CN108588261A - 一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，属于生物技术技术领域，InDel引物包括InDel520引物对和InDel535引物对。本发明提供的InDel引物能够鉴定萝卜晚抽薹QTL，对萝卜晚抽薹材料进行分子标记辅助鉴定的准确度为100％。

Description

一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，尤其涉及一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物及其应用。

背景技术

萝卜起源于我国，是我国重要的蔬菜作物，长期以来是我国城乡居民的“当家菜”。年播种面积1600万亩，占我国整个蔬菜生产的6％。萝卜是长日照植物，通过低温春化后在长日照条件下由营养生长转向生殖生长，从而抽薹开花。未熟抽薹开花对萝卜生产最重要的影响是营养生长向生殖生长的转变，抑制肉质根的膨大，导致产量和品质下降。培育萝卜晚抽薹品种是解决这一问题的根本途径。而发现萝卜晚抽薹基因，开发与耐抽薹性状相关的分子标记用于辅助选择能够加快育种进程、缩短育种时间。

在白菜、甘蓝等芸薹属作物中已经发现许多与抽薹性状相关的分子标记，但在萝卜中相关标记较少，Liu等(Liu L W，Zhao L P，Gong Y Q，Wang M X.DNA fingerprintingand genetic diversity analysis of late-bolting radish cultivars with RAPD，ISSR and SRAP markers.Scientia Horticulturae，2008，116：240-247.)用35份晚抽薹萝卜构建指纹图谱，获得了可能与抽薹性主效位点紧密连锁的6个RAPD标记、1个ISSR标记和1个SRAP标记。徐文玲等(徐文玲，王淑芬，牟晋华，王翠花，刘贤娴.萝卜抽薹基因连锁的AFLP和SCAR分子标记鉴定.分子植物育种，2009，7(4)，743-749.)获得2个与萝卜抽薹基因相连锁的AFLP标记，遗传距离分别为14.6cM和9.1cM。但上述研究结果尚难以在萝卜耐抽薹性分子标记辅助筛选中应用。一方面是由于已经获得的分子标记与相关基因的连锁距离不够紧密，另一方面由于植物抽薹开花是一个复杂的网络系统，受多个基因的影响和调控，不同作物或同一作物不同材料间影响抽薹开花的分子机制可能不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，能够鉴定晚抽薹QTL。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和InDel535引物对；

所述InDel520引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述InDel520引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述InDel535引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述InDel535引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括InDel520和InDel535，所述InDel520由上述技术方案所述InDel引物中的InDel520引物对扩增得到，所述InDel535由上述技术方案所述InDel引物中的InDel535引物对扩增得到。

本发明还提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的试剂盒，包括引物，10×PCR Buffer，dNTPs，Taq酶和ddH₂O；所述引物包括权利要求1所述的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和/或InDel535引物对。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel引物在鉴定萝卜抽薹性状中的应用。

优选的，所述鉴定萝卜抽薹性状的方法，包括以下步骤：

1)将待测萝卜的基因组DNA利用上述技术方案所述的InDel引物中的InDel520引物对或InDel535引物对进行PCR扩增，得到InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物；

2)将所述步骤1)得到的InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物进行凝胶电泳，以a、b和h基因型的电泳条带为标准判断待测萝卜的基因型，所述a基因型的电泳条带为具有晚抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述b基因型的电泳条带为具有早抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述h基因型的电泳条带为具有中抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带；

当所述扩增产物为a基因型时，待测萝卜具有晚抽薹性状；

当所述扩增产物为b基因型时，待测萝卜具有早抽薹性状；

当所述扩增产物为h基因型时，待测萝卜具有中抽薹性状。

优选的，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的体系每10μl包括：浓度为50ng/μl的基因组DNA2μl，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，浓度为10μM的上游引物0.2μl，浓度为10μM的下游引物0.2μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.2μl，5.6μl ddH₂O。

优选的，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel引物在萝卜育种中的应用，利用上述技术方案所述的引物，检测待测萝卜基因组InDel520和InDel535位点的基因型，选择基因组InDel520和InDel535位点的基因型为a的待测萝卜作为亲本进行育种。

