CN110527741A - 一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2f基因紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2f基因紧密连锁的分子标记、引物及应用 Download PDF

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Abstract

一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记、引物及应用，属于分子标记技术领域。为了提高抗白粉病植株基因型选择的准确性以及育种过程的效率，本发明提供了一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为PM‑01或PM‑02；所述分子标记PM‑01由SEQ ID NO.1所示的313nt核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示的313nt核苷酸片段组成；所述分子标记PM‑02由SEQ ID NO.3所示的249nt核苷酸片段和SEQ ID NO.4所示的249nt核苷酸片段组成。本发明，可以简便、快速地应用于白粉病抗病的分子标记辅助育种筛选体系。

Description

一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标 记、引物及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记、引物及应用。
背景技术
美洲南瓜属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)一年生蔓生草本植物，是重要的栽培作物和经济作物，南瓜营养丰富，具良好的食用及药用价值。白粉病是一种广泛分布于不同作物，各地区普遍发生的世界性病害。白粉病对美洲南瓜的侵染严重影响植株的生长发育，使植株无法正常进行光合作用，营养供给，从而导致收获时籽粒不饱满，果实产量及品质下降。白粉病对于作物危害的影响甚重，因此早在1977年就有关于白粉病相关的研究报道：确定野生型Castag okeechobeensis(Small)Bailey、Cucurbitalundelliana Bailey与野生型Castag moschata Duchesne均存在抗白粉病基因，但抗病遗传规律有所区别。2003年RonCohen等利用美洲南瓜True French与抗白粉病野生南瓜进行杂交，从得到的F2中选取抗病植株与True French回交6代，基因型背景纯化后以TrueFrench基因型相似，抗病性表现是由一个不完全显性的基因控制的，将其命名为Pm-0。2017年王晶通过BSA结合SSR方法通过六世代群体对美洲南瓜白粉病进行了初定位，利用68对在双亲中具有多态性的引物筛选抗感基因池，得到5对具有多态性的标记，对F2群体进行筛选，最终得到1个与抗病基因连锁的标记SSR237，遗传距离为5.2cM。同年赵敏雪等通过利用父母本进行重测序结合SSR分子标记筛选的方式，将抗病基因定位在10号染色体157Kb的区间之内。以上研究均没有明确白粉病生理小种。
美洲南瓜营养价值丰富，栽培面积逐年扩大，白粉病危害日渐严重，而目前常用的白粉病治理方式是化学试剂防治，这种治理方法不仅成本高而且危害消费者的身体健康，对环境造成污染，化学试剂喷施还会使病原菌产生耐药性，同时白粉病病原菌的生理小种多样、分化快，使用化学药物不能准确、彻底从根本上抵御白粉病的侵害，因此选育抗白粉病的南瓜品种极为重要。传统育种方式费时费力，对后代表型间接选择的方式易受外界环境因素的影响，降低选择的准确性。
发明内容
为了提高抗白粉病植株基因型选择的准确性以及育种过程的效率，本发明提供了一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为PM-01或PM-02；所述分子标记PM-01由SEQ ID NO.1所示的313nt核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示的313nt核苷酸片段组成；所述分子标记PM-02由SEQ ID NO.3所示的249nt核苷酸片段和SEQIDNO.4所示的249nt核苷酸片段组成。
进一步地限定，所述分子标记PM-01中SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段与易感白粉病基因连锁。
进一步地限定，所述分子标记PM-02中SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段与易感白粉病基因连锁。
本发明还提供了扩增上述分子标记的引物，为SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物，用于扩增分子标记PM-01；或者，为SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，用于扩增分子标记PM-02。
本发明还提供了上述分子标记在抗白粉病南瓜育种中的应用。
本发明还提供了上述引物在抗白粉病南瓜育种中的应用。
本发明还提供了一种抗白粉病南瓜的育种方法，包括如下步骤：
1)以高抗白粉病南瓜品系‘X10’为母本，以易感白粉病南瓜品系为父本，进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交得到后代BC1F1，分别利用本发明所述的两个分子标记PM-01和PM-02扫描BC1F1群体，选择经标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，与易感亲本‘JIN234’进行回交得到后代BC2F1；
2)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC2F1群体，选择经分子标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，再与易感亲本‘JIN234’进行回交得到回交三代BC3F1；
