CN113151563B - 鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。为提高西瓜果肉颜色鉴定的效率和准确性，本发明在遗传规律基础之上，利用基因组重测序、BSA‑seq等技术，获得与西瓜橙色果肉性状紧密连锁的染色体区段，在该区段内开发可用于鉴定西瓜橙色果肉性状的引物，并在遗传群体中进行验证，最终开发出能够准确鉴定西瓜橙色果肉的引物对，该引物对及含有引物对的试剂盒可应用于种质资源筛选及西瓜分子育种，对提高育种的效率和准确性具有重要的理论和实践意义。

Description

鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是重要的葫芦科经济作物，在我国及世界范围内广泛种植，据联合国粮农组织统计，我国西瓜的年产量和栽培面积均居世界首位。西瓜果肉颜色具有十分丰富的变异(深红色、红色、粉色、橙色、亮黄色、浅黄色、白色，部分野生种果肉颜色呈现浅绿色)，是育种的重要指标。类胡萝卜素是西瓜果肉颜色形成的主要色素，为脂溶性萜类物质，红色果肉和粉色果肉以番茄红素为主要色素；橙色果肉主要色素为β-胡萝卜素或前番茄红素；黄色果肉主要色素为紫黄质和叶黄素。类胡萝卜素和前番茄红素是人体健康不可缺少的微量营养元素，在抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等方面具有重要功效。培育具有不同果肉颜色的西瓜新品种，在解决公共营养问题和满足人们对具有功能性成分的西瓜新品种需求方面均具有重要科学意义。

西瓜的果肉颜色需要待果实成熟，采收后方可进行鉴定，在育种过程中耗费大量时间、人力、物力和财力。尽管目前通过种质资源的筛选，已经获得了多种果肉颜色的西瓜材料，但大部分材料在品质、抗性等方面仍需要进一步改良，在改良的过程中，果肉颜色会随着杂交亲本果肉颜色的差异，在分离后代中发生较大差异。而分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与待分析的性状相连锁以及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。然而，目前调控西瓜橙色果肉性状形成的关键基因(或位点)尚未见正向遗传学方面的报道，因此，根据橙色果肉基因所在区段内的序列差异，开发与其紧密连锁的分子，仍然为目前西瓜果肉颜色分子标记辅助筛选的主要技术难点。

发明内容

为提高西瓜果肉颜色鉴定的效率和准确性，本发明提供了鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供引物对在鉴定西瓜果肉颜色中的应用，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组DNA，根据扩增产物来鉴定颜色。

在本发明的一种实施方式中，所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。

在本发明的一种实施方式中，所述鉴定颜色为橙色或红色。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定西瓜果肉颜色的方法，所述方法为利用所述的引物对对西瓜的基因组DNA进行扩增，获得PCR产物，再利用限制性内切酶对获得的PCR产物进行酶切，根据酶切产物，判断西瓜果肉颜色。

在本发明的一种实施方式中，所述的方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)用限制性内切酶TaqI对步骤(2)获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物；

(4)通过检测酶切产物，判断西瓜的果肉颜色。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述判断方法为利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若酶切产物为两条，则判断西瓜具有橙色果肉性状；若酶切产物为一条或多条，则判断西瓜具有红色果肉性状。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述判断方法为利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若酶切产物为两条，则判断西瓜具有橙色果肉性状；若酶切产物为一条或三条，则判断西瓜具有红色果肉性状。

本发明的第三个目的是提供上述任一鉴定方法在西瓜果肉颜色辅助鉴定、辅助育种及西瓜果肉颜色筛选中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种用于鉴定西瓜橙色果肉性状的试剂盒，所述试剂盒含有所述引物对和限制性内切酶TaqI。

本发明的第五个目的是提供所述试剂盒的使用方法，所述使用方法为利用所述引物对对西瓜基因组DNA进行扩增，获得PCR产物，再利用限制性内切酶TaqI对获得的PCR产物进行酶切。

本发明的第六个目的是提供所述的试剂盒在西瓜果肉颜色辅助鉴定、辅助育种及西瓜果肉颜色筛选中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的用于鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒在不同西瓜材料中具有通用性，在西瓜的苗期即可对西瓜是否具有橙色果肉性状进行辅助选择，提高了育种的准确性和效率，操作简便，结果易于观察，可用于今后西瓜果肉颜色育种过程中的分子标记辅助筛选，对提高育种的效率和准确性具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为西瓜橙色果肉性状关键基因的初步定位结果图；

图2为引物对母本(红色果肉)、父本(橙色果肉)、F₁代的酶切结果电泳图，泳道1为红色果肉材料花园母本，泳道2为橙色果肉材料Yellow Crimson，泳道3为两亲本杂交获得的F₁代，泳道4为Marker；

图3为F₂代PCR产物的利用限制性内切酶进行酶切后的电泳结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

基因组DNA的提取方法：

基因组DNA提取方法参照Murray等(1980)的方法(Murray M.,Thompson W.F.,Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl.Acid.Res.,1980,8:668-673.)，并在此基础上进行改良，具体步骤如下：

