CN106916897A

CN106916897A - 一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用

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Publication number: CN106916897A
Application number: CN201710292107.1A
Authority: CN
Inventors: 屈淑平; 王云莉; 闫春冬; 王洋洋; 徐文龙
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2037-04-28
Also published as: CN106916897B

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用，属于分子育种技术领域。用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3‑F和Yinhui3‑R，Yinhui3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Yinhui3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；通过引物对能够同时特异性扩增出91bp序列和85bp序列的杂交F₁单株则为真杂交种，缺少上述任意一条的杂交F₁单株则为假杂交种。本发明还提供了一种南瓜杂交种子纯度的鉴定方法。本发明开发的SSR分子标记及引物具有较高稳定性，可以简便、快速地应用于印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记辅助育种筛选。

Description

一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用，属于分子育种技术领域。

背景技术

南瓜(2n＝2x＝40)(Cucurbita spp)属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita spp.)，一年生蔓生草本植物，是重要的世界性蔬菜。南瓜用途多样，具有很高的营养和药用价值，深受广大消费者喜爱。近年来，育种家根据广大消费者的需要，培育出多个南瓜新品种，本发明人所在南瓜育种实验室培育的印度南瓜‘银辉三号’杂交种产量高、籽粒洁白，具有出籽率高、抗病害的特点，在生产中深受种植者喜爱。

‘银辉三号’为母本‘088’和父本‘9-6’杂交一代南瓜品种，制种时需摘除母本所有雄花花蕾，取父本花粉人工授粉到母本雌花花柱。授粉期间母本雄花摘除不及时不彻底,其花粉可能落到母本雌花柱头上产生自交种子,从而出现假杂种。‘银辉三号’种子不纯会严重影响南瓜的产量和品质，造成经济损失，因此，需在销售前做种子纯度鉴定,符合国家对杂交种子的纯度要求方可出售。常用的种子纯度鉴定可分为以下三种方法：

1)形态标记鉴定

我国南瓜一代杂交种遗传纯度鉴定早期多采用传统的形态特征特性鉴定，即植株长到一定时期后，观察杂交种的各种性状并与标准株相比较分析其相似性，从而鉴定杂交种的纯度。但该方法需要进行田间种植，费时费力，鉴定结果还会受到外界环境影响，因此鉴定效率低、准确性差。

2)同工酶鉴定

Schwartz等(1960)最早用同工酶方法检测杂交种子纯度和预测杂种优势，随后同工酶方法已成功地用于葫芦科作物杂种纯度的鉴定工作(黄永红等，1994；陈清华等，1998；马国斌等，1999；刘永庆等，2005)。同工酶分析技术虽然手段较为简单，适合杂种大群体鉴别，但具有组织器官及发育的特异性，且使用的同工酶和特异蛋白质数量有限，可标记的位点较少，因而应用受到限制。

3)分子标记鉴定

分子标记鉴定以DNA多态性为基础的遗传标记，可稳定遗传，分子标记可开发数量几乎是无限的，且检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种和杂种纯度鉴定等方面。常用于葫芦科作物种子纯度检测的几种分子标记为：基于分子杂交检测的RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism，限制性片段长度多态性)；基于PCR的RAPD(Random AmplifiedPolymorphism of DNA，随机扩增多态性)，SSR(Length Polymorphism of SimpleSequence Repeat，简单序列重复多态性)，AFLP(Amplified Fragment LengthPolymorphism，扩增片段长度多态性)。大量种子纯度检测实践中发现：RFLP检测存在周期长，成本高，需用到放射性元素等问题，因此在品种纯度鉴定应用上受到一定的影响；RAPD技术对反应条件十分敏感，须使RAPD反应标准化、程序化，须建立每种作物品种种子纯度的不同RAPD检测技术操作规程；AFLP技术试剂盒价格昂贵，检测成本高，操作过程较为复杂，并且对DNA提取纯度和内切酶质量要求严格，技术较难掌握，其应用受到一定的限制；SSR扩增重复性好，结果稳定可靠，操作简单，用时较短，仅需要微量组织亦能有效分析鉴别。

近年来印度南瓜‘银辉三号’以其优良品质和高产性状广受种植者好评，推广面积日益扩大，种子需求量随之增大。为了防止人工制种过程出现假杂种，急需成熟的种子纯度鉴定方法。现有技术中仍未建立对印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度鉴定方法，尽快建立一套稳定可靠、简单快速的印度南瓜‘银辉三号’种子纯度检验方法成为当务之急。

