CN113621730A - 一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用，涉及分子标记开发技术领域。本发明提供了SSR分子标记引物在鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关基因中的应用，并提供了相关分子标记的开发方法，根据定位结果开发鉴定叶用芥菜晚抽薹的特异分子标记引物，检测标记位点上的多态性表达叶用芥菜抽薹的差异。利用本发明所述分子标记引物筛选叶用芥菜，在早抽薹群体中态性条带百分率为17.60％，在晚抽薹群体中多态性条带百分率为44.52％，多态性良好。
Description
技术领域
本发明属于分子标记开发技术领域，具体涉及一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用。
背景技术
芥菜(BrassicajunceaCoss.)是贵州省的特色蔬菜，栽培面积大，春季栽培价格高。叶用芥菜俗称青菜，是十字花科芸薹属芥菜类蔬菜，可鲜食可加工。叶用芥用最佳生长气温为18～20℃，春化温度较高，幼苗期至莲座期遇到低于18℃温度持续5～7天，然后持续长日照和较高的温度会加速抽薹开花。秋播芥菜大部分品种在短日照下不抽薹，次年1～3月抽薹开花，部分品种当年12月抽薹开花。春播在幼苗期遇到低温环境，满足其春化要求，大部分品种都极易抽薹。抽薹性状是多基因控制的数量性状，目前关于抽薹调控的机理在白菜和甘蓝中研究较多，在芥菜中鲜有报道。叶用芥菜品种选育在贵州省起步较晚，尤其是晚抽薹品种选育。与控制叶用芥菜晚抽薹基因的相关的分子标记的开发和利用，将为叶用芥菜新品种分子辅助育种提供指导，满足生产上的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用，利用所述分子标记可鉴定叶用芥菜晚抽薹性状，为叶用芥菜新品种分子辅助育种提供指导，满足生产上的需求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了SSR分子标记引物在鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关基因中的应用，所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法，包括以下步骤：(1)以叶用芥菜晚抽薹DH系黔青四号为母本，以早抽薹自交系白芥菜为父本进行杂交，对得到的F1代自交得F2代群体，统计F2代群体植株的抽薹时间；
(2)根据F2代群体抽薹时间频率分布，选取极端早抽薹单株、极端晚抽薹单株和两个中间型进行混池测序，混池规模为：98+106+99+97；结合亲本重测序，对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb；
(3)将F2代群体中极端早抽薹性状和极端晚抽薹性状的材料分别自交，构建F2:3家系群体，次年种植所述F2:3家系群体，根据主效区间开发分子标记，筛选主效区间内的SSR序列，选取SSR序列前后200bp的核苷酸序列设计引物，得SSR分子标记引物。
优选的，在所述混池测序后，还包括利用Graded-seq关联分析方法对抽薹性状进行定位。
优选的，步骤(3)得所述SSR分子标记引物后，还包括利用亲本和F1的基因组DNA进行PCR验证。
优选的，所述PCR验证的体系以20μl计，包括：基因组DNA 1μl、2×Taq PCRMasterMix 10μl、上游引物和下游引物各1μl和ddH2O 7μl。
优选的，所述PCR验证的程序，包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30min，20个循环；72℃延伸5min。
本发明还提供了一种鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关的方法，包括以下步骤：利用SSR分子标记引物和叶用芥菜的基因组DNA配制PCR体系，进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
有益效果：本发明提供了SSR分子标记引物在鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关基因中的应用，并提供了相关分子标记的开发方法，根据定位结果开发鉴定叶用芥菜晚抽薹的特异分子标记引物，检测标记位点上的多态性表达叶用芥菜抽薹的差异。通过检测这些分子标记可以验证叶用芥菜晚抽薹性状，为实现该性状的筛选与验证提供分子辅助选择技术支持。利用本发明所述分子标记引物筛选304株F2:3代植株，其中含早抽薹群体151株和晚抽薹群体153株。在早抽薹群体Z728、Z899、Z1226、Z548中分离出了晚抽薹的单株，SSR检测发现具有多态性，表型与检测一致，表现为晚抽薹，只在Z1009群体中没有检测到多态性位点。在早抽薹群体中SSR-PCR共扩增出142条带，具有多态性的25条，多态性条带百分率为17.60％；在晚抽薹群体中SSR-PCR共扩增出146条带，具有多态性的65条，多态性条带百分率为44.52％，在四个晚抽薹群体中都检测到了多态性位点，多态性良好。
附图说明
图1为F2代群体抽薹时间频率分布图，横坐标为抽薹时间，纵坐标为抽薹植株数量，该性状符合正态分布的规律，选取了早抽薹池，中间型混池1和中间型混池2，晚抽薹池，混池规模：98+106+99+97；
图2为滑窗降噪后与抽薹性状相关的P值，横坐标为染色体位置坐标，纵坐标为窗口内P值低于阈值的点占窗口总点数量的比值，通过Ridit检验与降噪处理后对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb；
图3为SSR引物筛选，根据叶用芥菜主效区间内的SSR序列开发了46对SSR引物，通过亲本与F1间多态性引物筛选，筛选到37号引物这1对在亲本间有差异的SSR引物；图中M为Maker，数字为引物编号，每个编号对应的为F1、亲本黔青4号和亲本白芥菜三个DNA产物；
图4为SSR引物的验证，利用筛选到的37号引物筛选304株F2:3代植株，其中含早抽薹群体151株和晚抽薹群体153株；在早抽薹群体Z728、Z899、Z1226、Z548中都检测到了多态性位点，只在Z1009群体中没有检测到多态性位点；在早抽薹群体中SSR-PCR共扩增出142条带，具有多态性的25条，多态性条带百分率为17.60％；在晚抽薹群体中SSR-PCR共扩增出146条带，具有多态性的65条，多态性条带百分率为44.52％，在四个晚抽薹群体中都检测到了多态性位点。
具体实施方式
本发明提供了SSR分子标记引物在鉴定叶用芥菜晚抽薹性状中的应用，所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述上游引物的核苷酸序列为：5’-GTTTTGGAGCTTCCCCCT-3’，下游引物的核苷酸序列为：5’-TCTTTCCTCTTCGTTTCGC-3’。
本发明所述叶用芥菜晚抽薹性状为多基因控制的数量性状，在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb，根据主效区间内的SSR序列开发了46对SSR引物(表1)。