本发明提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，能够鉴定晚抽薹QTL，使用InDel分子标记能够鉴定萝卜的抽薹性状。萝卜为两年生作物，抽薹开花鉴定时间较长，利用本发明提供的引物和分子标记作为鉴定萝卜品种抽薹性状和辅助选择育种亲本应用时，能够在苗期对待测品种进行抽薹性鉴定，节省植株田间管理成本和时间。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的InDel引物能够鉴定晚抽薹QTL，本发明利用InDel520引物对和InDel535引物对对萝卜晚抽薹材料进行分子标记辅助鉴定的准确度为100％。

附图说明

图1为萝卜抽薹开花时间性状QTL定位信息，A：抽薹开花时间初步定位于InDel162和InDel170标记之间；B：局部加密的萝卜R02染色体，候选基因RsFLC2位于标记InDel520和InDel535之间；C：萝卜抽薹时间(BD)和开花时间(FD)在不同群体中QTL位置与LOD值；

图2为InDel520位点在F2群体部分材料中的分型鉴定图；

图3为InDel535位点在F2群体部分材料中的分型鉴定图。

具体实施方式

本发明提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和InDel535引物对；

所述InDel520引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述InDel520引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述InDel535引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述InDel535引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明提供的鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物包括InDel520引物对，所述InDel520引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：

GTTTACTCGTGGGGAAGAGGAAT；

所述InDel520引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：

GAAGAAACAACCTGAGAGAGCGA。

本发明提供的鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物包括InDel535引物对，所述InDel535引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：

CCGACGGAGGCTAATATCTCC；

所述InDel535引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：

TTTCAATTGGACCTCTCTGCAGT。

本发明还提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括InDel520和InDel535，所述InDel520由上述技术方案所述InDel引物中的InDel520引物对扩增得到，所述InDel535由上述技术方案所述InDel引物中的InDel535引物对扩增得到。

本发明还提供了一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的试剂盒，包括引物，10×PCR Buffer，dNTPs，Taq酶和ddH₂O；所述引物包括上述技术方案所述的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和/或InDel535引物对。

在本发明中，所述试剂盒中的InDel520引物对的上游引物和下游引物的浓度独立的优选为10μM。本发明对所述试剂盒装有InDel520引物对的上游引物和下游引物的体积没有特殊限定，采用本领域技术人员常规装有引物的体积即可。

在本发明中，所述试剂盒中的InDel535引物对的上游引物和下游引物的浓度独立的优选为10μM。本发明对所述试剂盒装有InDel535引物对的上游引物和下游引物的体积没有特殊限定，采用本领域技术人员常规装有引物的体积即可。

本发明对所述试剂盒中的10×PCR Buffer、dNTPs，Taq酶和ddH₂O的来源没有特殊限定，采用常规采用的市售产品即可。本发明对所述试剂盒装有10×PCR Buffer、dNTPs，Taq酶和ddH₂O的体积没有特殊限定，采用本领域技术人员常规装有的体积即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel引物在鉴定萝卜抽薹性状中的应用。

在本发明中，所述鉴定萝卜抽薹性状的方法，优选包括以下步骤：

1)将待测萝卜的基因组DNA利用上述技术方案所述的InDel引物中的InDel520引物对或InDel535引物对进行PCR扩增，得到InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物；

2)将所述步骤1)得到的InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物进行凝胶电泳，以a、b和h基因型的电泳条带为标准判断待测萝卜的基因型，所述a基因型的电泳条带为具有晚抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述b基因型的电泳条带为具有早抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述h基因型的电泳条带为具有中抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带；

当所述扩增产物为a基因型时，待测萝卜具有晚抽薹性状；

当所述扩增产物为b基因型时，待测萝卜具有早抽薹性状；

当所述扩增产物为h基因型时，待测萝卜具有中抽薹性状。

本发明将待测萝卜的基因组DNA利用上述技术方案所述的InDel引物中的InDel520引物对或InDel535引物对进行PCR扩增，得到InDel520引物对的扩增产物或InDel520引物对的扩增产物。

本发明对所述待测萝卜的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规提取植物基因组DNA的方法即可，如CTAB法。

本发明将所述步骤1)得到的InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物进行凝胶电泳，以a、b和h基因型的电泳条带为标准判断待测萝卜的基因型，所述a基因型的电泳条带为具有晚抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述b基因型的电泳条带为具有早抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述h基因型的电泳条带为具有中抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带；