发明内容

印度南瓜‘银辉三号’杂交优势明显，为解决印度南瓜‘银辉三号’这个杂交品种在做杂交种子的时候出现母本自交的现象，进而形成假杂种，种子不纯严重影响南瓜的产量和品质，从而造成经济损失，需在销售前做种子纯度鉴定。本发明提供了一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其引物，无需等待南瓜单株成长至果实成熟期再观察形态特征，在幼苗期即可提取DNA，根据扩增片段区分真假杂种，有效鉴定杂种纯度，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的SSR分子标记Yinhui3，用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3-F和Yinhui3-R，其中上游引物Yinhui3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物Yinhui3-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；通过所述引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R能够同时特异性扩增出SEQ ID NO.1所示的91bp核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的85bp核苷酸序列的杂交F₁单株则为真杂交种，缺少SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中任意一条核苷酸序列的杂交F₁单株则为假杂交种。

本发明还提供了一种所述SSR分子标记Yinhui3及其引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选、南瓜分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的鉴定方法，包括如下步骤：

1)提取母本‘088’、父本‘9-6’和‘银辉三号’的单株幼苗基因组DNA；

2)分别以步骤1)所得母本‘088’、父本‘9-6’和‘银辉三号’的南瓜基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的上游引物Yinhui3-F和下游引物Yinhui3-R进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

3)对步骤2)所得的PCR产物进行凝胶电泳；

4)对电泳结果进行分析，同时具有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的长度为91bp条带和SEQ ID NO.2所示的长度为85bp条带的杂交F₁单株为真杂交种，缺少上述任意一条条带的杂交F₁单株为假杂种。

优选地，所述PCR扩增反应的扩增程序为：94℃5分钟；94℃45秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。

优选地，每10μL所述PCR扩增反应的体系中包括1×Taq Buffer，1.5mmol/LMgCl₂，200μmol/L dNTPs，引物各0.2μmol/L，30ng模板DNA，0.5U Taq DNA Polymerase。

本发明所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列包括91个核苷酸，该片段为父本‘9-6’的SSR引物扩增片段(91bp)，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列包括85个核苷酸，该片段为母本‘088’的SSR引物扩增片段(85bp)。

本发明所述凝胶电泳为8％非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳。

本发明‘银辉三号’为母本‘088’和父本‘9-6’杂交一代南瓜品种，本发明所述的杂交F₁单株均指‘银辉三号’的单株。

本发明有益效果：

1、银辉3号杂交优势明显，但是在做杂交种子的时候可能会因为人工授粉等原因，母本自交的现象出现假杂种，种子不纯严重影响南瓜的产量和品质，从而造成经济损失，需在销售前做种子纯度鉴定。为了区分真假杂种，鉴定杂种纯度，本申请开发了一种可以用于鉴定南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及引物，该分子标记和引物能够有效鉴定杂种纯度，快速区分真假杂种，具有较高稳定性，可以简便、快速地应用于南瓜纯度的分子标记辅助育种筛选。

2、本发明还提供了一种快速简便鉴定南瓜杂交种子纯度的方法，本发明的方法可精确区分南瓜杂交种子与其父母本种子，快速检测出杂交种子的纯度，无需等待南瓜单株成长至果实成熟期观察形态特征，在幼苗期即可提取DNA，根据扩增片段有效区分真假杂种，鉴定杂种纯度。本方法具有快速、准确、低成本、易操作、可重复等优点,能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法,具有较高的商业应用价值。

3、利用本发明方法鉴定南瓜杂交种子纯度特异性好、准确度高，准确率高达100％。利用本发明分子标记及引物，对东北农业大学向阳实验基地和黑龙江省牡丹江林口县生产基地南瓜‘银辉三号’杂交种子随机抽样进行纯度鉴定，种子纯度为100％，与田间种子纯度调查结果一致，准确率为100％。通过本发明提供的Yinhui3分子标记及引物，按照本发明提供的鉴定方法可在幼苗期快速、准确检测出‘银辉三号’杂交种子与其父母本种子，本发明开发的分子标记可应用于印度南瓜‘银辉三号’杂交种子大田生产和制种生产实践中。

附图说明

图1为父母本和杂交F₁PCR产物多态性电泳图谱(M，DL2000分子量标准；P₁，父本‘9-6’；P₂，母本‘088’；F₁，‘银辉三号’；P₁显示条带为SEQ ID NO.1；P₂显示条带为SEQ IDNO.2)。