表1 SSR引物序列
本发明提供了一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法，包括以下步骤：(1)以叶用芥菜晚抽薹DH系黔青四号为母本，以早抽薹自交系白芥菜为父本进行杂交，对得到的F1代自交得F2代群体，统计F2代群体植株的抽薹时间；
(2)根据F2代群体抽薹时间频率分布，选取极端早抽薹单株、极端晚抽薹单株和两个中间型进行混池测序，混池规模为：98+106+99+97；结合亲本重测序，对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb；
(3)将F2代群体中极端早抽薹性状和极端晚抽薹性状的材料分别自交，构建F2:3家系群体，次年种植所述F2:3家系群体，根据主效区间开发分子标记，筛选主效区间内的SSR序列，选取SSR序列前后200bp的核苷酸序列设计引物，得SSR分子标记引物。
本发明所述母本品种‘黔青4号’(邓英,唐兵,付文苑,等.叶用芥菜小孢子培养技术体系的完善及DH系创制[J].中国农业大学学报,2018(9):1007-4333.)，所述父本品种‘白芥菜’，承诺自申请日起20年内向公众发放上述亲本材料。本发明利用所述父本和母本杂交后得F1代，而后再自交得F2代。本发明所述黔青4号比白芥菜晚抽薹开花2～3个月，该群体在贵州省农业科学院园艺研究所试验基地种植。在本发明中，以植株抽薹且薹高至5cm时则判定该植株抽薹，根据这个表现来确定抽薹时间；并将最早抽薹的单株视为极端早抽薹，最晚抽薹的单株视为极端晚抽薹。
本发明优选根据F2代群体的抽薹时间做出频率分布直方图，叶用芥菜的抽薹数据符合正态分布，说明叶用芥菜的抽薹性状是多基因控制的数量性状。
本发明根据F2代群体抽薹时间频率分布，选取极端早抽薹单株、极端晚抽薹单株和两个中间型进行混池测序，混池规模为：98+106+99+97；结合亲本重测序，对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb。
本发明优选利用Graded-seq关联分析方法对研究的抽薹性状进行定位，依据表型性状构建四个混池，分别是早抽薹池，中间型混池1，中间型混池2和晚抽薹池，混池规模：98+106+99+97，结合亲本重测序。本发明通过Ridit检验与降噪处理后对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb。
本发明将F2代群体中极端早抽薹性状和极端晚抽薹性状的材料分别自交，构建F2:3家系群体，次年种植所述F2:3家系群体，根据主效区间开发分子标记，筛选主效区间内的SSR序列，选取SSR序列前后200bp的核苷酸序列设计引物，得SSR分子标记引物。
本发明根据叶用芥菜主效区间内的测序使用开发出46对SSR引物，通过亲本与F1间多态性引物筛选，筛选到37号引物为亲本间有差异的SSR引物，因此以37号引物(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2)作为分子标记引物。
本发明得所述SSR分子标记引物后，优选还包括利用亲本和F1的基因组DNA进行PCR验证。本发明所述PCR验证的体系以20μl计，优选包括：基因组DNA 1μl、2×Taq PCRMasterMix 10μl、上游引物和下游引物各1μl和ddH2O 7μl。本发明所述PCR验证的程序，优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30min，20个循环；72℃延伸5min。利用本发明所述SSR分子标记引物，扩增片段长度为200bp。
本发明还提供了一种鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关的方法，包括以下步骤：利用SSR分子标记引物和叶用芥菜的基因组DNA配制PCR体系，进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述PCR体系和PCR扩增的程序优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、叶用芥菜抽薹表型与遗传分析
叶用芥菜晚抽薹DH系‘黔青4号’和早抽薹自交系‘白芥菜’，黔青4号比白芥菜晚抽薹开花2～3个月，均由贵州省农科院园艺研究所青菜课题组提供。
利用叶用芥菜晚抽薹DH系‘黔青4号’为母本，与早抽薹自交系‘白芥菜’杂交得F1代，自交构建F2群体，杂交获得2000株F2后代单株。该群体在贵州省农业科学院园艺研究所试验基地种植。根据F2代群体的抽薹时间做出频率分布直方图(图1)，叶用芥菜的抽薹数据符合正态分布，说明叶用芥菜的抽薹性状是多基因控制的数量性状。
2、叶用芥菜晚抽薹候选基因的定位
根据统计的亲本及两者杂交所得的2000株F2代植株的抽薹情况调查结果，利用获得的F2群体中晚抽薹和早抽薹单株进行混池测序：利用Graded-seq关联分析方法对研究的抽薹性状进行定位，依据表型性状构建四个混池，分别是早抽薹池，中间型混池1，中间型混池2和晚抽薹池，混池规模：98+106+99+97，结合亲本重测序。通过Ridit检验与降噪处理后对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb(图2)。
3、SSR分子标记筛选
将F2代中极端早晚抽薹性状的材料(各50份)自交构建F2:3家系群体，次年种植F2:3家系群体，每份材料种植50株，总共约5000株。根据亲本重测序结果开发主效区间内的分子标记，挑选了46个SSR序列，选取前后200bp的核苷酸序列，依据引物设计原则，应用Primer5.0设计软件，共设计出46对引物，通过亲本与F1间多态性引物筛选出37号引物作为SSR引物，扩增序列大小为200bp。利用设计的SSR特异标记引物在‘黔青4号’和‘白芥菜’和F1的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小，因此，该引物可作为叶用芥菜抽薹性状的检测标记(图3)。
4、SSR分子标记验证
选取F2：3家系中的早抽薹群体与晚抽薹群体进行DNA的提取，再进行PCR扩增。
对F2：3家系中早抽薹群体与晚抽薹群体进行取样。在早抽薹群体中选取了5个群体进行取样，分别是Z728、Z899、Z1009、Z1226和Z548，群体Z728表示在F2中表现为早抽薹性状，编号为728的单株，单株自交后得到的F2:3家系中表现为晚抽薹性状的群体，5个早抽薹群体分别有24、24、22、26、35个单株。在晚抽薹群体中选取了4个群体，分别是W1751、W1587、W1154和W1041，群体W1751表示在F2中表现为晚抽薹性状，编号为1751的单株自交后得到的F2:3家系中表现为晚抽薹性状的群体，4个晚抽薹群体分别有37、39、42和35个单株。分别对两个亲本、F1和F2：3家系中选取的每个群体单株进行DNA的提取，DNA的提取方法同上述F2代DNA的提取，再进行PCR扩增，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳试验(图4)：利用本发明所述分子标记引物筛选304株F2:3代植株，其中含早抽薹群体151株和晚抽薹群体153株。在早抽薹群体Z728、Z899、Z1226、Z548中分离出了晚抽薹的单株，SSR检测发现具有多态性，表型与检测一致，表现为晚抽薹，只在Z1009群体中没有检测到多态性位点。在早抽薹群体中SSR-PCR共扩增出142条带，具有多态性的25条，多态性条带百分率为17.60％；在晚抽薹群体中SSR-PCR共扩增出146条带，具有多态性的65条，多态性条带百分率为44.52％，在四个晚抽薹群体中都检测到了多态性位点，多态性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 贵州省园艺研究所（贵州省园艺工程技术研究中心）
