CN103882115B - 甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物生物技术领域中的绵羊生长速度的分子标记辅助育种技术，具体涉及到甘肃高山细毛羊生长速度相关基因等位基因检测试剂盒。一种甘肃高山细毛羊生长速度相关基因Leptin的PCR‑SSCP检测试剂盒，其特征是包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0。本发明的优点是本发明对甘肃高山细毛羊的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。

Description

甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测 试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到绵羊生长速度的相关基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
瘦素（Leptin）是由肥胖基因（obese gene）编码，由脂肪细胞分泌的一种多肽激素（Trayhurn et al.,1996）。它可以通过增加能量的释放、基础代谢率和非颤抖性产热来增强动物适应寒冷环境的耐受能力（Peino et al.,2000；Grosfeld et al.，2002；Li etal.，2005），在适应高海拔低温缺氧环境中的能量平衡方面起重要作用。作为研究牛、羊生长发育、肉质等性状的重要候选基因，Leptin对家畜的青春期发育（Chen et al.，2000）、生殖器官发育（Ducy et al.，2000）、繁殖性能（Korner et al.，1999）、妊娠（Mercer et al.，2000）、胚胎发育（Chagnon et al.，2000）以及造血系统（Jin et al.，2000）都有调节功能。是研究家畜生产性能等经济性状的最佳标记基因之一。
绵羊Leptin基因定位在4q32上，由3个外显子和2个内含子组成，编码序列主要在第2和第3外显子上。截止目前，在绵羊Leptin基因第3外显子上发现了5个等位基因（Zhouet al.，2009），在第2外显子上没有发现多态性（黄丹丽等，2008）。绵羊Leptin基因多态性与其摄食水平（Marie et al.2001）、饮食营养价值（Blache et al.2000）、体脂肪量（Delavaud et al.2000）、肌肉生长及肉质性状（Boucher et al.2005）具有相关性。
目前Leptin基因已成为绵羊生长性状的候选基因而被国内外广泛研究，并在分子遗传育种标记方面加以应用。绵羊生长速度相关基因分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测绵羊的Leptin基因第3外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的绵羊生长速度的强弱，从而判断是否可以留作种用。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低，用于甘肃高山细毛羊生长速度相关基因分子选种技术。
通过PCR-SSCP对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合生产性能相关的生产数据，确定控制生长速度的等位基因，为改善甘肃高山细毛羊生产性能提供指导。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'和Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
所述的Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为：
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和Leptin*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与Leptin*C标准样带型一致的样品为携带影响甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。
一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于检测步骤为：
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F和Leptin-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引用引物序列为：
Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'
Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，10℃电泳16h，银染法显色后拍照。
（5）结果判断：
对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的PCR-SSCP检测，有4个等位基因，影响甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列为：
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*A核苷酸序列或Leptin*B核苷酸序列或Leptin*D核苷酸序列。
控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccaggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcggcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*A核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccgggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcggcagctggacctcagccctgggtgctgaagcctt gaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响Leptin*B核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccgggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcagcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响Leptin*D核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctgg
agaacctccaggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcagcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag。
本发明的有益效果：反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型绵羊养殖企业的生产性能的改良。
本发明利用PCR-SSCP技术对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合生长速度相关的生产数据，确定生长较快的等位基因，为改善绵羊生产性能提供指导。本发明通过对试验甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的SSCP分析，发现了4个（A、B、C和D）等位基因。其中，C等位基因对甘肃高山细毛羊生长速度影响较显著。
本发明对甘肃高山细毛羊的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
附图说明：
图1是甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的PCR-SSCP检测凝胶图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以甘肃高山细毛羊生产性能分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒，包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'和Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
所述的Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
实施例2：所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为：
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和Leptin*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与Leptin*C标准样带型一致的样品为携带控制甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。
实施例3：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F和Leptin-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引用引物序列为：
Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'
Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，10℃电泳16h，银染法显色后拍照。
（5）结果判断：
对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的PCR-SSCP检测，有4个等位基因，控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列，
控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccaggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcggcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*A核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccgggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcggcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*B核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctggagaacctccgggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcagcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*D核苷酸序列为：
taccaacagatcctcgccagtctgccttccagaaatgtgatccaaatatctaatgacctgg
agaacctccaggaccttctccacctgctggccgcctccaagagctgccccttgccgcaggtcagggccctggagagcttggagagcctgggcgtcgtcctggaagcctccctctactccaccgaggtggtggccctgagccggctacaggggtctctacaggacatgttgcagcagctggacctcagccctgggtgctgaagccttgaag。
实验例1：
试验材料
甘肃高山细毛羊315只选自甘肃省天祝藏族自治县松山镇牧民羊群，所选羊只全部颈静脉采血10ml，加入酸性柠檬酸葡萄糖（Acid Citratedextrose，ACD）抗凝，-20℃冻存。所采集血样的试验羊只均标注耳号，处同等饲养条件，并对试验羊只进行1-4月龄（断奶重）体重观测，其中初生重在羔羊吮初乳前称重，1月龄、2月龄、3月龄和4月龄体重均在相同时间间隔段、早晨空腹时称重。
试验方法
1.引物设计和PCR扩增
根据Genbank已公布绵羊Leptin基因序列（登录号：EF534370），应用Primer5.0在线设计特异性引物，对绵羊Leptin基因第3外显子长为271p的部分外显子进行扩增。引物序列为：上游5’-TACCAACAGATCCTCGCCAGTC-3’；下游5’-CTTCAAGGCTTCAGCACCCA-3’，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
最佳反应体系及条件：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F和Leptin-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，基因组DNA模板1.0μL，ddH2O补充体积至20μL；
PCR反应条件：94℃预变性5min，32个循环（94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
引用引物序列为：
Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'；
Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'。
得到271bp的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。
2.SSCP检测
取步骤1中2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)]，98℃变性10min，立即冰浴10min。12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc:Bis=37.5:1）200V电压条件下，10℃电泳16h，银染法显色后拍照。其中，对PCR扩增产物进行SSCP检测，结果在所检测的315只甘肃高山细毛羊中检测到4个等位基因，分别命名为Leptin*A、*B、*C和*D。
甘肃高山细毛羊的Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
3.基因测序
根据SSCP胶图分析结果，选取不同基因型的个体，纯合子进行PCR扩增，检测后直接测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子个体中PCR产物，进行克隆纯化后测序。基因由北京六合华大基因公司测定。测定结果通过MegAlign软件与GenBank序列进行比对。
4.数据分析
根据实验结果，利用Popgen软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数（Ne）、纯合度（Ho）、杂合度（He），利用PIC软件计算多态性信息含量（PIC）。根据最小二乘线性模型，用Spass20.0软件对不同基因型、等位基因与生长发育性状（初生重、1月龄体重、2月龄体重、3月龄体重、4月龄（断奶重）、平均日增重）进行相关性分析。
统计模型如下：
Yij=μ+Genotypei+Genderj+Genotypei×Genderj+eij
Yij=μ+Allelei+Genderj+Allelei×Genderj+eij
其中Yij为性状表型值，μ为群体均值；Genotypei为基因型效应；Genderj为性别效应；Allelei为等位基因效应；Genotypei×错误!未找到引用源。Genderj为基因型与性别互作效应；eij为随机误差。
5.甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子等位基因频率及生长速度的相关性分析表1甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子等位基因频率
表2甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子各等位基因与生长速度的关联性
5.结果分析
通过各等位基因的存在/缺失对甘肃高山细毛羊Leptin基因生长性状的影响分析表明（表2），等位基因C的存在/缺失与甘肃高山细毛羊1月龄、2月龄、4月龄体重和平均日增重关联性均显著（P<0.05），存在等位基因C的个体平均值显著（P<0.05）高于缺失C的个体，同一生长阶段存在等位基因C的个体平均体重最高，而存在等位基因B的个体平均体重最低；虽然等位基因B和D与各阶段的生长特征不显著（P>0.05），但缺失等位基因B和D的个体平均体重均高于存在B和D的个体体重，因此，可认为选留携带等位基因C的个体，淘汰携带等位基因B和D的个体可提高甘肃高山细毛羊的生长性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version3.3
<210> 1
<211> 271
<212> DNA
<213> 控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列
<400> 1
<210> 2
<211> 271
<212> DNA
<213> 对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*A核苷酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 271
<212> DNA
<213> 对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*B核苷酸序列
<400> 3
<210> 4
<211> 271
<212> DNA
<213> 对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*D核苷酸序列
<400> 4

