CN108486276B

CN108486276B - 辣椒熟性snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108486276B
Application number: CN201810555673.1A
Authority: CN
Inventors: 袁欣捷; 陈学军; 方荣; 周坤华
Original assignee: VEGETABLE AND FLOWER INSTITUTE JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: VEGETABLE AND FLOWER INSTITUTE JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN108486276A

Abstract

本发明公开了辣椒熟性SNP分子标记及其应用，所述辣椒熟性SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明利用BSR‑Seq(Bulked Segregant RNA‑Seq)技术，快速鉴定控制始花节位的染色体位点，针对该位点特定SNP开发辣椒熟性分子标记。利用本发明提供的分子标记及其扩增引物，结合特定的限制性内切酶处理，可在子叶期快速、准确筛选出特早熟辣椒，实现辣椒熟性育种的分子标记辅助选择，提高育种选择效率，在辣椒熟性育种中具有重要应用价值。

Description

辣椒熟性SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及辣椒熟性SNP分子标记及其应用。

背景技术

辣椒(Capsicum spp.)是茄科重要经济作物，在世界各地广泛种植，辣椒是我国主要蔬菜作物之一。辣椒植株为合轴分枝结构，主茎生长到一定时候停止生长，其顶端分生组织转化为花序分生组织，花序分生组织在适宜的内在条件和外在环境(如日照长度和温度)下发育为单生花，开花标志着主茎生长的终止，由侧生分生组织生长发育为新枝，不久新枝又停止生长，继续由新枝顶端的侧生分生组织代替顶端分生组织生长，不断重复形成合轴分枝。

辣椒第一朵花的着生节位称为始花节位，一般以主茎上从子叶到第一朵花之间的真叶(节位)数来度量。始花节位是辣椒的重要熟性性状，是辣椒品种改良的主要目标之一。始花节位低的辣椒品种往往开花坐果早，在春茬种植中能提早上市，适度规避雨水和病虫害，降低农药使用量，提高种植经济效益；在秋茬种植中可规避后期低温环境，减少设施栽培能耗。始花节位高的辣椒品种开花坐果晚，能避开上市旺季，满足市场多样化需求。

基于始花节位开发辣椒熟性分子标记能进行超早期选择，加快育种进程，对辣椒熟性育种具有重要指导作用。自然变异中辣椒始花节位受少数主效基因和部分微效基因控制，同时也受温度和光照等环境影响，为数量性状，传统的表型选择精准性不高。目前已有的辣椒始花节位分子标记多与目标基因遗传距离较远，或在使用上局限性较大。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种辣椒熟性分子标记及其应用。

本发明提供一种辣椒熟性分子标记，其含有位于辣椒CM334基因组(v1.55)第2号染色体142,998,685处的多态性为T/C的核苷酸序列或含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第457位多态性为T/C。

本发明利用BSR-seq技术发现辣椒早熟植株中一个AP2家族转录调控因子的起始密码子发生突变，该特定的SNP位点的碱基由T突变为碱基C。所述特定SNP位点位于已测序辣椒CM334基因组(v1.55)第2号染色体142,998,685处，即如SEQ ID NO.1所示序列的第457位，该位点碱基为CC的纯合基因型对应辣椒早熟性状，为碱基TT的纯合基因型或CT杂合基因型对应辣椒晚熟性状。根据该SNP位点开发所述辣椒熟性分子标记。

所述辣椒熟性分子标记可以由如下引物扩增得到：

SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG

SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC

进一步地，本发明提供所述辣椒熟性分子标记的扩增引物。

优选地，其具有如下核苷酸序列：

SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG

SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC

利用本发明提供的分子标记，可以实现辣椒熟性的快速准确鉴定。

因此，本发明还提供了所述的辣椒熟性分子标记或其引物在鉴定辣椒熟性性状中的应用。

具体地，所述应用包括如下步骤：

(1)提取待测辣椒种质的基因组DNA；

(2)以待测辣椒种质基因组DNA为模板，利用所述辣椒熟性分子标记的扩增引物，进行PCR扩增反应；

(3)分析扩增产物的SNP位点，该位点碱基为CC的纯合基因型对应辣椒早熟性状，为TT的纯合基因型或CT的杂合基因型对应辣椒晚熟性状。

本领域技术人员应该理解，分析SNP位点碱基类型的方法有很多，包括测序分析、等位基因特异性PCR分析、酶切产物多态性分析等。

优选地，步骤(3)中分析所述扩增产物的SNP位点为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带电泳检测，判断所述SNP位点碱基类型。