<120> 一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法、分子标记和应用
<160> 92
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gttttggagc ttccccct 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tctttcctct tcgtttcgc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tggagatgaa gtcagcaacg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
gaagaagggg aggaagagaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cccaagcaag aatcaaagaa 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tgaaggtaag aaacgtgaca ag 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
agaatcaaga accgcagaag t 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
caaatggcac aaacccg 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tgaagtaaag gccagcgaa 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ggagaagcca ttgagagaca ga 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tctatcggca atcactccaa 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gcttatgctc tctcttctct ctct 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
cacagagacc tatcaccacc tt 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tcttgttccc aaaaacccat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
ataaaagttc agcttccccg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
gaaaacatac acaatcacgg c 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
acaagcgagc aggaaagg 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
aaagggaagc agcgagaa 18
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gcttcctttc tctctgttgt ctc 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
aacgtcgctg ttcgcttta 19
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
cccttctggt cattgtaact ct 22
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
ttctgctgct gcttctgc 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
gagaaaataa ccgggaaagg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
tagtggacga agaaagcacc 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
aagtgaggag gaaagggct 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
cggttagatt gggttattgg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
caccagctaa taattcaaac cg 22
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
tatccagcca ccgccaa 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
aagtggaggc gaaacgg 17
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
aaagacatca atggcaggag t 21
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
gagatcccaa ttgaactcag taag 24
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
gaaatgccca ggaaagaaa 19
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
gaactaaaag aacatggaga gtgg 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
gaagaagaaa tgggaagaag ca 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
gttccttgtt atcccgatgg 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
