CN111154896A - 一种与甘肃金鳟生长性状相关的snp标记及其方法应用 - Google Patents
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Abstract
一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其具体方法如下：（1）样本采集；（2）PCR扩增，扩增上游引物：TGGTTGCTGATAATGTACGCC；扩增下游引物：AGGCAGTGTATCGCTATCCA；（3）基因型判定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP方法来检测甘肃金鳟的基因型，根据凝胶条带的分布，得到5种类型的Ghrelin基因型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型。本发明的有益效果是本发明提供的分子遗传标记不受甘肃金鳟年龄的限制，可用于甘肃金鳟早期幼鱼的选育筛选，能够显著加快甘肃金鳟的遗传育种工作。检测甘肃金鳟Ghrelin基因多态性的方法准确可靠，操作简便。同时甘肃金鳟Ghrelin基因SNP位点的检出，为甘肃金鳟生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明属于鱼类分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记及其方法应用。
背景技术
Ghrelin是生长激素促分泌受体(GHSR)的内源性配体，可与GHSR结合刺激生长激素的释放。1999年日本科学家小岛首次在小鼠的胃和下丘脑弓状核中发现。近年来，已在鳗鱼、罗非鱼、鲶鱼、大西洋鲑鱼、虹鳟等鱼类中成功克隆出了的Ghrelin基因。根据Ghrelin及其受体在内脏和大脑中的分布，Ghrelin基因可以调节食物摄入和能量平衡，影响激素分泌，协调脊椎动物的GH/IGF-1轴。Shepherd的研究表明，给虹鳟鱼注射小鼠的静脉Ghrelin基因，可在2-5小时内提高其食物摄取量，其原因可能是与虹鳟与小鼠之间的Ghrelin基因序列相似性为39%有关。将含Ghrelin的渗透体的芯片移入罗非鱼体内，结果发现21d后罗非鱼体重较0d明显增加(P<0.05)，可能是由于食物摄入量急剧增加。因此，Ghrelin基因是一种与生长性状相关的潜在候选基因，它能影响饲料的摄入量。通过对鸡Ghrelin基因外显子1的一段8bp 插入序列多态性进行基因分型，分析其与鸡生长和胴体性状的关系，发现该该片段与大部分体重和体组成性状显著相关。Zhang等人研究了中国黄牛Ghrelin基因的5个DNA片段的变异，包括5 '调节区exon1、intron1和exon2。结果表明，G-1基因型与坐骨宽度相关。同样，水牛体内的Ghrelin基因也会影响乳脂和蛋白质的合成。因此，在Ghrelin基因中观察到的多态性可以作为辅助选择的分子标记。
甘肃金鳟(Oncorhynchus mykiss)是由虹鳟选育而成的优良品种，具有肉嫩、味美、生长速度快等特点，在2007年被列入中华人民共和国农业部公布的水产养殖新品种。目前对甘肃金鳟的研究主要集中在养殖技术、营养价值、遗传多样性等方面。本发明利用PCR-SSCP检测甘肃金鳟Ghrelin基因多态性，分析其与生长性状的相关性，试图寻找一些有效的分子标记用于甘肃金鳟育种，为甘肃金鳟育种推广提供技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的问题，而提供一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，通过选用合适的引物PCR扩增来判定基因型。
本发明的另一目的是提供与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的应用，通过使用聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP方法来检测待测甘肃金鳟的基因型，根据基因型进行甘肃金鳟生长性状的品种选育。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案。
一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其具体方法如下：
（1）样本采集
采集甘肃金鳟标本的尾鳍组织提取基因组DNA备用；
（2） PCR扩增
提取后的DNA进行Ghrelin基因 PCR扩增，扩增上游引物：TGGTTGCTGATAATGTACGCC；扩增下游引物：AGGCAGTGTATCGCTATCCA；
（3）基因型判定
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP方法来检测甘肃金鳟的基因型，根据凝胶条带的分布，得到5种类型的Ghrelin基因型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型。