更优选地，所述限制性内切酶为特异性识别ACGT的限制性内切酶TaiI。

在本发明提供的具体实施方式中，所述PCR扩增反应的体系和程序以及TaiI限制性内切酶的酶切反应体系和程序如下：

PCR扩增反应体系为：2×Es Taq MasterMix(Dye)5μL，10μM正向引物FFN1-5UF4和10μM反向引物FFN1-e1R2各0.2μL，100ng/μL DNA模板0.6μL，ddH₂O补齐至10μL。其中，EsTaq MasterMix来自康为世纪生物科技有限公司的商品化试剂盒CW0690。

PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，38个循环；72℃延伸10min。

限制性内切酶TaiI酶切反应体系为：10×Buffer R 0.65μL，PCR产物3.5μL，TaiI限制性内切酶0.1μL，ddH₂O补齐至10μL，65℃酶切反应15h。其中，TaiI限制性内切酶来自Thermo Scientific的商品化限制性内切酶ER1141。

本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序可以根据所用DNA聚合酶、限制性内切酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本发明所述的PCR扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序的选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。

始花节位是辣椒的重要熟性性状，始花节位的高低决定了辣椒的早熟或晚熟，始花节位低的辣椒品种一般开花坐果早，表现为早熟性状；始花节位高的辣椒品种开花坐果晚，表现为晚熟性状。

因此本发明还提供了所述的分子标记和/或其引物在鉴定辣椒始花节位以及在辣椒分子标记辅助育种中的应用。

最后，本发明提供了含有所述分子标记的引物的检测试剂或含有所述检测试剂的试剂盒。

所述试剂盒还包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的分子标记能够准确、特异地鉴定辣椒熟性性状，实现辣椒早熟和晚熟种质的子叶期早期鉴定。

(2)利用本发明提供的分子标记的引物进行扩增，结合限制性内切酶酶切分析扩增产物，根据酶切产物条带特征即可判断辣椒熟性，无需测序或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作，检测的准确率最高可达100％，且具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。

(3)应用本发明提供的分子标记对辣椒种间杂交后代分离世代连续进行多代分子标记辅助选择，与辣椒其他优良性状聚合过程中，可于子叶期快速准确区分始花节位≤4节的超早熟辣椒单株与＞4节的相对晚熟辣椒单株，方便进行精准的超早熟辣椒分子标记辅助选择育种，大大加快育种进程。

附图说明

图1为本发明实施例1中两个极端池SNPs位点delta值全基因组扫描结果。

图2为本发明分子标记CSF2对应的SNP位点示意图。

图3为本发明实施例2中利用辣椒熟性SNP分子标记鉴定辣椒杂交后代的始花节位的部分电泳结果图；其中，M：DNA Marker；A：晚熟辣椒A₁₄₅；B：特早熟辣椒B₉₄₃₁；F₁：B₉₄₃₁和A₁₄₅杂交获得的F₁代植株；F₂：B₉₄₃₁和A₁₄₅杂交所得F₁自交获得的F₂群体中随机挑选的单株；E：始花节位为1-4节的超早熟辣椒；L：始花节位大于4节的相对晚熟辣椒。