gtatacgtga gaggtggctt gt 22
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
tcaacgcctt ctccgact 18
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
gaggaaacac actaaccacc c 21
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
cacgctaaaa cgtcgtcg 18
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
gtggtggggg tggtaaata 19
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
tccacgaatc cacaccg 17
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
gaggaacgag agagccactg 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
tattgaatga ggaaagggtt gg 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
cctgtgtttg gtctagaaga gga 23
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
cgtaagcaac aagcaacca 19
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
cccaaacgga gaagaagg 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
tgaatccccc atctccct 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
cgtcatccta cattaaaccc g 21
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
acggcggagt tcgtgat 17
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
gaaagggaga gagagagaag taa 23
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
ctctccgctc tttcactcct 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
cccgcttctg ttaattttgt 20
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
cgaatacaga acggagcca 19
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
aagccgagaa agagagtaac aa 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
tgtaaacaat cccaccacct c 21
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
cctctttccc aatccgc 17
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
atcctcgcta ttcctccct 19
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
ttgttgtcac tctcattgct gt 22
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
gaagacgaag aaggcaatcc 20
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
acgcaaacgc acacaaga 18
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
ggaagaaggg aagaatcaga a 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
gaagaagcga aacagtggaa 20
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
tgttcttgcg gtcccttt 18
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
tggcattctg gcttttcac 19
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
ggaacctttt tcaccgtctg 20
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
ccgtttcgtg tcctaatctt tt 22
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
ccacggagag aaaacaaatc a 21
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
tctaacccga caaaaccca 19
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
cagcagaggc tataaagaca gg 22
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
gaagaaggtg cgaccaaca 19
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
aaagaatgag agtagagagg gaag 24
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
tgaagaaggt tggtgcgaa 19
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
gtctctctct ttatgtctcc gttt 24
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
tccatcattc tcgtccgc 18
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
aatctcctga cctctatttc gc 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