当所述扩增产物为a基因型时，待测萝卜具有晚抽薹性状；

当所述扩增产物为b基因型时，待测萝卜具有早抽薹性状；

当所述扩增产物为h基因型时，待测萝卜具有中抽薹性状。

在本发明中，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的体系每10μl优选包括：浓度为50ng/μl的基因组DNA 2μl，1μl 10×PCR Buffer，0.8μldNTPs，浓度为10μM的上游引物0.2μl，浓度为10μM的下游引物0.2μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.2μl，5.6μl ddH₂O。

在本发明中，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的程序优选为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel引物在萝卜育种中的应用，利用上述技术方案所述的引物，检测待测萝卜基因组InDel520和InDel535位点的基因型，选择基因组InDel520和InDel535位点的基因型为a的待测萝卜作为亲本进行育种。

下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定位于萝卜R02染色体上的耐抽薹QTL的InDel引物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

萝卜晚抽薹性状分子标记的获得

本发明利用常规的图位克隆的方法对萝卜晚抽薹性状相关的基因进行鉴定和克隆。

1、遗传分离群体构建与表型鉴定

以来自日本晚抽薹材料“Ninengo”和中国早抽薹材料“Maer”为双亲，构建包含183个单株的F₂群体。于2016年春对亲本、F₁、F₂群体单株进行抽薹和开花性状调查。调查方法为：每隔一天调查单株的现蕾和开花情况。现蕾时间为从定植到肉眼可见花蕾所需的天数；开花时间为从定植到第一朵花开放所需的天数。晚抽薹材料“Ninengo”的现蕾时间和开花时间分别为91天和110天，早抽薹材料“Maer”的现蕾时间和开花时间分别为44天和66天。F₂群体单株的抽薹时间变异为43～105天，平均81.27天；开花时间变异为70～121天，平均96.7天；表现为连续分布数量性状遗传的特点。

2、遗传连锁图谱构建与数量性状定位(QTL)

插入缺失标记(InDel)的开发：利用Illumina Hiseq 2500测序平台对亲本“Ninengo”和“Maer”进行全基因组重测序，以‘Aokubi DH'参考基因组(The radish genomeand comprehensive gene expression profile of tuberous root formation anddevelopment，Scientific Reports(2015)5：10835)为参照检测双亲的多态性。初步设计43对InDel标记，InDel标记的序列表1，InDel标记设计原则为每个标记在基因组中的间隔距离为300～800kb，退火温度为58～60℃，双亲间的碱基差异为3～8bp，扩增片段大小为100～200bp，以便利用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

表1 43对InDel标记的序列

遗传连锁图谱构建与QTL分析：取亲本及F₂群体各单株的幼嫩叶片，利用常规的CTAB法提取总DNA。利用已公开的626对EST-SSR(Shirasawa K等，An EST-SSR linkage mapof Raphanus sativus and comparative genomics of the Brassicaceae，DNAResearch，(2011)18：221-232)和本发明设计的43对InDel标记检测亲本“Ninengo”和“Maer”之间的多态性。通过对双亲PCR扩增与8％聚丙烯酰胺凝胶电泳获得131对多态性引物用于183个F₂群体单株的标记分型。利用Joinmap 4.0软件构建一张含有9条连锁群的遗传图谱。利用MapQTL4.0软件将萝卜晚抽薹相关基因定位在萝卜R02染色体InDel170和InDel162之间，结果见图1A。

萝卜晚抽薹性状相关的基因精细定位：根据‘Aokubi DH'参考基因组信息(Theradish genome and comprehensive gene expression profile of tuberous rootformation and development，Scientific Reports(2015)5：10835)和‘XYB36-2'参考基因组信息(Zhang Xiaohui等，A de novo Genome of a Chinese Radish Cultivar，Horticultural Plant Journal，2015，1(3)：155-164)，对初步定位区间InDel170-InDel162进行标记加密，共设计43个InDel标记，见表1。构建了局部加密的连锁图谱，结果见图1B，QTL分析将萝卜抽薹和开花时间性状定位在R02染色体InDel520和InDel535之间。图1C：萝卜抽薹时间(BD)和开花时间(FD)在不同群体中QTL位置与LOD值。

