为限制性酶NdeⅠ的识别位点。
本发明中，所述正向引物和反向引物都可以通过常规的引物合成方式合成，例如可以委托生物工程公司合成，合成的引物可以稀释为10μmol/L的浓度备用。所述猪基因组DNA可以按照常规的基因组DNA提取方法进行制备，例如可以参照《分子克隆实验指南》(第二版)中给出的方法采用酚-氯仿抽提法从组织中提取基因组DNA，优选的，所述组织为猪耳组织。PCR扩增体系一般使用20μL反应体系，具体的，可以按照以下方式组成：2×PCR Mix用量为10μL，100ng所述猪基因组DNA，10μmol/L正向引物0.4μL、10μmol/L反向引物0.4μL，最后用dd H2O补充至20μL，混匀，即得PCR扩增反应体系。根据本法明，PCR扩增的工作反应程序为：94-95℃预变性3-5min；94-95℃变性20-30s，50-60℃退火20-30s，72℃延伸20-30s，30-36个循环；72℃延伸5-8min。优选的，PCR扩增的工作反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min获得PCR扩增产物。
通过本发明所提供的方法扩增获得的PCR产物包括猪FRZB基因5’侧翼区的序列(如SEQ ID NO.3所示)，SEQ ID NO.3所示序列包含SNP位点C-416T，该突变可被NdeI内切酶识别。其中，在SEQID NO.3中所给出的259位突变(259 mutation)是FRZB基因起始密码子上游416bp处SNP位点在扩增的PCR产物序列中的位置。
根据本发明的一种实施方式，可以按照以下方法对PCR产物进行酶切：
将PCR产物在10-20μL酶切体系中进行酶切反应：5-10μL的PCR扩增产物、5-10U限制性内切酶、占总体积1/10的10×酶切buffer，最后用ddH2O补充至10-20μL，混匀后置于37℃恒温培养箱中酶切6-14h，获得酶切片段。
在本发明所提供的方法中，可以根据片段大小制作合适浓度的琼脂糖胶，并选择合适的电泳条件和电泳时间。优选的，利用浓度为3.7-4％的琼脂糖凝胶，在60-70V电压下电泳2-2.5h，电泳结束后利用溴化乙锭对凝胶进行染色，而后置于凝胶成像系统中进行观察。
当扩增片段的259bp处碱基均为C时，NdeI内切酶可识别该位点，即可将PCR扩增产物切成两个酶切片段，一个为262bp，另一个片段为27bp(其中27bp电泳图中不能看到)，电泳图显示仅有长度为262bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CC型。当259bp处既含有C碱基又含有T碱基时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别为289bp、262bp和27bp(其中27bp条带在电泳图中不能看到)，电泳图显示有长度为262bp和289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CT型。当259bp处的碱基都为T时，NdeI内切酶不可识别，即PCR扩增产物不能被切开，凝胶中只有一条带，电泳图显示仅有长度为289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为TT型。
本发明还提供了所述鉴定方法在筛选具有高生长速度猪品系中的应用，所述应用包括对不同年龄、性别的猪的基因型进行鉴定，实施猪的早期选育。
在本发明所提供的方法对于被检测的猪品种没有特别的限制，可以对任何一种猪的基因型进行鉴定，所述猪的品种包括但不限于淮猪新品系、滇南小耳猪、藏猪、大浦脸猪、大约克、长白和杜洛克等，在本发明的一种实施方式中，所述猪品系为淮猪新品系。
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
以下实施例中：
试剂：PCR Mix购自北京京汇欣公司；限制性内切酶NdeI购自NEB公司，引物由北京六合华大公司合成。
猪耳组织采集自安徽省科鑫养猪育种有限公司培育和饲养的淮猪新品系群体。淮猪新品系为安徽省农科院和安徽省科鑫养猪育种有限公司培育的猪新品系，含有中国地方猪淮猪和引进的长白猪和大约克猪血统，经过杂交、横交和连续多代选育而成。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的鉴定方法。
1、组织DNA提取
采用酚-氯仿抽提法从猪耳组织1-9中提取基因组DNA作为待测样品，方法参照《分子克隆实验指南》(第二版)。
2、PCR扩增
对样品1-9分别进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系2×PCRMix10μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，双蒸水8.2μL，DNA模板1μL。PCR反应条件为第1步95℃变性5min；第2步95℃变性20s；第3步56℃复性20s；第4步72℃延伸20s；重复第2至第4步35个循环，之后再72℃延伸5min，最后降温至4℃保存，获得PCR扩增产物1-9，用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶对扩增产物1-9进行电泳，120V电压条件下电泳30min，溴化乙锭染色后凝胶成像观察PCR扩增产物1-9的扩增结果，结果见图1。
3、酶切PCR扩增产物
对PCR产物1-9用内切酶NdeI酶切，反应体系为：10×Buffer 1μL，内切酶NdeI 0.5μL(浓度为10U/μL)，PCR产物5μL，加dd H2O至10μL。37℃环境中酶切8h。
4、酶切片段鉴定
将得到的酶切产物在3.7％琼脂糖凝胶，60V电压条件下电泳2h，溴化乙锭染色后于凝胶成像系统中观察。结果参见图2。
在图2中，样品1、3和7仅有长度为262bp的酶切片段，鉴定为CC基因型；样品2、6和8显示有长度为262bp和289bp的酶切片段，鉴定为CT型；样品4、5和9显示仅有长度为289bp的酶切片段，鉴定为TT型。
测试例1
本测试例用于说明本发明所提供的鉴定方法的准确性。
对实施例1中的样品1、2和4的PCR扩增产物送北京六合华大公司进行测序，验证鉴定结果的准确性。结果见图3。图3中A图为样品1的测序结果，B图为样品2的测序结果，C图为样品4的测序结果。结果显示实施例1中给出的鉴定结果与测序结果完全吻合，证明了鉴定方法的准确性和可行性。
从上述实施例和测试例的结果可以看出，本发明针对使用测序法鉴定FRZB基因起始密码子上游416bp处SNP位点基因型的缺点，通过设计错配碱基来创造酶切位点，使得引物扩增后形成一个酶切位点。由于这种方法应用了3’端错配方法，PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，并且检测方法简单易操作，成本低，酶切的结果容易分辨，是一种鉴定基因型的准确、有效方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种鉴定猪FRZB基因中起始密码子上游416bp处SNP位点基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：以猪基因组DNA为模板利用SEQ ID NO:1所示的序列为正向引物、SEQ ID NO:2所示的序列为反向引物进行PCR扩增获得PCR产物；
步骤二：利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切获得酶切片段；
步骤三：对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳图，依据电泳图中酶切片段的长度鉴定基因型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为内切酶Nde Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，电泳图显示仅有长度为262bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CC型。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，电泳图显示有长度为262bp和289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为CT型。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，电泳图显示仅有长度为289bp的酶切片段，鉴定所述SNP位点的基因型为TT型。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，PCR扩增的工作反应程序为：94-95℃预变性3-5min；94-95℃变性20-30s，50-60℃退火20-30s，72℃延伸20-30s，30-36个循环；72℃延伸5-8min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的条件包括：利用浓度为1-1.5％的琼脂糖凝胶，在120-130V电压下电泳30-40min。
8.权利要求1-7中所述的方法在筛选具有高生长速度猪品系中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述猪品系为淮猪品系。
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