Claims (3)

1.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的 PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH 8. 0；
所述的PCR反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F: 5’ TACCAACAG
ATCCTCGCCAGTC 3'和Leptin-R: 5’ CTTCAAGGCTTCAGCACCCA 3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL；
所述的Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc aggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcggcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g。
2.如权利要求1所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的 PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于检测步骤为：
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA50ng与试剂盒中PCR反应液混合，反应条件：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30s，退火62℃ 30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和Leptin*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与Leptin*C标准样带型一致的样品为携带影响甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体；
所述Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc aggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcggcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g。
3.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的 PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml，ACD抗凝，- 20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为 100μM，引物Leptin-F和Leptin-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA 50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30s，退火62℃ 30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃ 10min；
引物序列为：
Leptin-F: 5’ TACCAACAGATCCTCGCCAGTC 3'
Leptin-R: 5’ CTTCAAGGCTTCAGCACCCA 3'
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8.0 ，98℃变性10min ，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，10℃电泳16h ，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的PCR-SSCP检测，有4个等位基因，通过甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子等位基因频率及生长速度的相关性分析，影响甘肃高山细毛羊生长速度的是甘肃高山细毛羊Leptin基因的等位基因Leptin*C；
所述等位基因Leptin*C的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc aggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcggcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g；
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的是甘肃高山细毛羊Leptin基因的等位基因Leptin*A、Leptin*B和、Leptin*D；
所述Leptin*A的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc gggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcggcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g；
所述Leptin*B的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc gggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcagcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g ；
所述Leptin*D的核苷酸序列为：
taccaacaga tcctcgccag tctgccttcc agaaatgtga tccaaatatc taatgacctg
gagaacctcc aggaccttct ccacctgctg gccgcctcca agagctgccc cttgccgcag
gtcagggccc tggagagctt ggagagcctg ggcgtcgtcc tggaagcctc cctctactcc
accgaggtgg tggccctgag ccggctacag gggtctctac aggacatgtt gcagcagctg
gacctcagcc ctgggtgctg aagccttgaa g 。
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4个绵羊品种Leptin基因部分片段的SNPs多态性与生长发育性状的相关性分析;黄丹丽等;《畜牧兽医学报》;20081231;第39卷(第12期);1640-1646 *

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