CN116064824A - 一种虹鳟耐高温snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虹鳟耐高温SNP分子标记及其应用，属于基因工程领域。本发明还提供了用于扩增上述SNP分子标记的引物对、试剂盒和选育虹鳟耐高温品系的方法。所述方法包括步骤：(a)提取待测虹鳟的DNA；(b)以提取的DNA为模板，利用上述引物对或试剂盒进行扩增，得到扩增产物；(c)使用SNaPshot方法鉴别扩增产物的基因型，进行关联分析并对优势基因型个体进行筛选；(d)保留虹鳟群体中LOC110485474基因上的第13003794位点处SNP分子标记为CT的基因后代，淘汰分子标记为CC的基因后代。以指导虹鳟耐高温品种的选育，为培育具有高温环境耐受性的虹鳟新品种提供参考。

Description

一种虹鳟耐高温SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种虹鳟耐高温SNP分子标记及其应用。

背景技术

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)属鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)，白鲑亚科(Coregoninae)，大马哈鱼属(Oncorhynchus)，是我国主要养殖的鲑鳟鱼类品种之一。虹鳟作为典型的冷水性鱼类(生长最适水温是12-18℃)，高温环境会对其生长造成严重的影响。然而近年来，因全球变暖导致养殖水体温度升高，季节性变化的高温胁迫造成鱼病频发、代谢及免疫能力下降等一系列问题，直接影响鱼类健康生长，使虹鳟养殖环节面临着极大的挑战。因此，虹鳟耐高温品种的选育具有重要意义。

分子标记辅助育种已广泛应用于水生生物中，挖掘与虹鳟高温耐受相关的分子标记可加速耐高温新品种选育的进程。建立分子标记辅助育种技术，对高温下虹鳟耐受性状进行遗传改良，进而从根本上解决虹鳟养殖过程中高温胁迫造成的危害，有助于推动我国虹鳟产业的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虹鳟耐高温SNP分子标记及其应用，为解决虹鳟养殖过程中高温胁迫造成的危害，选育虹鳟耐高温品系提供了一种新的分子标记和筛选方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种与虹鳟耐高温性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，如SEQ ID NO.1所示的序列第504位存在T>C突变；所述SNP分子标记的突变位点位于虹鳟基因组17号染色体的 LOC110485474基因上，所述突变位点对应于LOC110485474基因第13003794位的T>C 突变。

优选的是，LOC110485474基因上的第13003794位的基因型包括CT和CC，其中，基因型为CT的虹鳟个体为具有耐高温特性的个体。

本发明还提供了一种扩增所述SNP分子标记的特异性引物对，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

本发明还提供了一种检测虹鳟耐高温性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述特异性引物对。

优选的是，所述试剂盒还包括延伸引物如SEQ ID NO.4、Taq酶、SAP酶、ExoI 酶和CIP酶。

本发明还提供了一种所述的SNP分子标记检测虹鳟耐高温性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测虹鳟的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用所述的引物对或所述的试剂盒进行扩增，得到扩增产物；

(3)鉴别所述扩增产物的基因型，以筛选出基因型为CT的虹鳟个体，即具有耐高温性状的虹鳟个体。

本发明还提供了所述的分子标记、特异性引物对、试剂盒在虹鳟育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供一种虹鳟耐高温SNP分子标记，可以用于筛选高温耐受的虹鳟，根据SNP标记的检测结果，筛选出对高温环境耐受的虹鳟；另外也能够用于虹鳟的育种，根据筛选出来的高温耐受优势基因型(Chr.17-T+13003794C的CT型)的个体，进行虹鳟的分子标记辅助育种，对培育耐高温的虹鳟新品种具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的转录组差异表达基因分析，其中，A为转录组差异表达基因筛选火山图，红色表示上调表达基因，共682个，绿色表示下调表达基因，共551个；B 为转录组差异表达基因筛选热图，其中红色表示上调表达，蓝色表示下调表达。

图2为本发明的部分目的基因差异表达分析热图，其中红色表示基因表达上调，蓝色表示基因表达下调，右侧为具体的基因名称，S1、S2、S3为高温敏感型个体，R1、 R2、R3为高温耐受型个体。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本申请的实施例提供了SNP标记Chr.17-T+13003794C，SNP为LOC110485474基因上的13003794位点；T>C表示碱基转换。

在另一些实施例中，所描述SNP标记与高温耐受性状极显著相关(P<0.05)。

实施例1虹鳟耐高温基因及其SNP分子标记的获得

1.本实施例选择体质健康、规格均一的虹鳟120尾，体质量24.79±5g，体长13.21±5cm，在温度16±0.2℃、pH值7.2-7.5，溶氧量7.8-10mg/L循环水环境中驯化，两周后1℃/d的梯度进行升温直至26±0.2℃，12h后采样。从敏感群体(S)和耐受群体(R)随机各选择9尾，采集肝脏组织置于液氮保存，每3个肝脏组织混和提取总 RNA，将虹鳟的6管RNA送去商业测序公司(武汉菲沙基因信息有限公司)进行转录组数据库建立，序列拼接及差异表达基因分析(DEGs)。