所述步骤（1）中甘肃金鳟标本尾鳍组织的基因组DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304。
所述步骤（2）中PCR扩增具体如下：
Ghrelin基因的PCR扩增体系为25ul，包括10×PCR缓冲液5.0 ul，体积浓度为10mM的引物1.0 ul，体积浓度为10mM的dNTPs 1.0 ul， Taq聚合酶1U，模板DNA 3 ul；
PCR反应条件为94℃初始变性3min, 94℃变性45s, 58℃退火45s, 72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸8min, 4℃保存。
所述步骤（1）中甘肃金鳟标本尾鳍组织的基因组DNA提取后在4℃保存备用。
所述引物由天一生物科技股份有限公司(武汉)合成。
上述与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的应用，其具体方法如下：
a、在每尾甘肃金鳟标本个体背部肌肉中注射电子标签，测量每尾个体的生长性状；
b、利用上述与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP分析，用凝胶回收试剂盒纯化后连接到pMD19-T载体，转入大肠杆菌DH5α菌株，用菌液PCR法筛选阳性克隆进行生物测序，测序后利用CLUSTAL X2软件对序列进行比对，找出突变位点；结果显示等位基因A的频率高于等位基因B和等位基因C的频率，为优势等位基因；最终判定甘肃金鳟标本基因型分为5类型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型；
c、建立统计模型，应用LSD法统计分析甘肃金鳟表型性状与基因型的相关性，结果显示基因型对体长和体重均有显著影响，对全长、体高、体宽、头长和眼间距影响不显著，其中Ghrelin基因的BB基因型的体长值和体重值都高于其它4种基因型。
所述c中采用 SPSS13.0 软件的general linear model过程，应用LSD法统计分析甘肃金鳟表型性状与基因型的相关性，统计模型为：Yij=μ+Pi+eij ，其中，Yij为第i基因型第j个个体生长性状表型值，μ为生长性状均值，Pi为第i个个体基因型效应值，eij为随机残差。
本发明的有益效果是本发明提供的分子遗传标记不受甘肃金鳟年龄的限制，可用于甘肃金鳟早期幼鱼的选育筛选，能够显著加快甘肃金鳟的遗传育种工作。检测甘肃金鳟Ghrelin基因多态性的方法准确可靠，操作简便。同时甘肃金鳟Ghrelin基因SNP位点的检出，为甘肃金鳟生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明甘肃金鳟标本DNA经PCR后的5种基因型的SSCP分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，具体如下：
1.1样本采集
甘肃金鳟样本300尾，在每尾个体背部肌肉中注射电子标签，测量每尾个体的生长性状。并采集每个标本的尾鳍组织保存在质量分数为95%乙醇中进行分子研究，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304提取基因组DNA，基因组DNA提取后在4℃保存备用。
1.2 PCR扩增
进行Ghrelin基因 PCR扩增，根据Oncorhynchus mykiss Ghrelin序列AB100839设计引物，上游引物：TGGTTGCTGATAATGTACGCC；下游引物：AGGCAGTGTATCGCTATCCA。引物由天一生物科技股份有限公司(武汉)合成。
Ghrelin基因的PCR扩增体系为25ul，包括10×PCR缓冲液5.0 ul，体积浓度为10mM的引物1.0 ul，体积浓度为10mM的dNTPs 1.0 ul， Taq聚合酶1U，模板DNA 3 ul；PCR反应条件为94℃初始变性3min, 94℃变性45s, 58℃退火45s, 72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸8min, 4℃保存。
1.3 基因型判定
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP方法来检测待测甘肃金鳟的基因型，根据凝胶条带的分布，基因型最后判定为5类型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型。五种基因型的分型结果如图1所示。
实施例2
一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的应用-不同基因型与生长性状的关联分析与应用。
2.1 序列分析
PCR产物经SSCP分析后，选择不同基因型的PCR产物用凝胶回收试剂盒纯化后连接到pMD19-T载体，转入大肠杆菌DH5α菌株，用菌液PCR法筛选阳性克隆，送上海美吉生物测序。测序后利用CLUSTAL X2软件对序列进行比对，找出突变位点。
表1 甘肃金鳟Ghrelin基因多态位点的基因型及其等位基因频率