3)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F1群体，选择经分子标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，自交得到后代BC3F2；
4)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F2群体，选择经标记PM-01扫描后具有313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有249nt核苷酸片段的植株，即为改良高抗自交系。
优选地，步骤1)所述易感白粉病南瓜品系父本为JIN234。
进一步地限定，所述分子标记PM-01扫描，是指利用SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用HindⅢ限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
进一步地限定，所述分子标记PM-02扫描，是指利用SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用SacI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
高抗白粉病亲本为‘X10’，高感白粉病亲本为‘JIN234’及生理小种2F，均记载在“南瓜白粉病病原菌及种质资源抗性鉴定”(屈淑平等，2018)，公众可通过东北农业大学获得。
有益效果
分子标记辅助选择育种可以利用与控制美洲南瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记对植株基因型进行直接选择，不受外界环境影响，提高了选择准确性及整个育种过程的效率，利于抗白粉病基因的快速准确定位，有效推动抗白粉病美洲南瓜育种进程。
本发明利用高抗白粉病美洲南瓜‘X10’和易感白粉病美洲南瓜‘JIN234’杂交的1500株F2分离群体，通过遗传规律分析确定美洲南瓜抗白粉病基因是由一个主效显性基因控制的。取F2群体每株嫩叶提取基因组DNA，结合BSA-seq法筛选与高抗白粉病基因紧密连锁的分子标记。最终提供两个与美洲抗白粉病病基因紧密连锁的标记，分别位于抗白粉病基因两侧，两标记遗传距离130Kb，且两个分子标记的开发有利于抗白粉病基因的最终克隆，便于美洲南瓜抗白粉病性状的分子标记辅助育种体系建立。
本发明利用与抗白粉病基因紧密连锁分子标记培育高抗病改良品种。利用回交转育的方法，高抗‘X10’作为非轮回亲本，易感‘JIN234’为轮回亲本，定向改良易感亲本‘JIN234’的白粉病抗性性状，最终在BC3F2群体中筛选出抗病位点纯合的高抗病改良品系。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用与育种实践中。
附图说明
图1CAPS标记PM-01和PM-02与控制美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁示意图，其中每个叉号表示一个单交换事件；
图2CAPS标记PM-01的F2群体PCR产物酶切条带，其中，M代表Marker 600，条带大小由上到下依次为600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp。P1代表高抗病亲本‘X10’，P2代表易感亲本‘JIN234’，F1代表杂交第一代，F2抗病群体和F2感病群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株高抗和10株高感植株；
图3CAPS标记PM-02的F2群体PCR产物酶切条带，其中，M代表Marker 1，条带大小由上到下依次为700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp。P1代表高抗病亲本‘X10’，P2代表易感亲本‘JIN234’，F1代表杂交第一代，F2抗病群体和F2感病群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株高抗和10株高感植株。
具体实施方式
实施例1.与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记的获得。
一、F2分离群体的构建和抗病鉴定标准
构建F2群体所用的高抗白粉病亲本为‘X10’，高感白粉病亲本为‘JIN234’。本实施利用该两亲本配制F1代，F1代自交产生F2代群体。收集白粉菌生理小种2F的分生孢子配置成2.5×105-5.0×105个·mL-1的孢子悬浮液，喷雾法对F2群体进行叶片接菌并观察感病表型。鉴定标准：0级为叶片干净，无病斑；1级为仅有1-2片病叶，病叶有极少量病斑；3级为整株有2-3片病叶，病叶上有少量病斑，白粉较为明显；5级为病斑面积约占叶面积1/3，白粉层明显，开始出现连片现象，病叶数约占叶片总数1/3，茎秆无病斑；7级为白粉层较厚、连片，病叶数占叶片总数2/3；9级白粉层覆盖全部叶片，几乎全株叶片均有白粉层。通过F2群体抗感白粉病表型鉴定，进行遗传规律分析，卡方分析法进行验证，得出抗美洲南瓜白粉病性状是由一个主效显性基因控制，并将控制抗白粉病基因命名为CpPM10.1。