敏感群体和耐受群体的区分依据为，在26℃环境中培养12h鱼体能否保持平衡自由游动，将能保持游泳平衡、可以自由游动的个体定义为耐受个体，其群体则为耐受群体；反之则认为是敏感个体，其群体则为敏感群体。

2.根据敏感群体和耐受群体基因的差异表达情况对转录组进行分析，筛选出目的基因LOC110485474，并对其上SNP位点进行验证。通过转录组测序共筛选出差异表达基因981个，其中表达上调基因540个，表达下调基因441个，对差异表达基因做火山图和热图分析。筛选结果见图1，其中红色表示上调表达，蓝色表示下调表达。

3.根据差异表达倍数筛选目的基因，依据其在各个实验组中的表达量FPKM值，选取差异表达倍数大的目的基因做出热图，所用网站为https://www.omicstudio.cn/tool，联川生物云平台。目的基因在敏感组和耐受组中的表达情况如图2所示，其中红色表示上调表达，蓝色表示下调表达。筛选出目的基因上的SNP位点用于后续SNaPshot 分型。

4.从敏感群体和耐受群体中各选择40尾作为SNP位点的验证群体，进行SNP标记的遗传多样性分析和耐高温性状关联分析。采集鳍条样本于-20℃保存，用于提取基因组DNA。

5.验证分析SNP标记的引物设计。基于转录组测序结果，结合项目组获得的虹鳟基因组信息，进行引物设计，引物序列如表1所示，产物序列如SEQ ID NO.5所示，在SEQ IDNO.5的第107位存在A＞G突变。

表1SNP标记引物信息

6.PCR扩增程序和反应体系。按照表2的PCR反应体系依次加入试剂并混匀，按照表3的PCR扩增程序进行反应，结束后取2μL上样，2％琼脂糖凝胶电泳进行质检。

表2PCR反应体系

表3PCR扩增程序

7.PCR产物纯化及测序。每个样本的扩增产物等比例混合后取4μL用于消化，ExoI酶稀释10倍后按照表4的体系进行纯化，纯化程序为37℃1h，75℃20min。

表4PCR产物纯化程序

试剂	5.6μL反应体系
		PCR产物	4
SAP(1U/ul)	1.33
		Exol(20U/ul)	0.27

8.延伸反应。将纯化产物按照表5的延伸体系进行荧光标记单碱基延伸反应，延伸条件为96℃10s，50℃5s，60℃30s，×30cycles。延伸引物SEQ ID NO.4所示。

表5延伸体系

试剂	5μL反应体系
		纯化后扩增产物	1.2μL
Primers Mix	2ul
		ABI Mix	0.5ul
10xBufferI	0.4ul
		<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]>	补充至5μL

 9.延伸产物纯化及上机检测。取6μL延伸产物与1μL碱性磷酸酶(CIP)混合，按照37℃1h，75℃15min程序进行纯化。在96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μL，PCR产物1.0μL；95℃变性3min，在3730XL测序仪上进行上机检测。

实施例2SNP标记的遗传分析

1.根据验证群体SNPs位点的分型结果，统计基因型频率和基因频率，使用PopGene32(Version 1.31)和Cal-PIC计算观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、最小等位基因频率(MAF)、有效等位基因数(Ne)等遗传多样性指标，该SNP位点符合哈迪 -温伯格平衡(Hardy-Weinberg equiliberum,HWE)，可进行下一步关联分析。

表6SNP标记遗传分析

2.在验证群体中SNP位点进行高温耐受性状的关联分析。由关联结果可以看出Chr.17-T+13003794C位点与耐高温性状存在显著关联(P＜0.05)，SNaPshot分型结果显示该位点存在两种基因型CC、CT，通过耐受群体和敏感群体基因型的比较分析， CT基因型在耐受组中的数量明显高于敏感组，因此，CT基因型为高温耐受性状的优势基因型。

表7SNP位点的基因频率及与耐高温性状的关联分析

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种与虹鳟耐高温性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，如SEQ ID NO.1所示的序列第504位存在T>C突变；所述SNP分子标记的突变位点位于虹鳟基因组17号染色体的LOC110485474基因上，所述突变位点对应于LOC110485474基因第13003794位的T>C突变。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，LOC110485474基因上的第13003794位的基因型包括CT和CC，其中，基因型为CT的虹鳟个体为具有耐高温特性的个体。

3.一种扩增权利要求1所述的SNP分子标记的特异性引物对，其特征在于，包括：如SEQID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

4.一种检测虹鳟耐高温性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的特异性引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括延伸引物如SEQ IDNO.4、Taq酶、SAP酶、ExoI酶和CIP酶。

6.一种利用权利要求1或2所述的SNP分子标记检测虹鳟耐高温性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测虹鳟的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4或所述的试剂盒进行扩增，得到扩增产物；

(3)鉴别所述扩增产物的基因型，以筛选出基因型为CT的虹鳟个体，即具有耐高温性状的虹鳟个体。

7.一种权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3所述的特异性引物对、权利要求4或5所述的试剂盒在检测虹鳟耐高温性状中的应用。

8.一种权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3所述的特异性引物对、权利要求4或5所述的试剂盒在虹鳟育种中的应用。

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