图4为本发明实施例3中利用辣椒熟性SNP分子标记鉴定92份辣椒种质材料的始花节位的电泳图；其中，M：DNA Marker；B：特早熟辣椒B₉₄₃₁；A：晚熟辣椒A₁₄₅；F₁：B₉₄₃₁和A₁₄₅杂交获得的F₁代植株；BH：B₉₄₃₁与灌木辣椒H108杂交后选育的早熟植株。1-92不同辣椒种质材料。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所用的辣椒材料均为可从商业途径或国家种质库得到或为本领域技术人员广泛推广使用的材料。

实施例1辣椒熟性SNP分子标记的开发

1、群体材料构建及遗传分析

发明人在前期的研究过程中，在辣椒熟性正常的群体中发现一早熟自然变异株，经多代自交和定向选择育成了性状稳定的早熟自交系B₉₄₃₁，依种植环境变化，始花节位为1-4节。以早熟辣椒B₉₄₃₁为母本，晚熟辣椒(依种植环境变化，始花节位为13-18节)A₁₄₅(国家种质库代号V06C1765)为父本杂交得到F₁代，F₁植株自交得到F₂群体。2017年春季种植该F₂群体植株297株，始花节位表型以主茎上从子叶到第一朵花之间的真叶(节位)数来度量，统计结果表明该群体始花节位呈双峰分布，表明有主效基因控制始花节位，从双峰峰谷处划分，高始花节位(≥5)晚熟植株共215株，低始花节位超早熟植株(≤4)共82株，符合3:1分离比(χ²＝1.08，P>0.05)，说明该群体的始花节位(≤4)受单基因控制。

2、BSR-Seq(Bulked Segregant RNA-Seq)分析

选取F₂群体中始花节位极低的早熟辣椒30株，始花节位极高的晚熟辣椒30株，分别构建极端混池，用宝生物公司的RNAiso Plus试剂盒(Code No.9108)按说明书操作提取总RNA，进行BSR-seq测序(HiSeq X-ten测序，PE140)，低始花节位池得到6.68G有效数据，高池花节位池得到6.93G有效数据，分别有83.69％和83.83％能比对到参考基因组。用SAMtools软件分析得到两个混池的SNPs位点。分别计算两个混池中各SNPs位点的频率及两个混池中对应SNPs频率差值(即delta值)，最后以平均delta值(3MB为窗口，1MB为步长)为纵坐标，染色体位置为横坐标作图(图1)，可见在第2条染色体末端有一峰值，说明该位置有一主效基因控制辣椒始花节位，大致在130-170Mb位置。

3、辣椒熟性SNP分子标记的开发

在上述2中的BSR-seq定位区间有一个AP2家族转录调控因子，在拟南芥中AP2是开花抑制因子，能通过抑制开花激活因子并激活开花抑制因子来调控开花时间。因此推测该基因(命名为CaFFN1)可能是辣椒始花节位调控基因。设计引物FFN1-csF2(SEQ ID NO.4：5’-TCCACGCATCTATTTTAGGCAG-3’，)和FFN1-csR2(SEQ ID NO.5：5’-TTAACACCAACCCAGTGAGCTC-3’，)扩增亲本B₉₄₃₁和A₁₄₅中的CaFFN1基因并测序，发现亲本B₉₄₃₁中该基因起始密码子发生突变，碱基T突变为碱基C(图2)。针对该SNP开发分子标记，在该SNP两侧设计引物FFN1-5UF4(SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG)和FFN1-e1R2(SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC)，采用该引物对扩增分子标记，并开发酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)分子标记。具体PCR反应体系为：2×EsTaq MasterMix(Dye)5μL，10μM正向引物FFN1-5UF4和10μM反向引物FFN1-e1R2各0.2μL，100ng/μL DNA模板0.6μL，ddH₂O补齐至10μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，38个循环；72℃延伸10min。利用特异性识别ACGT四碱基的限制性内切酶TaiI对PCR产物进行酶切反应，PCR反应产物用限制性内切酶TaiI酶切的反应体系为：10×Buffer R0.65μL，PCR产物3.5μL，TaiI限制性内切酶0.1μL，ddH₂O补齐至10μL，65℃酶切反应15h。具有纯合突变基因型的早熟辣椒，PCR条带中的ACGT四碱基被TaiI识别切割后产生～459bp和～394bp的特征条带；具有纯合野生基因型的晚熟辣椒，PCR条带中ATGT无法被TaiI识别，酶切后还是原本扩增的～853bp条带；具有杂合基因型的晚熟辣椒，PCR条带中ACGT/ATGT被TaiI识别切割后同时具有这三种大小条带(图3)，将此分子标记命名为CSF2，其序列如SEQ ID NO.1所示，在辣椒早熟性状鉴定中，如SEQ ID NO.1所示的第457位为CC的纯合基因型时对应辣椒早熟性状，为TT的纯合基因型或CT杂合基因型时对应辣椒晚熟性状。