①将采集的西瓜幼嫩真叶用无菌水洗净擦干后，取0.2g放入1.5mL离心管中，加入液氮充分研磨至白色粉末，加入800μL 65℃预热的2％的CTAB溶液(2％CTAB，100mmol/LTris-HCl pH＝8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH＝8.0，2％β-巯基乙醇)充分混匀，65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次；

②取出离心管，待冷却至室温，13,000rpm离心10min，贴壁吸出上清液置于新离心管中；

③贴壁加入750μL氯仿和异戊醇的混合溶液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)，充分混匀，静止10分钟后，13,000rpm离心10min；

④取出离心管，采用上述相同的处理方法贴壁吸出700μL上清液置于新离心管中；

⑤重复步骤③一次；

⑥贴壁吸出650μL上清液置新管中，加入2μL RNase(10mg/mL)混匀，放置37℃水浴2小时；

⑦贴壁加入650μL氯仿和异戊醇的混合溶液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)，充分混合，静止10分钟后13,000rpm离心10min；

⑧贴壁吸出550μL上清液置新管中加入-20℃预冷的550μL异丙醇(贴壁加入)，盖紧离心管盖，上下颠倒数次后置于-20℃冰箱静止60min；

⑨取出离心管，于离心机中13,000rpm离心10min，小心弃去上清液，保留离心管底部沉淀物；

⑩用预冷的70％乙醇清洗沉淀三次，并将离心管置于超净工作台中，无菌风吹干后加入 200μL ddH₂O溶解，于-20℃中保存备用。

实施例1：特异性鉴定果肉颜色引物的获取方法

(1)实验材料的获得

选用成熟果实具有红色果肉性状的花园母本，栽培种西瓜作为父本，选用具有橙色果肉性状的Yellow Crimson，栽培种西瓜为母本，对上述父本和母本进行杂交，获得F₁代；再对上述获得的F₁代自交获得的F₂代群体，以F₁代和F₂代群体作为供试材料。

分别播种步骤(1)中各世代材料，于成熟期，采收果实，将果实横切，通过观察的方式判断果肉颜色，每次颜色观察由三人分别查看，以确保调查结果的准确性。F₁代和F₂代群体各单株果肉颜色调查结果表明：F₁代表现为红色果肉，296个F₂代单株中，包含橙色果肉单株72株，红色果肉单株224株，卡方检验符合1:3的分离比例，得出西瓜橙色果肉性状为单基因控制的隐性性状。

(2)获得与西瓜橙瓤性状连锁的染色体区段

在F₂世代中选择具有橙色果肉性状的单株20株，选择具有非橙色果肉性状的单株20 株，分别提取各单株DNA，调节DNA浓度一致后等量混合，分别构建橙色果肉和红色果肉性状的基因池，与两亲本基因组DNA共同测序，进行BSA-seq分析，在F₂代分离群体中对各单株进行基因分型，并结合其表型数据，进行遗传连锁分析，判断基因型与表型数据的符合度，通过不断缩短定位区间，最终确定西瓜橙色果肉性状关键基因的主效基因定位在西瓜基因组10号染色体上约340Kb范围内，初步定位结果如图1所示。进一步确定了该区段内存在一处SNP位点(A→G)的变化与橙色果肉和红色果肉性状紧密连锁，橙色果肉材料中该位点为G，红色果肉材料中该位点为A。最终确定的橙色果肉和红色果肉性状紧密连锁的序列大小为693bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(3)设计引物对

针对步骤(2)获得的序列SEQ ID NO.1，设计引物对，获得的引物对上游引物Orange-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物Orange-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

实施例2：一种鉴定西瓜橙色果肉性状的方法

(1)提取待测西瓜的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)用限制性内切酶TaqI对步骤(2)获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物；

(4)通过检测酶切产物，判断西瓜的果肉颜色。

具体判断方法为：利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若酶切产物为两条，则判断西瓜具有橙色果肉性状；若酶切产物为一条或多条，则判断西瓜具有红色果肉性状。

上述PCR反应体系为：上下游引物各1μL(引物浓度为2pM)，DNA模板2μL(浓度为30ng/μL)，10×PCR Buffer 1μL(含Mg²⁺15mM)，dNTP 0.15μL(浓度为10mM)，Taq 酶0.1μL(5U/μL)，无菌去离子水6.75μL。

上述PCR反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

上述酶切反应体系及程序为：PCR产物5μL(浓度为0.1～0.5μg)，限制性内切酶TaqI 酶0.3μL，Buffer 1μL，去离子水9μL，将上述混合产物于37℃水浴酶切2h后，4℃保存。

PCR扩增产物和酶切产物检测：分别取3μL PCR产物或酶切产物，加入1μL LoadingBuffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，110V/500mA电泳，电泳时间为25-30min。

