CN112251536B - 一种与萝卜抽薹性紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其公开了一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，自5’端起的第347位碱基为A/C，可指示萝卜早抽薹/晚抽薹性状的多态性。本发明通过设计引物对该分子标记进行PCR扩增，并利用MaeⅡ限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切处理，即可判断萝卜样品的基因型，从而对其抽薹性进行推断。为深入解析萝卜抽薹性状的分子机制、验证抽薹基因生物学功能以及耐抽薹萝卜辅助育种奠定基础。

Description

一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
萝卜是低温长日照作物，冬春季节播种的萝卜受低温影响，很快便开始花芽分化，春季回暖后再较长日照条件下很快进入生殖生长阶段,从而发生先期抽薹的现象。萝卜抽薹后其肉质根便不再生长，积累的营养物质转而提供给生殖生长，最终导致萝卜糠心，不再具有商品价值。抽薹性状是萝卜上一种重要的农艺性状，是影响萝卜产量和品质的重要性状之一。发掘萝卜耐抽薹基因，阐明耐抽薹机制，培育耐抽薹品种萝卜是解决这一问题的关键。开发抽薹性分子标记将有助于耐抽薹萝卜的辅助育种。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：本发明首先提供一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记，其为分子标记Rsa19453，所述SNP分子标记为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，自5’端起的第347位碱基，其碱基为A或者C，所述SNP分子标记定位于萝卜第2号染色体上；当所述分子标记碱基全为A时，与分子标记紧密连锁的性状表现为晚抽薹；当所述分子标记碱基全为C时，与分子标记紧密连锁的性状表现为早抽薹。
本发明还提供了用于扩增所述SNP分子标记的引物对，序列如下：
F:5’-GCCTCATCACAGTTCTTGCG-3’(SEQ ID NO:2)；
R:5’-GGATATTCAGGGAAGTAGAACAC-3’(SEQ ID NO:3)。
本发明还提供了一种萝卜抽薹性检测试剂盒，所述试剂盒包含用于检测所述SNP分子标记是否存在的试剂。
进一步地，所述试剂盒包含前述引物对，以及MaeⅡ限制性内切酶。
本发明还提供了一种鉴定萝卜抽薹性状的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测萝卜基因组DNA；
(2)以待测萝卜基因组DNA为模板，利用用于扩增所述SNP分子标记的所述引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)利用MaeⅡ限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，根据酶切结果，判断待测萝卜样品的抽薹性。
所述方法中，利用琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行检测和判断：
若PCR扩增产物被酶切而得到酶切片段，则待测萝卜样品为早抽薹性状；若PCR扩增产物无法被酶切而得到酶切片段，则待测萝卜样品为晚抽薹性状。
PCR扩增时的PCR体系为20μL，包括：
DNA模板：5ng
引物正向：0.5μL
引物反向：0.5μL
dNTP:2.0μL(使用浓度2.0Mm)
Mg:1.2μL(使用浓度2.5mM)
10×PCR buffer:2.0μL
Taq酶：0.2μL
ddH20:补足20μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环后，72℃保持7min，然后置于16℃保存待检测。
对PCR扩增产物进行酶切的酶切体系为10μL：MaeⅡ限制性内切酶0.3μL，buffer 1μL，PCR产物5μL，ddH20补足10μL。
本发明还提供了所述SNP分子标记在萝卜抽薹性辅助育种方面的应用，具体为，利用前述方法对萝卜样品的抽薹性进行鉴定，将鉴定为晚抽薹性状的萝卜样品作为亲本进行育种。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记，通过设计引物对该分子标记进行PCR扩增，并利用MaeⅡ限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切处理，即可判断萝卜样品的基因型，从而对其抽薹性进行推断。为深入解析萝卜抽薹性状的分子机制、验证抽薹基因物学功能以及耐抽薹萝卜辅助育种奠定基础。
本发明提供的SNP分子标记与萝卜抽薹性状紧密连锁，分子鉴定与表型鉴定的总体契合度高，可为辅助育种提供科学依据与有效指导，且无需改变原生物种基因，仅借助科学技术判断进行人为选择，可预期取得良好的经济效益。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中目标基因在亲本中的酶切产物检测结果；其中，M：DL2000DNA marker；025和003分别代表亲本16CJ025和16CJ003；第1、2泳道为酶切产物，第3、4泳道为PCR产物对照。
图2位本发明实施例中本发明所述分子标记在群体中的检测鉴定结果。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
以极早薹材料16CJ025和极晚薹材料16CJ003为亲本构建分离群体(F2、BC1(P1)和BC1(P2))，根据抽薹时间的频率分布调查发现，抽薹性状可能由两对主效基因控制。通过采用分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)对F2代极端池进行测序以及对亲本进行重测序，对萝卜耐抽薹相关基因进行QTL初定位。初步筛选出了在极端池中表现差异的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)和InDel(Insertion-Deletion，插入缺失标记)位点并根据注释筛选出73个与抽薹性相关的候选基因。
根据测序结果开发出一个与抽薹性紧密连锁的SNP分子标记Rsa19453，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列自5’端起的第347位碱基，其碱基为A或者C。
所述SNP分子标记经过分离群体分组分析法(BSA)定位于萝卜第2号染色体上。
当所述分子标记碱基为A时，与分子标记紧密连锁的性状表现为晚抽薹；当所述分子标记碱基为C时，与分子标记紧密连锁的性状表现为早抽薹。
针对上述SNP分子标记设计PCR扩增引物对如下：
F:5’-GCCTCATCACAGTTCTTGCG-3’(SEQ ID NO:2)；
R:5’-GGATATTCAGGGAAGTAGAACAC-3’(SEQ ID NO:3)。
实施例2
分别提取极早薹材料16CJ025和极晚薹材料16CJ003的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用实施例1所设计的PCR扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为20μL，包括：
DNA模板：5ng
引物正向：0.5μL
引物反向：0.5μL
dNTP:2.0μL(使用浓度2.0Mm)
Mg:1.2μL(使用浓度2.5mM)
10×PCR buffer:2.0μL
Taq酶：0.2μL
ddH20:补足20μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环后，72℃保持7min，然后置于16℃保存待检测。
利用MaeⅡ限制性内切酶对两亲本PCR产物进行酶切，酶切体系为10μL：MaeⅡ限制性内切酶0.3μL，buffer 1μL，PCR产物5μL，ddH20补足10μL。
如果SNP碱基位点为C时，会被MaeⅡ限制性内切酶识别并切割，被切成长度为250～350bp的两条片段。当未被MaeⅡ限制性内切酶切割出两条片段时，萝卜样品表现为晚抽薹性状，当出现被MaeⅡ限制性内切酶切割成两条较短片段时，萝卜样品表现为早抽薹性状。
极早薹材料16CJ025和极晚薹材料16CJ003的酶切产物如图1所示。由图可以看出，两亲本的酶切产物存在显著差异，极早薹亲本能被MaeⅡ限制性内切酶切成250～350bp的两个片段，而极晚薹亲本没有能被酶切的片段。验证了目标候选基因可开发为早抽薹性萝卜选择的标记，并将该分子标记命名为Rsa19453。
实施例3
对F2群体极早抽薹材料和极晚抽薹材料分别取样，各取20株，提取基因组DNA，对本发明所开发的抽薹性分子标记进行检测鉴定。
极早薹材料都能被切开，其中纯合位点的材料能够完全被切开成两条带，杂合位点的材料部分被切开，表现为三条带；极晚薹材料中18份完全不能被切开，表明该位点为纯合位点，2份存在杂合位点的材料部分被切开，标记在该群体中的检测鉴定结果与表型鉴定结果总体契合度接近100％(图2)。试验验证表明，本发明所述SNP分子该标记可应用于萝卜抽薹性的分子辅助育种。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 萝卜(Raphanus sativus)
<400> 1
gcctcatcac agttcttgcg atggttttaa ccgcaacgat gatgatccaa gaagctaaga 60
gcattcccct atgtaaggtc aacacaaatg acttgcagaa atgtcgtcca gctgtcactg 120
gaaactaccc gccaccaccg actcccgcct gctgcacagt ggccaaaacc gcgaatcttg 180
aatgtctctg tccgttcctc tccaggtccg ggattgaccc atcaaaactc aaagctctgt 240
ttgccaagtg tggcgtaaac aatccctcat gtttgccatg gtcagtaaaa atcaaagtac 300
cattaacaat attagaaact ggtttggata aagagagaaa gtcttaagtt tttttttcgt 360
ttgttctttc tctaacacgc agattgaaga actgaggtgg actgggctta agcttgcctg 420
aggcatactt tgccaccacc tgaaaattaa gtccctaagt tataaatttt tatggtgttt 480
ctattcaaat aaatcaacaa attttgcagt tatatttcag tcaccttttc tatctacaag 540
aaccgtattc tatacattaa tgaaaacaat aaagtactgt ttttggcttt tttccattgt 600
gttctacttc cctgaatatc c 621
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctcatcac agttcttgcg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatattcag ggaagtagaa cac 23