实施例2辣椒熟性SNP分子标记CSF2在F₂群体植株检测中的应用

用CTAB法提取亲本B₉₄₃₁、亲本A₁₄₅、F₁植株(B₉₄₃₁×A₁₄₅)及F₂植株DNA，用Nanodrop分光光度计检测DNA浓度，加ddH₂O将所有DNA浓度调整为100ng/μL。按以下条件进行PCR：康为世纪生物科技有限公司2×Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690)5μL，正向引物FFN1-5UF4(10μM)和反向引物FFN1-e1R2(10μM)各0.2μL，100ng/μL的DNA模板0.6μL，加ddH₂O补齐至10μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，38个循环；72℃延伸10min。PCR反应产物用限制性内切酶TaiI酶切：10×Buffer R 0.65μL，PCR产物3.5μL，TaiI限制性内切酶0.1μL，ddH₂O补齐至10μL，65℃酶切反应15h。取4μL PCR反应产物电泳检测。结果发现F₂植株的基因型与表型共分离，即在种植的297株F₂群体植株中，82株带型与特早熟亲本B₉₄₃₁一致的均为始花节位≤4的特早熟辣椒，215株带型与晚熟亲本A₁₄₅或F₁基因型一致的均为始花节位＞4的相对晚熟辣椒，部分扩增产物电泳结果见图3。利用本发明所述CAPS标记CSF2按上述方法检测，可准确预测杂交后代熟性，准确率达到100％，大大提高辣椒熟性选择效率。

实施例3辣椒熟性SNP分子标记CSF2在鉴定辣椒熟性性状中的应用

选取始花节位变异范围为5-23节的92份辣椒(Capsicum annuum)种质材料(表1)，用CTAB法提取其DNA，同时提取特早熟辣椒B₉₄₃₁、晚熟辣椒A₁₄₅及其F₁植株(B₉₄₃₁×A₁₄₅)DNA为对照，按以下条件进行PCR：反应总体积为10μL，其中康为世纪生物科技有限公司2×Es TaqMasterMix(Dye)(CW0690)5μL，正向引物FFN1-5UF4(10μM)和反向引物FFN1-e1R2(10μM)各0.2μL，30-100ng/μL的DNA模板0.6μL，加ddH₂O补齐至10μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，38个循环；72℃延伸10min。PCR反应产物用限制性内切酶TaiI酶切：10×Buffer R 0.65μL，PCR产物3.5μL，TaiI限制性内切酶0.1μL，ddH₂O补齐至10μL，65℃酶切反应15h。取5μL PCR反应产物电泳检测，电泳结果见图4。结果发现这92份种质材料得到的条带均为野生型的～853bp条带，只有特早熟辣椒B₉₄₃₁为突变型～459bp和～394bp的特征条带，说明CSF2标记可以从始花节位各异的种质材料中准确鉴别出始花节位≤4节的特早熟辣椒，可准确预测种质材料熟性，其鉴定准确率达到100％。