实施例3：利用所获得的引物对对不同果肉颜色的西瓜品种进行筛选

为判断所开发的引物对鉴定西瓜橙色果肉的准确性，选择24个实施例1所述的F₂代西瓜幼苗的样品，按照实施例2所述的鉴定方法对各样品进行果肉颜色鉴定，鉴定结果如图3 所示，样品1-8及17-24的酶切产物为一条或三条，因此将样品1-8及17-24鉴定为具有红色果肉性状的西瓜幼苗；样品9-16的酶切产物为两条，因此将样品9-16鉴定为具有橙色果肉性状的西瓜幼苗。于西瓜成熟期，采收F₂代果实，将果实横切，通过观察的方式判断果肉颜色，经验证，24个F₂代样品的引物对鉴定结果与实际成熟果实的果肉颜色100％一致。

本发明的鉴定方法可以以不同时期的西瓜幼苗为材料，为不影响后续生长最佳时期，是以西瓜幼苗期(两叶一心期)的叶子为材料提取DNA。

利用本发明的鉴定方法可在西瓜幼苗期判断果肉颜色，采样的时间点约为两叶一心时期；而常规育种需要果实完全成熟才能进行判断，果实完全成熟约为授粉后35-40天，由此可见，利用本发明可有效缩短育种时间，加快育种速度。

实施例4：一种用于鉴定西瓜橙色果肉的试剂盒

一种用于鉴定西瓜橙色果肉的试剂盒包括如下试剂：Orange-F(浓度为2pM)、Orange-R (浓度为2pM)、10×PCR Buffer(含Mg²⁺15mM)、dNTP(浓度为10mM)、Taq酶(5U/μL)、限制性内切酶TaqI和无菌去离子水。

实施例5：一种用于鉴定西瓜橙色果肉的试剂盒的使用方法

(1)提取待测西瓜的基因组DNA，并调节基因组DNA浓度至30ng/μL。

(2)按照如下PCR体系添加样品及试剂

(3)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性7min；94℃变性30s，53℃退火30s， 72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

(4)用限制性内切酶TaqI对步骤(3)获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物，上述酶切反应体系及程序为：PCR产物5μL(浓度为0.1～0.5μg)，限制性内切酶TaqI 0.3μL，Buffer 1μL，去离子水9μL，将上述混合产物于37℃水浴酶切2h后，4℃保存

(5)利用1％琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)所得的酶切产物进行检测，通过检测结果判断西瓜是否表现为橙色果肉性状。若酶切产物为两条，则西瓜具有橙色果肉性状；若酶切产物为一条或三条，则西瓜具有红色果肉性状。

虽然本发明已经以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利 要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 鉴定西瓜果肉颜色的方法、引物对、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

cgatcagaac atgataggat agcaatgctt cccttgcgat ctgaaacaac agcagtgtca 60

acgtccaaaa gagtacaatc agcaactagc ctctgtgaag gatcagagta aatttgctcc 120

agctttttag catcctacag tccaagaaac gaaggtaatg atgcaccagt gcagctcaat 180

ctacaataac atgccatcaa acattaaaga aaaaatttca agccaaaaat tttgcatcat 240

aaaaaagcta ttcccttcct acccgattat ctttaggagt tgatcgagaa attctacgta 300

taggtttagt tggacataac cagattttcc agtttaatag ttcaggaggg cttgagttgg 360

ttggatgagt ctataaaatc cagcaaagag taaacggatg gaatccaatg ggacgagctg 420

ctgggattct tggtggaatg tgtcttaggt ctctgggtta ttctgccttc aatactcatg 480

gtggttgagc aggttgattt ttggtctgtg agggtccaaa ttgaaacttg agcaggttta 540

gatttattgt taaagtaaaa aagacacgga aaatggggga gaagaaggta aacaaaacat 600

aatatcctac tttttttcct tgtctttgat tataatttga ttttggggag aacaataggg 660

tgcaacccca actacaccta actcatacat tcc 693

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgatcagaac atgataggat agca 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaatgtatg agttaggtgt agttg 25

Claims (6)

1.引物对和限制性内切酶TaqI在鉴定西瓜橙色果肉中的应用，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组DNA获得扩增产物，再利用限制性内切酶TaqI酶切扩增产物，若酶切产物为两条则判断为橙色果肉性状，若酶切产物为一条或三条则判断为红色果肉性状。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。

3.一种鉴定西瓜橙色果肉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物；

(3)用限制性内切酶TaqI对步骤(2)获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物；

(4)通过检测酶切产物，判断西瓜的果肉颜色，判断方法为利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若酶切产物为两条，则判断西瓜具有橙色果肉性状；若酶切产物为一条或三条，则判断西瓜具有红色果肉性状。

4.权利要求3所述的方法在西瓜橙色果肉辅助鉴定、辅助育种及西瓜橙色果肉筛选中的应用。

5.一种用于鉴定西瓜橙色果肉性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶TaqI；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

6.一种权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，利用所述引物对对 西瓜基因组DNA进行扩增，获得PCR产物，再利用限制性内切酶TaqI对获得的PCR产物进行酶切。

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