由表1可知，甘肃金鳟300尾个体中，在Ghrelin基因内含子区突变点表现为AA基因型有87尾， AB基因型有96尾，这两种基因型的个体数量最多。AB基因型频率最高，为0.3200。等位基因A的频率高于等位基因B和等位基因C的频率，为优势等位基因(表1)。
2.2 数据统计分析
采用 SPSS13.0 软件的 GLM(general linear model)过程，应用LSD法统计分析甘肃金鳟表型性状与基因型的相关性。
统计模型：Yij=μ+Pi+eij 其中，Yij为第i基因型第j个个体生长性状表型值，μ为生长性状均值，Pi为第i个个体基因型效应值，eij为随机残差。
表2 甘肃金鳟Ghrelin基因多态性与生长性状的相关性
注: 同列中平均数肩注不同表示差异显著(P<0.05)
由表2可知，对甘肃金鳟Ghrelin基因型与生长相关性状进行了相关性分析，对体长和体重均有显著影响(P<0.05)，对全长、体高、体宽、头长和眼间距影响不显著，其中Ghrelin基因的BB基因型的体长值和体重值都高于其它基因型。
Claims (7)
1.一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其特征在于具体方法如下：
（1）样本采集
采集甘肃金鳟标本的尾鳍组织提取基因组DNA备用；
（2） PCR扩增
提取后的DNA进行Ghrelin基因 PCR扩增，扩增上游引物：TGGTTGCTGATAATGTACGCC；扩增下游引物：AGGCAGTGTATCGCTATCCA；
（3）基因型判定
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP方法来检测甘肃金鳟的基因型，根据凝胶条带的分布，得到5种类型的Ghrelin基因型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型。
2.根据权利要求1所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其特征在于：所述步骤（1）中甘肃金鳟标本尾鳍组织的基因组DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304。
3.根据权利要求1或2所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其特征在于所述步骤（2）中PCR扩增具体如下：
Ghrelin基因的PCR扩增体系为25ul，包括10×PCR缓冲液5.0 ul，体积浓度为10mM的引物1.0 ul，体积浓度为10mM的dNTPs 1.0 ul， Taq聚合酶1U，模板DNA 3 ul；
PCR反应条件为94℃初始变性3min, 94℃变性45s, 58℃退火45s, 72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸8min, 4℃保存。
4.根据权利要求3所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其特征在于：所述步骤（1）中甘肃金鳟标本尾鳍组织的基因组DNA提取后在4℃保存备用。
5.根据权利要求1或4所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记，其特征在于：所述引物由天一生物科技股份有限公司(武汉)合成。
6.根据上述任一权利要求所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的应用，其特征在于具体方法如下：
a、在每尾甘肃金鳟标本个体背部肌肉中注射电子标签，测量每尾个体的生长性状；
b、利用上述与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的PCR产物SSCP分析，用凝胶回收试剂盒纯化后连接到pMD19-T载体，转入大肠杆菌DH5α菌株，用菌液PCR法筛选阳性克隆进行生物测序，测序后利用CLUSTAL X2软件对序列进行比对，找出突变位点；结果显示等位基因A的频率高于等位基因B和等位基因C的频率，为优势等位基因；最终甘肃金鳟标本基因型分为5类型，分别为AA型、BB型、AB型、AC型和BC型；
c、建立统计模型，应用LSD法统计分析甘肃金鳟表型性状与基因型的相关性，结果显示基因型对体长和体重均有显著影响，对全长、体高、体宽、头长和眼间距影响不显著，其中Ghrelin基因的BB基因型的体长值和体重值都高于其它4种基因型。
7.根据权利要求6所述的一种与甘肃金鳟生长性状相关的SNP标记方法的应用，其特征在于：所述c中采用 SPSS13.0 软件的general linear model过程，应用LSD法统计分析甘肃金鳟表型性状与基因型的相关性，统计模型为：Yij=μ+Pi+eij ，其中，Yij为第i基因型第j个个体生长性状表型值，μ为生长性状均值，Pi为第i个个体基因型效应值，eij为随机残差。
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