实施例2

InDel520和InDel535在鉴定萝卜晚抽薹和早抽薹材料中的应用

1、分子标记鉴定晚抽薹和早抽薹萝卜材料

1)DNA提取

常规CTAB法分别提取表2中183种待测萝卜材料的基因组DNA。表2中的183种待测萝卜材料是利用亲本Ninengo和Maer杂交获得F1代，F1自交获得的F2单株。

2)PCR扩增与检测

利用上述InDel520引物对和InDel535引物对对待测萝卜材料进行PCR扩增。

PCR反应体系：包含100ng基因组DNA，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，上述上下游引物各0.2μl(10μM)，1U Taq酶，加ddH₂0至10μl。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增结束后，利用常规的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测InDel520引物对和InDel535引物对分型情况，结果见图2和3。

从图2和3中可以得出，分型效果良好，InDel520引物对和InDel535引物对能特异区分各自位点为纯合或杂合的材料。

若待测萝卜材料在该位点的基因型为a，则待测萝卜样品与晚抽薹亲本具有的相同的基因型，表现为晚抽薹性状。

若待测萝卜材料在该位点的基因型为b，则待测萝卜样品与早抽薹亲本具有的相同的基因型，表现为早抽薹性状。

若待测萝卜材料在该位点的基因型为h，则待测萝卜样品在该位点为杂合类型，表现为中抽薹性状。

2、萝卜抽薹性状鉴定

以现蕾时间作为萝卜抽薹早晚的指标，调查标准为从定植到肉眼可见花蕾所需的天数。

调查的分级标准如下：

早抽薹：现蕾时间为43天至69天；

中抽薹：现蕾时间为70天至91天；

晚抽薹：现蕾时间为92天至105天。

表2 183份材料RsFLC2基因分型及抽薹开花性状统计表

从表2中可以得出，在31份田间检测为晚抽薹材料中，分子标记鉴定结果均为a表型，本发明利用InDel520引物对或InDel535引物对对萝卜晚抽薹材料进行分子标记辅助鉴定的准确度为100％。

由以上实施例可以得出，本发明提供的位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，能够鉴定晚抽薹QTL，而且对萝卜晚抽薹材料进行分子标记辅助鉴定的准确度为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和InDel535引物对；

所述InDel520引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述InDel520引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述InDel535引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述InDel535引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

2.一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括InDel520和InDel535，所述InDel520由权利要求1所述InDel引物中的InDel520引物对扩增得到，所述InDel535由权利要求1所述InDel引物中的InDel535引物对扩增得到。

3.一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的试剂盒，包括引物，10×PCR Buffer，dNTPs，Taq酶和ddH₂O；所述引物包括权利要求1所述的InDel引物，所述InDel引物包括InDel520引物对和/或InDel535引物对。

4.权利要求1所述的InDel引物在鉴定萝卜抽薹性状中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鉴定萝卜抽薹性状的方法，包括以下步骤：

1)将待测萝卜的基因组DNA利用权利要求1所述的InDel引物中的InDel520引物对或InDel535引物对进行PCR扩增，得到InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物；

2)将所述步骤1)得到的InDel520引物对的扩增产物或InDel535引物对的扩增产物进行凝胶电泳，以a、b和h基因型的电泳条带为标准判断待测萝卜的基因型，所述a基因型的电泳条带为具有晚抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述b基因型的电泳条带为具有早抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带，所述h基因型的电泳条带为具有中抽薹萝卜材料凝胶电泳的电泳条带；

当所述扩增产物为a基因型时，待测萝卜具有晚抽薹性状；

当所述扩增产物为b基因型时，待测萝卜具有早抽薹性状；

当所述扩增产物为h基因型时，待测萝卜具有中抽薹性状。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的体系每10μl包括：浓度为50ng/μl的基因组DNA 2μl，1μl 10×PCR Buffer，0.8μldNTPs，浓度为10μM的上游引物0.2μl，浓度为10μM的下游引物0.2μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.2μl，5.6μl ddH₂O。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述InDel520引物对或InDel535引物对扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

8.权利要求1所述的InDel引物在萝卜育种中的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的引物，检测待测萝卜基因组InDel520和InDel535位点的基因型，选择基因组InDel520和InDel535位点的基因型为a的待测萝卜作为亲本进行育种。