二、美洲南瓜基因组DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体叶片的基因组总DNA。采用的植株基因组DNA提取方法为CTAB法，取0.2g植株幼嫩叶片于-80℃冷冻保存，通过磨样机研磨。研磨充分的样品加入1ml的CTAB溶液(CTAB提前配置完成，加入β-巯基乙醇并于65℃水浴锅中预热。)，将样品在65℃恒温水浴锅中水浴1h，水浴过程中每间隔10min颠倒混匀样品。水浴结束后，12000rpm离心10min。提取上清液800μl，等体积加入24:1氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀。12000rpm离心15min。取上清600μl，加入24:1氯仿/异戊醇600μl，轻轻混匀。12000rpm离心15min。取上清400μl于灭菌的1.5ml离心管中，加入提前预冷的异丙醇400μl，混匀充分后于－20℃冰箱中，沉淀1h。12000rpm离心15min，弃上清液。取200μl的70％乙醇溶液清洗DNA沉淀两次，放在通风橱中晾干DNA。加入50μl超纯水，加入2μl去RNA酶37℃恒温水浴1h，4℃过夜溶解DNA。利用琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测，紫外分光光度计对DNA的浓度进行检测。
三、分子标记的获得
利用群体分离分析法(BSA)随机选取步骤二F2分离群体中感病等级为0或1的高抗个体和感病等级为4或5的易感个体各30株，DNA等量等体积混合建立高抗和易感基因池，并与高抗和易感亲本送至百迈克有限公司进行南瓜全基因组重测序(BSA-seq)。将测序获得的SNP标记感病等级表型性状进行关联分析，将控制美洲南瓜抗病基因CpPM10.1定位到第十染色体上。
分析美洲南瓜基因组重测序得到的SNP结果并设计CAPS标记引物，以高抗、易感亲本和F1DNA为模板分别以SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物(扩增分子标记PM-01)；SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物(扩增分子标记PM-02)进行PCR扩增和酶切，上述引物由华大基因合成。PCR扩增和限制性内切酶体系和程序如下：
PCR体系总反应体系为20μL：10×Buffer 2μL，dNTP 2μL，DNA模板1.2μL，上下引物各0.8μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 13μL。
PCR程序：94℃7min；94℃20s，56℃20s，每个循环降温0.5℃，72℃1min，35个循环；94℃20s，45℃20s，72℃7min，降温至4℃。
将上述PCR产物取5μL，加入3.8μL ddH2O，10×Buffer 1μL 0.2μL限制性内切酶，其中由分子标记PM-01扩增获得的产物使用HindⅢ限制性核酸内切酶进行酶切，由分子标记PM-02扩增获得的产物使用SacI限制性核酸内切酶进行酶切。反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h。酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。分子标记PM-01和PM-02在高抗、易感亲本和F1之间有多态性且条带清晰的标记。
四、CAPS标记扫描F2分离群体
利用本发明开发的两个分子标记扫描上述1500株F2分离群体，寻找基因型与表现型有差别的单株，获得标记与抗白粉病基因CpPM10.1的交换单株。
PCR程序和限制性内切酶体系同本实施例中步骤三所述。酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。分子标记PM-01扫描结果，高抗植株呈现出313nt核苷酸片段，或148nt、165nt和313nt核苷酸片段；易感植株呈现出148nt和165nt核苷酸片段(图2)。分子标记PM-02扫描结果，高抗植株呈现出249nt核苷酸片段，或90nt、159nt和249nt核苷酸片段，易感植株呈现出90nt和159nt核苷酸片段(图3)。
经过1500株F2分离群体鉴定，PM-01和标记PM-02可以较好的区分抗病性状植株和感病性状植株。PM-01、PM-02均与抗病基因紧密连锁，分别位于抗病基因CpPM10.1两侧(图1)，并与抗病基因CpPM10.1之间各存在12个和2个单交换事件，其中分子标记PM-01中SEQID NO.1所示的DNA片段不具HindⅢ酶切位点，与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.2所示的DNA片段具HindⅢ酶切位点，将313nt核苷酸酶切成165nt和148nt核苷酸片段，与感白粉病基因连锁；分子标记PM-02中SEQ ID NO.3所示的DNA片段不具SacI酶切位点,与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.4所示的DNA片段具SacI酶切位点，将249nt核苷酸酶切成90nt和159nt核苷酸片段，与易感白粉病基因连锁。
五、多态性片段测序
以高抗亲本‘X10’和易感亲本‘JIN234’的基因组DNA为模板进行扩增，PCR体系50μL，PCR反应条件同上。
PCR体系总反应体系为20μL：10×Buffer 2μL，dNTP 2μL，DNA模板1.2μL，上下引物各0.8μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 13μL。
PCR程序：94℃7min；94℃20s，56℃20s，每个循环降温0.5℃，72℃1min，35个循环；94℃20s，45℃20s，72℃7min，降温至4℃。
20μL产物中加入核酸染料4μL，室温静置10分钟使染料与DNA结合，1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，使用TRAN公司的Easy Pure@Quick Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化DNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书。将纯化片段送由华大基因有限公司测序，测序结果通过Chromas 2.3软件分析。
