CN102899321A

CN102899321A - 刀鲚性别特异srap标记带的筛选方法及性别鉴定方法

Info

Publication number: CN102899321A
Application number: CN 201210382307
Authority: CN
Inventors: 张敏莹; 施炜纲; 徐东坡; 刘凯; 段金荣; 方第安
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明公布了一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及性别鉴定方法，通过49对引物对的SRAP-PCR反应，筛选刀鲚性别特异SRAP标记带，然后用特异引物对扩增性别未知刀鲚的DNA样品，通过能否扩增出相应特异条带来鉴别刀鲚的性别。本发明克服了刀鲚现有性别鉴定技术的局限和不足，提供了一种准确、便捷的性别鉴定方法。

Description

刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及性别鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及性别鉴定方法，属于渔业生物技术领域。

背景技术

刀鲚(Coilia ectenes Jordan et Seale)又名长颌鲚，俗称刀鱼、毛刀鱼，隶属鲱形目(Clupeiformes)，鲱科(Clupeidae)，鲚属 (Coilia)。其肉质细嫩，味道鲜美，是长江中下游重要的洄游性经济鱼类。由于多年持续高强度捕捞及水域环境污染等原因，刀鲚自然资源量锐减，洄游群体低龄化趋势明显。为了保护和利用刀鲚资源，近年来不少科研单位开始尝试刀鲚的池塘养殖和人工繁殖。要实现刀鲚的人工繁殖，需要对灌江纳苗养殖的刀鲚后备亲鱼进行雌雄配对和注射催产激素。刀鲚的性成熟期为2-3年，由于刀鲚雌雄鱼没有明显形态差异，只在繁殖季节成熟雌、雄鱼腹部膨胀隆起的轮廓略有差异。传统的性别鉴定方法主要靠解剖性腺组织和在成熟期进行外部形态观察。但是，解剖法对鱼体有致命的伤害，外部形态观察只能在繁殖季节对性成熟亲鱼进行鉴定。对未达性成熟或非繁殖季节的成熟刀鲚，没有有效的方法来进行性别鉴定；现有性别鉴定技术严重制约了刀鲚的人工繁殖及池塘养殖技术的发展。

SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是由美国加州大学Li与Quiros博士开发出的新型DNA分子标记技术。其原理是利用独特的正反引物设计，对开放阅读框进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与外显子间隔区长度不同而产生多态性。该分子标记技术有简便、快速、稳定、不需预知序列信息等优点，不仅广泛应用于植物的遗传多样性分析、基因定位和遗传图谱构建等，近年来已在水产动物遗传多样性及相关分子标记的筛选等方面得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的提供一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及分子水平的刀鲚性别鉴定方法，克服了刀鲚现有性别鉴定技术的局限和不足，提供了一种准确、便捷的性别鉴定方法。

刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法，包括以下步骤：

（1）采集刀鲚样本，解剖鱼体进行性别鉴定，分别提取雌、雄样本总DNA；（2）设计SRAP引物序列（见表1）14条共49对，分别进行SRAP-PCR扩增，筛选出雌、雄性别特异标记带SRAP1和SRAP2；

表1用于刀鲚SRAP-PCR反应的引物信息

（4）回收性别特异标记带SRAP1、SRAP2，测序。

本发明还提供一种分子水平的刀鲚性别鉴定方法，包括以下步骤：

（1）采集未知性别的刀鲚样本，提取样本总DNA；（2）分别以引物对P1F/P1R、P2F/P2R为引物，以样本总DNA为模板进行PCR扩增；（3）电泳检测扩增产物，能扩增出SRAP1标记带的即为雌刀鲚，能扩增出SRAP2标记带的即为雄刀鲚。

上述两种方法中，PCR反应体系为：25μL，含有Mg²⁺ 1.5 mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA 60ng、 dNTPs 0.20mmol/L、引物0.2μmol/L；反应条件为： 94℃3 min；94℃1 min，35℃1min，72℃1 min，5个循环；94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，35个循环；72℃8min，4℃保存。

