CN116622859B - 一种纯种茶花鸡的分子生物学鉴定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纯种茶花鸡的分子生物学鉴定方法及应用，具体分子标记为含外来血缘杂种茶花鸡含232bp等位基因；纯种茶花鸡不含232bp等位基因。本发明利用等位基因的差异鉴别茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡品种，优点在于能够快速、准确鉴别茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡品种，保证茶花鸡血缘的纯正。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种纯种茶花鸡分子生物学鉴定方法及应用。
背景技术
云南省及其周边地区复杂的自然地理环境，形成了立体气候和多样化的生态环境，孕育了极为丰富的生物多样性资源，再加上特殊的地理隔离以及众多少数民族特有的经济文化活动，形成了形形色色的优良地方鸡品种，也是家鸡驯化和起源地之一。茶花鸡是云南省重要的鸡遗传资源，是一种原始地方鸡品种，名字来源于其叫声类似当地语言的“茶花两朵”，故而名为茶花鸡。茶花鸡产区云南西双版纳等地分布有原始森林，森林里有家鸡的祖先-红色原鸡，收获季节会出来觅食，与茶花鸡相互杂交。茶花鸡是从红色原鸡到家鸡的过渡品种，是具有重要科研价值的地方品种。
近年来，为了开发利用茶花鸡，开始引进国外生长速度较快的血缘，对茶花鸡进行改良，也取得了很好的经济效益。但同时茶花鸡这一原始种质资源必须得到很好的保护，避免受到外来鸡血缘的侵入，因此亟需一种快速、准确而又易于操作的技术鉴别茶花鸡和含有外来血缘杂种茶花鸡，保障茶花鸡血缘的纯正性。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术不足，提供一种纯种茶花鸡分子生物学鉴定方法。
本发明的目的之二在于提供用于检测上述分子标记的引物。
本发明的目的之三在于提供上述分子标记的用途。
本发明的目的之四在于提供利用上述分子标记的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴别茶花鸡和含有外来血缘杂种茶花鸡分子标记，所述分子标记为含外来血缘杂种茶花鸡含232bp等位基因；纯种茶花鸡不含232bp等位基因。
本发明还提供一种鉴别纯种茶花鸡的分子标记的引物对，其中：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-AGGGAAACACGCAGCAGAAC-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-ATTCAGGCTCATTTTGAGGTG-3'。
本发明还提供含有上述引物对的用于鉴别纯种茶花鸡基因型的试剂盒。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在鉴别茶花鸡和含有外来血缘杂种茶花鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在鉴别茶花鸡和含有外来血缘杂种茶花鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在筛选茶花鸡中的应用。
本发明还提供一种鉴别纯种茶花鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2扩增待检测茶花鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含232bp等位基因的为外来血缘杂种茶花鸡；不含232bp等位基因的为纯种茶花鸡。
本发明还提供一种筛选纯种茶花鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2扩增待检测茶花鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含232bp等位基因的为外来血缘杂种茶花鸡；不含232bp等位基因的为纯种茶花鸡。
在一种具体的实施方式中，本发明还提供更具体的纯种茶花鸡的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤:
1)提取待测待检测茶花鸡的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板(上述茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡品种)，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型，并统计232bp等位基因的数目。
本发明步骤2)中PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
本发明步骤2)中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃60s)35循环，72℃10min。
本发明待检测品种鸡基因组DNA的提取可以采用常用方式进行提取待鉴定鸡的基因组DNA，提取位置可以为本领域常用的位置，例如包括但不限于鸡的血液、鸡肉、羽毛、组织或鸡蛋等。
本发明待检测的纯种茶花鸡可以通过群体是否含232bp等位基因区分。
有益效果：
本发明利用等位基因的差异鉴别茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡品种，优点在于能够快速、准确鉴别茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡品种，保证茶花鸡血缘的纯正。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1含232bp等位基因的个体峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡鉴定
1.1样品采集
纯种茶花鸡群体1(n＝30)来自国家级地方鸡种基因库(江苏)，纯种茶花鸡群体2(n＝40)样品来自云南茶花鸡保种场，含有外来血缘的茶花鸡杂交品种1(n＝54)来自云南某家禽育种公司，含有外来血缘的茶花鸡杂交品种2(n＝40)来自江苏某家禽育种公司。
1.2PCR扩增
使用本发明设计引物进行PCR扩增。
正向引物：5'-AGGGAAACACGCAGCAGAAC-3'；5'端加上FAM荧光标记。
反向引物：5'-ATTCAGGCTCATTTTGAGGTG-3'。
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3毛细管电泳检测
反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型，含有232bp等位基因的个体峰图如图1所示。
1.4等位基因统计
不同群体等位基因分布见表1
表1茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡等位基因分布
注：毛细管电泳有“滑移”，1b属于正常误差范围，结果可能会出现231bp峰图，以232bp统计。
统计232bp等位基因的分布，不含232bp等位基因的为纯种茶花鸡，含有232bp等位基因为外来血缘茶花鸡，证明了本发明在鉴定茶花鸡和含有外来血缘茶花鸡高效性和可靠性。
Claims (4)
1.一种鉴别纯种茶花鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增待检测茶花鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含232 bp等位基因的为外来血缘杂种茶花鸡；不含232 bp等位基因的为纯种茶花鸡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增反应体系为：2×PCR Mix 25 μL，10 μmol/L正向和反向引物各1 μL，50-100 μg/ml模板DNA 2 μL，超纯水21 μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增反应程序为：95℃ 5 min，（95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 60 s）35循环，72℃ 10 min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待检测茶花鸡基因组DNA取自鸡的血液、羽毛、组织或鸡蛋。
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