以高抗亲本‘X10’为模板利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为313nt，扩增序列见SEQ ID NO.1，不包含限制性内切酶HindⅢ酶切位点。以易感亲本‘JIN234’为模板利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为313nt，扩增序列见SEQ ID NO.2，包含限制性内切酶HindⅢ酶切位点。以高抗亲本‘X10’为模板利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为249nt，扩增序列见SEQ ID NO.3，不包含限制性内切酶SacI酶切位点。以易感亲本‘JIN234’为模板利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ IDNO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为249nt，扩增序列见SEQ ID NO.4，包含限制性内切酶SacI酶切位点。
实施例2.高抗白粉病南瓜的育种方法。
本实施例利用回交转育的方法，高抗‘X10’作为非轮回亲本，易感‘JIN234’为轮回亲本，定向改良易感亲本‘JIN234’的白粉病抗性性状，具体操作步骤如下：
一、以高抗白粉病南瓜品系‘X10’为母本，以易感白粉病南瓜品系‘JIN234’为父本，杂交所得F1与易感亲本‘JIN234’进行回交得到后代BC1F1，分别利用本发明的两个分子标记PM-01和PM-02扫描BC1F1群体，所述扫描过程中使用的PCR反应体系、PCR反应条件和酶切体系同实施例1中步骤三所述。选择经标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，与易感亲本‘JIN234’进行回交得到后代BC2F1。
二、分别利用本发明的分子标记PM-01和PM-02扫描BC2F1群体，继续选择经标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，再与易感亲本‘JIN234’进行回交得到回交三代BC3F1。
三、分别利用本发明的分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F1群体，继续选择经分子标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，自交得到后代BC3F2。
四、分别利用本发明的分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F2，选择经分子标记PM-01扫描后具有313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有249nt核苷酸片段的植株，即为改良高抗自交系。
定植高抗自交系60天，取白粉病生理小种2F喷雾法对自交系进行叶片接菌并观察感病表型。接菌后20天改良自交系感病等级为1，表明改良后的自交系具有较高抗白粉病生理小种2F性状，并且其他农艺性状与亲本‘JIN234’相似。说明利用本发明的分子标记PM-01和PM-02可对白粉病抗性性状进行快速准确的改良。
核苷酸序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 313
<212> DNA
<213> 分子标记PM-01
<400> 1
cctctcttgc atccgttgat gaatcaaatt cttgaaagtt ccggtataat taaaaaccaa 60
tttcttaatt caagaatatt ttttattatt aacttcaatt atgatattta tacggaatat 120
tttattttaa tccataattt aaagaaaaaa caaattttaa tttgaagctc gaagaactga 180
atggaatcca agacataggt tcaagacaag aagaaggatc cttcttgttt cacctcactg 240
ttgccaataa aatagtttca tttcagtggg tttttttttt ttttttttgt ctttcttttc 300
tttctctgtc cct 313
<210> 2
<211> 313
<212> DNA
<213> 分子标记PM-01
<400> 2
cctctcttgc atccgttgat gaatcaaatt cttgaaagtt ccggtataat taaaaaccaa 60
tttcttaatt caagaatatt ttttattatt aacttcaatt atgatattta tacggaatat 120
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atggaatcca agacataggt tcaagacaag aagaaggatc cttcttgttt cacctcactg 240
ttgccaataa aatagtttca tttcagtggg tttttttttt ttttttttgt ctttcttttc 300
tttctctgtc cct 313
<210> 3
<211> 249
<212> DNA
<213> 分子标记PM-02
<400> 3
ctgttcactc gctcttcgtc ctgaggcaac gaaagcaacg cttggcgctc aactccgggg 60
attacttccg gctcgacctg aaaatgggct ctactactag gcttattttc ttggttttga 120
gcgaggggct gctcgattct gatctcttgg atttctttgg agacgattgg aattgtgggt 180
ttgtgagaaa tgttcttgcg agagcgttta gaggcgatcc aaagagaaat aagaaacaga 240
aagagcaca 249
<210> 4
<211> 249
<212> DNA
<213> 分子标记PM-02
<400> 4
ctgttcactc gctcttcgtc ctgaggcaac gaaagcaacg cttggcgctc aactccgggg 60
attacttccg gctcgacctg aaaatgagct ctactactag gcttattttc ttggttttga 120
gcgaggggct gctcgattct gatctcttgg atttctttgg agacgattgg aattgtgggt 180
ttgtgagaaa tgttcttgcg agagcgttta gaggcgatcc aaagagaaat aagaaacaga 240
aagagcaca 249
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 分子标记PM-01上游引物
<400> 5
cctctcttgc atccgttgat 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 分子标记PM-01下游引物
<400> 6
gtctttcttt tctttctctg tccct 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 分子标记PM-02上游引物
<400> 7
ctgttcactc gctcttcgtc 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 分子标记PM-02下游引物
<400> 8
tgtgctcttt ctgtttctta tttc 24

Claims (10)

1.一种与美洲南瓜抗白粉病生理小种2F基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为PM-01或PM-02；所述分子标记PM-01由SEQ ID NO.1所示的313nt核苷酸片段和SEQ ID NO.2所示的313nt核苷酸片段组成；所述分子标记PM-02由SEQ ID NO.3所示的249nt核苷酸片段和SEQ ID NO.4所示的249nt核苷酸片段组成。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记PM-01中SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段与易感白粉病基因连锁。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记PM-02中SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段与抗白粉病基因连锁，SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段与易感白粉病基因连锁。
4.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物，其特征在于，为SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，用于扩增分子标记PM-01；或者，为SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，用于扩增分子标记PM-02。
5.权利要求1-3任意一项所述的分子标记在抗白粉病南瓜育种中的应用。
6.权利要求4所述的引物在抗白粉病南瓜育种中的应用。
7.一种抗白粉病南瓜的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以高抗白粉病南瓜品系X10为母本，以易感白粉病南瓜品系为父本，进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交得到后代BC1F1，分别利用权利要求1所述的两个分子标记PM-01和PM-02扫描BC1F1群体，选择经标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，与易感亲本‘JIN234’进行回交得到后代BC2F1；
2)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC2F1群体，选择经分子标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，再与易感亲本‘JIN234’进行回交得到回交三代BC3F1；
3)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F1群体，选择经分子标记PM-01扫描后具有148nt、165nt和313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有90nt、159nt和249nt核苷酸片段的植株，自交得到后代BC3F2；
4)分别利用分子标记PM-01和PM-02扫描BC3F2群体，选择经标记PM-01扫描后具有313nt核苷酸片段且经分子标记PM-02扫描后具有249nt核苷酸片段的植株，即为改良高抗自交系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述易感白粉病南瓜品系父本为JIN234。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分子标记PM-01扫描，是指利用SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.6所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用HindⅢ限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分子标记PM-02扫描，是指利用SEQID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用SacI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
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