本发明提供的刀鲚性别鉴定方法，与现有技术相比具有以下优势：

（1）外部形态观察法只能在繁殖季节对性成熟刀鲚进行性别鉴定，本发明使用SRAP分子标记方法可在任何季节对刀鲚进行有效的性别鉴定；

（2）本发明采用SRAP分子标记方法对刀鲚进行性别鉴定，仅需剪取小部分鳍条即可，对鱼体没有致命伤害，不影响鱼的正常生长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地说明，但不构成对本发明的限制。

1、性别特异SRAP标记带的筛选

包括如下步骤：

（1）采集刀鲚样本，解剖鱼体进行性别鉴定，分别提取雌、雄样本总DNA；

（2）设计14条SRAP引物，序列见表1；

表1用于刀鲚SRAP-PCR反应的引物信息

（3）通过预实验，探索最佳SRAP-PCR反应体系为：25μL的PCR体系中含有Mg²⁺1.5 mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA 70ng、 dNTPs 0.20mmol/L、引物0.2μmol/L；扩增条件为： 94℃3 min；94℃1 min，35℃1min，72℃1 min，5个循环；94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，35个循环；72℃8 min，4℃保存；

（4）用上述14条共49对引物组合扩增刀鲚雌、雄样本总DNA，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选得到雌性别特异条带SRAP1和雄性别特异条带SRAP2；

（5）利用glassmilk(上海申能博彩生物有限公司)纯化试剂盒分别回收性别特异条带SRAP1、SRAP2，测序。

2、刀鲚性别鉴定方法的构建及验证

（1）根据SRAP1、SRAP2的序列，设计雌、雄性别特异引物对P1F/P1R、P2F/P2R；

（2）分别以雌、雄样本的DNA为模板，采用上述SRAP-PCR反应体系及条件，分别以P1F/P1R、P2F/P2R为引物进行PCR扩增；

（3）PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果为：雌性样本扩增得到了特异条带SRAP1，雄性样本扩增得到了特异条带SRAP2，此结果证实了本方法的可行性及准确性。

3、方法的应用

剪取未知性别刀鲚的少许鳍条，抽提DNA样本为模板，用与2中相同的方法和条件进行PCR扩增，并电泳检测结果，得到了特异条带SRAP2，说明此刀鲚为雄性。

本发明采用SRAP分子标记方法对刀鲚进行性别鉴定，仅需剪取小部分鳍条即可，对鱼体没有致命伤害，不影响鱼的正常生长。

Claims

1.一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）采集刀鲚样本，解剖鱼体进行性别鉴定，分别提取雌、雄样本总DNA；（2）设计SRAP引物序列（见表1）14条共49对，分别进行SRAP-PCR扩增，筛选出雌、雄性别特异标记带SRAP1和SRAP2，

正向引物（5′—3′）：

me1 TGAGTCCAAACCGGATA

me2 TGAGTCCAAACCGGAGC

me3 TGAGTCCAAACCGGAAT

me4 TGAGTCCAAACCGGACC

me5 TGAGTCCAAACCGGAAG

me6 TGAGTCCAAACCGGTAA

me7 TGAGTCCAAACCGGTCC

反向引物(5′—3′)：

em1 GACTGCGTACGAATTAAT

em2 GACTGCGTACGAATTTGC

em3 GACTGCGTACGAATTGAC

em4 GACTGCGTACGAATTTGA

em5 GACTGCGTACGAATTAAC

em6 GACTGCGTACGAATTGCA

em7 GACTGCGTACGAATTCAA；

（3）回收性别特异标记带SRAP1、SRAP2，测序。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述SRAP-PCR反应体系为：25μL的PCR体系中含有Mg²⁺ 1.5 mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA 60ng、 dNTPs 0.20mmol/L、引物0.2μmol/L。

3.一种刀鲚性别鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）采集未知性别的刀鲚样本，提取样本总DNA；（2）分别以引物对P1F/P1R、P2F/P2R为引物，以样本总DNA为模板进行PCR扩增；（3）电泳检测扩增产物，能扩增出如权利要求1中所述的SRAP1标记带的即为雌刀鲚，能扩增出如权利要求1中所述的SRAP2标记带的即为雄刀鲚。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的PCR反应体系为：25μL的PCR体系中含有Mg²⁺ 1.5 mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA 60ng、 dNTPs 0.20mmol/L、引物0.2μmol/L。