cactctccgt tctttccttc tc 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
cattttctca ggtcatttgg tc 22
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
tgcaggcttt ggctttct 18
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
gattggtgca ggtttgagag 20
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 80
ggaagaaaag gctggtgg 18
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 81
agggattgaa acaggggac 19
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 82
tttgaaacga aaacgacgac 20
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
tttccctgtg ttctgctact tt 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
ttgtgcttct cctggtctta tt 22
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 85
tatccgaatt ccaaatcacg 20
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 86
ttcccaccaa ctactccact aa 22
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 87
ccgcaacaac ctatgacct 19
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
caatcctaca cccccaaca 19
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
agggatggtg aatgagaaga c 21
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 90
gggaactgag ctgtgaaaaa 20
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 91
agcgacggaa gcgagagaa 19
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 92
tggcggacaa accaagcag 19
Claims (7)
1.SSR分子标记引物在鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关基因中的应用，所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种叶用芥菜晚抽薹性状的分子标记开发方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以叶用芥菜晚抽薹DH系黔青四号为母本，以早抽薹自交系白芥菜为父本进行杂交，对得到的F1代自交得F2代群体，统计F2代群体植株的抽薹时间；
(2)根据F2代群体抽薹时间频率分布，选取极端早抽薹单株、极端晚抽薹单株和两个中间型进行混池测序，混池规模为：98+106+99+97；结合亲本重测序，对晚抽薹性状进行定位，将候选区间定位在叶用芥菜A基因组的三号染色体上，且区间大小为1.1Mb；
(3)将F2代群体中极端早抽薹性状和极端晚抽薹性状的材料分别自交，构建F2:3家系群体，次年种植所述F2:3家系群体，根据主效区间开发分子标记，筛选主效区间内的SSR序列，选取SSR序列前后200bp的核苷酸序列设计引物，得SSR分子标记引物。
3.根据权利要求2所述分子标记开发方法，其特征在于，在所述混池测序后，还包括利用Graded-seq关联分析方法对抽薹性状进行定位。
4.根据权利要求2所述分子标记开发方法，其特征在于，步骤(3)得所述SSR分子标记引物后，还包括利用亲本和F1的基因组DNA进行PCR验证。
5.根据权利要求4所述分子标记开发方法，其特征在于，所述PCR验证的体系以20μl计，包括：基因组DNA 1μl、2×Taq PCR MasterMix 10μl、上游引物和下游引物各1μl和ddH2O 7μl。
6.根据权利要求4或5所述分子标记开发方法，其特征在于，所述PCR验证的程序，包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30min，20个循环；72℃延伸5min。
7.一种鉴定叶用芥菜晚抽薹性状相关的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用SSR分子标记引物和叶用芥菜的基因组DNA配制PCR体系，进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
所述SSR分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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| CN101117645A (zh) * | 2007-07-05 | 2008-02-06 | 南京农业大学 | 不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法 |
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| CN111748643A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-10-09 | 河南省农业科学院园艺研究所 | 一种与大白菜根肿病抗性相关的基因CRs的SNP分子标记及其应用 |
| CN112251536A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-01-22 | 中国农业科学院麻类研究所 | 一种与萝卜抽薹性紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
-
2021
- 2021-08-13 CN CN202110930033.6A patent/CN113621730A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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