表1 92份辣椒种质材料名称及始花节位

实施例4利用分子标记CSF2进行特早熟辣椒种质创制

海南野生灌木辣椒H108为灌木辣椒种质，具有抗CMV、卷叶病毒病和白粉病等抗性优势，强辣，晚熟，始花节位为22；B₉₄₃₁为一年生特早熟辣椒，始花节位1-4节，微辣，抗性一般。将特早熟辣椒B₉₄₃₁与灌木辣椒H108进行种间杂交，利用开发的CSF2分子标记对种间杂交后代分离世代连续进行多代分子标记辅助选择，最终选育出始花节位调控位点处基因型与早熟亲本B₉₄₃₁一致，为纯合突变基因型(具有～459bp和～394bp的特征条带)的种质材料BH(图4)，该材料为抗性强，中辣，特早熟(始花节位为3)的优异种质材料。

本发明提供的辣椒熟性分子标记CSF2在不同辣椒种质材料中均可于子叶期即准确预测辣椒熟性，可用于特早熟辣椒种质的分子标记辅助选择和辣椒熟性育种，具有重要应用价值。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 辣椒熟性SNP分子标记及其应用

<130> KHP181112946.3

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 853

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taaaagtggc ctagtccatg tctgaattag gcagctaaga gaggaatggt acaaaatcaa 60

gtgaaatact acaagtagtt aataatagtg ggaaacatat atctatcata tctaacccta 120

tctctctcca ctaacttttt ctcccaacaa cttaaccctc tctataagtc gtaggtttca 180

tgttctttca atatactcaa taaaaccctt tttaatttat catattattt tacatataag 240

tattcaactc cacgcatcta ttttaggcag acagacagag aaaaaagaac tacaactaga 300

gagggagaga aagagaaaga gaacaaactg aaaacaagtc cttttgtagc aattgccata 360

acccccaccc ccacccccca naaaaaatct gcaaaatttt gaactgtttt ctgttttata 420

gttttcagat ttttggtttt ttggtgtaga gagaaatgtg ggatctaaat gattcaccgg 480

atcgacgaag gccggatttt gatgaatcag aagaagccta ttcttctcaa gttcatcggg 540

tcggatcttt ttcgaattca agttcttcag ctgtagctac tgatgatgtt tctgaagaag 600

aagtcggagt acgatcagga aagaaaaaaa gaagtactaa gcctagtaaa atattcgggt 660

tttccgtttt gggccctgat gatgaagaag aagaaaagcc ggtaacccgg cagtttttcc 720

cggttgatga gcctgaaacg ggttgtgtta caaatgattc cccgaatttt cccagagctc 780

actgggttgg tgttaaattt taccaaaatg agccacttgt caatacggga ttggctaagc 840

ctatagatat ggc 853

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaaagtggc ctagtccatg tctg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccatatcta taggcttagc caatc 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccacgcatc tattttaggc ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaacaccaa cccagtgagc tc 22

Claims

1.辣椒熟性分子标记，其特征在于，所述辣椒熟性分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述核苷酸序列的第457位多态性为T/C，所述熟性为始花节位。

2.权利要求1所述的辣椒熟性分子标记或所述辣椒熟性分子标记的引物在鉴定辣椒熟性性状中的应用，所述熟性为始花节位，

所述引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG；

SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测辣椒种质的基因组DNA；

（2）以待测辣椒种质基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增反应；

（3）分析扩增产物的SNP位点，该位点碱基为CC的纯合基因型对应辣椒早熟性状，为TT的纯合基因型或CT的杂合基因型对应辣椒晚熟性状，所述辣椒早熟性状为始花节位≤4节，所述辣椒晚熟性状为始花节位＞4。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中所述的分析所述扩增产物的SNP位点为采用特异性识别ACGT的限制性内切酶TaiI酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带的电泳检测，判断所述SNP位点碱基类型。

5.权利要求1所述的辣椒熟性分子标记或所述辣椒熟性分子标记的引物在鉴定辣椒始花节位或早熟辣椒中的应用，所述早熟辣椒的始花节位≤4节，

所述引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG；

SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC。

6.权利要求1所述的辣椒熟性分子标记或所述辣椒熟性分子标记的引物在辣椒熟性分子标记辅助育种中的应用，所述熟性为始花节位，

所述引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTG；

SEQ ID NO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC。