CN105002171A - 一种与中华绒螯蟹体重相关的snp标志及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与中华绒螯蟹体重相关的SNP标志及其应用。与中华绒螯蟹体重相关的SNP标记，位于MIH基因的5’-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP？g.372T>C，该SNP位点与中华绒螯蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型个体的平均体重。通过对河蟹育种群体进行SNP？g.372T>C基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。

Description

一种与中华绒螯蟹体重相关的SNP标志及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种与中华绒螯蟹体重相关的SNP标志及其应用。
背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheirsisensis)又称为河蟹，是长江中下游地区重要的水产养殖对象。自然条件下，河蟹一般为2年生，每年秋季成蟹洄游到出海的河口交配、产卵，第二年3～5月孵化，发育成幼蟹(大眼幼体、仔蟹、蟹种)后，再溯江河而上，在淡水中继续发育长大为成蟹。一般而言，在河蟹养殖过程放养较大规格(体重)的蟹种可以获得较大的成蟹捕捞规格。因此，在河蟹苗种培育过程中，大规格蟹种的市场需求一直较大，养殖效益通常较好，其价格也相应最高。在之前的研究中，已有许多研究者尝试从蟹种培育池形状(面积)、蟹苗投放密度、饲料投喂、水质调控、水草种植等各个方面探讨大规格蟹种的培育模式，目前国内外尚未见蟹种规格(体重)相关分子标记开发及应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述空白，提供一种与中华绒螯蟹(蟹种)体重相关的SNP标志及其应用。
本发明的另一目的是提供该SNP标志的分子标记及其引物和应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
与中华绒螯蟹体重相关的SNP标记，所述SNP标记位于河蟹蜕皮抑制激素基因MIH的5’-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP g.372T>C，该SNP位点与中华绒螯蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型个体的平均体重；所述的MIH基因Genbank检索号为AY310313。
一种基于所述的SNP标记开发分子标记的方法，以含有所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以中华绒螯蟹基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。
按照上述的方法得到的分子标记。
所述的分子标记序列优选如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。
一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
一种检测所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增中华绒螯蟹基因组中含有本发明所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的T/C多态性。
所述的方法优选包括以下步骤：
(1)取中华绒螯蟹的腿部肌肉并提取基因组DNA；
(2)用已提取的中华绒螯蟹基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的引物进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，分析酶切结果，根据酶切结果判断在SEQ ID NO：1第126位的T/C多态性。
本发明所述的SNP标记、分子标记、引物在选育大规格中华绒螯蟹新品种中的应用。
一种选育大规格中华绒螯蟹新品种的方法，包括检测中华绒螯蟹MIH基因的372bp处的基因型，选育该核苷酸位点为CC型的个体作为亲蟹。
有益效果：
河蟹等甲壳动物的生长是跳跃式的，通过蜕皮才能生长，蜕皮过程与其发育、生长、繁殖、附肢再生等重要生理过程密切相连。本发明以河蟹蜕皮抑制激素基因(MIH)上的单核苷酸多态位点为研究目标，发现位于MIH基因5’-侧翼区的一个SNP位点(SNP g.372T>C)与蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型(P<0.05)个体。在以规格(体重)为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.372T>C基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。
附图说明
图1.SNP g.372T>C的基因分型图谱以及PCR产物直接测序验证图谱
注:采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法进行基因分型，并通过PCR产物直接测序的方法加以确认。电泳图谱中1号泳道为CC基因型，2号泳道为TT基因型，3号泳道为CT基因型。
具体实施方式
实施例1
采集处于同样培育条件下的不同规格蟹种300只以上，测量每只蟹种的外部形态指标，其平均体重为：8.26±3.29g。从中随机取170只蟹种，取其腿部肌肉，采用酚氯仿法提取其基因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法(PCR-RFLP)对所有蟹种个体进行基因分型。
①PCR反应
PCR产物扩增长度为224bp，PCR引物为：
上游引物：5’-GCTTCAACAGGGGAACAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物：5’-TTAGTTTGAGGACGCACGTG-3’(SEQ ID NO.3)。
PCR扩增序列信息如SEQ ID NO.1所示，其中第126位存在T/C多态性。
PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 6.25μL，Mg2+(2.5mmol/L)6.25μL，dNTP(2.5mmol/L)3.75μL，正反向引物各1μL(10nmol/L)，Taq酶0.5U，DNA模板1μL(100ng/μL)，双蒸水补足体积至50μL。
PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸5min。
扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20℃保存用于后续的酶切反应。
②酶切条件
采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，酶切体系包括10×NEB缓冲液1μL，PCR产物5μL，MboII 0.25μL，双蒸水补足体积至10μL。37℃酶切过夜后用2％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，以确定各个蟹种个体的基因型。
(3)不同基因型个体与蟹种体重的相关性分析
对基因分型成功的所有蟹种的体重进行单因素方差分析，采用LSD法对表现出显著性差异的不同基因型蟹种的体重进行两两比较，分析不同基因型与蟹种体重之间的相关性。
表1 MIH基因SNP g.372T>C变异与蟹种体重的相关性
注：同列标注不同的字母表示差异显著(P<0.05).
结果表明，位于MIH基因5’-侧翼区的一个SNP位点(SNP g.372T>C)与蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性(表1)，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型个体(P<0.05)。
SNP g.372T>C位点的PCR-RFLP基因分型及测序验证结果图示见图1。在以规格(体重)为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.372T>C基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。

Claims (10)

1.与中华绒螯蟹体重相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于河蟹蜕皮抑制激素基因MIH的5’-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP g.372 T>C，该SNP位点与中华绒螯蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型个体的平均体重；所述的MIH基因Genbank检索号为AY310313。
2.一种基于权利要求1所述的SNP标记开发分子标记的方法，其特征在于，以含有权利要求1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以中华绒螯蟹基因组DNA为模板进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。
4.按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。
5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于，分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。
6.一种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。
7.一种检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于，包含PCR扩增中华绒螯蟹基因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的T/C多态性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取中华绒螯蟹的腿部肌肉并提取基因组DNA；
(2)用已提取的中华绒螯蟹基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的引物进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，分析酶切结果，根据酶切结果判断在SEQ ID NO：1第126位的T/C多态性。
9.权利要求1所述的SNP标记、权利要求4或5所述的分子标记、权利要求6所述的引物在选育大规格中华绒螯蟹新品种中的应用。
10.一种选育大规格中华绒螯蟹新品种的方法，其特征在于，包括检测中华绒螯蟹MIH基因的372bp处的基因型，选育该核苷酸位点为CC型的个体作为亲蟹。
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