Claims (9)

1.一种与萝卜抽薹性紧密连锁的SNP分子标记，其为分子标记Rsa19453，其特征在于，所述SNP分子标记为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，自5’端起的第347位碱基，其碱基为A或者C，所述SNP分子标记定位于萝卜第2号染色体上；当所述分子标记碱基全为A时，与分子标记紧密连锁的性状表现为晚抽薹；当所述分子标记碱基全为C时，与分子标记紧密连锁的性状表现为早抽薹。
2.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，序列是：
F:5’-GCCTCATCACAGTTCTTGCG-3’(SEQ ID NO:2)；
R:5’-GGATATTCAGGGAAGTAGAACAC-3’(SEQ ID NO:3)。
3.一种萝卜抽薹性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述SNP分子标记是否存在的试剂；所述试剂盒包含权利要求2所述的引物对，以及MaeII限制性内切酶。
4.一种鉴定萝卜抽薹性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测萝卜基因组DNA；
(2)以待测萝卜基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)利用MaeII限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，根据酶切结果，判断待测萝卜样品的抽薹性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行检测和判断：若PCR扩增产物被酶切而得到酶切片段，则待测萝卜样品为早抽薹性状；若PCR扩增产物无法被酶切而得到酶切片段，则待测萝卜样品为晚抽薹性状。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增时的PCR体系为20μL，包括：
DNA模板:5ng
引物正向:0.5μL
引物反向:0.5μL
dNTP:2.0μL
Mg:1.2μL
10×PCR buffer:2.0μL
Taq酶:0.2μL
ddH2O:补足20μL。
7.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环后，72℃保持7min，然后置于16℃保存待检测。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，对PCR扩增产物进行酶切的酶切体系为10μL：MaeII限制内切酶0.3μL，buffer 1μL，PCR产物5μL，ddH2O补足10μL。
9.权利要求1所述的SNP分子标记在萝卜抽薹性辅助育种方面的应用，其特征在于，利用权利要求4～8任一项所述的方法对萝卜样品的抽薹性进行鉴定，待鉴定为晚抽薹性状的萝卜样品作为亲本进行育种。
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