图2为父母本和‘银辉三号’东北农业大学向阳实验基地抽样电泳图谱(M，DL2000分子量标准；P₁，父本‘9-6’；P₂，母本‘088’；其余条带为部分抽样‘银辉三号’：抽样100粒‘银辉三号’的部分样本；P₁显示条带为SEQ ID NO.1；P₂显示条带为SEQ ID NO.2)。

图3为‘银辉三号’黑龙江省牡丹江林口县生产基地抽样电泳图谱(M，DL2000分子量标准；其余条带为部分抽样‘银辉三号’：抽样‘银辉三号’样本的显示条带与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列相同)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例一

1.南瓜基因组DNA的提取

种植亲本和杂交F₁到真叶展开，用CTAB法提取叶片的基因组总DNA。取刚刚展开的一片真叶至1.5mL离心管中并加入液氮，研磨组织成粉末状，加入700μL CTAB裂解缓冲液，剧烈振荡30秒，60℃水浴30分钟，期间上下颠倒充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入700μL氯仿异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，13000r/min 4℃离心15分钟。吸取上清液400μL至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于－20℃静置30分钟，12000r/min 4℃离心10分钟。弃上清，沿离心管壁加入200μL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000r/min 4℃离心1分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀30分钟，加入100μL RNA酶TE缓冲液(7:993，v/v)溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用ddH₂O稀释终浓度为30ng/μL，于－20℃备用。

2.筛选特异性分子标记

根据南瓜SSR引物，以父本‘9-6’和母本‘088’全基因组DNA为模板，在亲本间筛选有多态性的引物，最终确定亲本间共显性差异标记，命名Yinhui3，序列如下：

Yinhui3-F：5'-CCCAAATTCAAAAGAAAATC-3'(SEQ ID NO.3)

Yinhui3-R：5'-CCAGTTAAATCAGACCGAAT-3'(SEQ ID NO.4)

该标记带型清晰、重复性好。引物Yinhui3可扩增出91个核苷酸父本‘9-6’的特异性片段扩增片段，和85个核苷酸母本‘088’特异性片段(见图1)。

3.克隆条带序列

以父本‘9-6’、母本‘088’和‘银辉三号’的基因组DNA为模板，做50μL PCR体系，PCR反应条件同上。50μL产物中加入BioTeke SYBR Green I核酸染料7μL，室温静置10分钟使染料与DNA结合，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，胶回收后连接T3载体，转化农感菌感受态，在蓝白板筛选培养基上培养过夜，4℃显色处理。挑取在蓝白板筛选培养基上显色白斑的菌落送由华大基因有限公司测序，测序结果通过Chromas 2.3软件分析。

实验结果：父本‘9-6’扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示，母本‘088’扩增产物序列如SEQ ID NO.2所示，‘银辉三号’扩增的91个和85个核苷酸产物分别与父本、母本扩增产物序列相符。

4.东北农业大学向阳实验基地‘银辉三号’杂种鉴定

1)于东北农业大学的向阳实验基地随机抽样100粒‘银辉三号’种子，种植到真叶展开后分别提取全基因组DNA。

2)以基因组DNA为模板，利用Yinhui3分子标记扫描抽样‘银辉三号’群体。PCR体系：1×Taq Buffer，1.5mmol/LMgCl₂，200μmol/L dNTPs，引物各0.2μmol/L，30ng模板DNA，0.5U Taq DNA Polymerase，总反应体系为10μL。PCR程序：94℃5分钟；94℃45秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。10μL的PCR产物中加入1.5μL的6×loading buffer，混合均匀后于8％的聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳，后银染染色，白光台上分析条带带型。

3)检测结果：全部为真杂种，种子纯度为100％，与田间种子纯度调查结果一致，准确率为100％，抽样100粒‘银辉三号’种子的部分样本电泳图谱如图2所示。

5、黑龙江省牡丹江林口县生产基地‘银辉三号’杂种鉴定

1)于黑龙江省牡丹江林口县生产基地随机抽样100粒‘银辉三号’种子，种植到真叶展开后分别提取全基因组DNA。

2)以基因组DNA为模板，利用Yinhui3分子标记扫描抽样‘银辉三号’群体，反应体系和程序与上述步骤2相同。

3)检测结果：全部为真杂种，种子纯度为100％，与田间种子纯度调查结果一致，准确率为100％，抽样100粒‘银辉三号’种子的部分样本电泳图谱如图3所示。

综上，经过随机抽样‘银辉三号’群体验证，Yinhui3分子标记和方法可快速、准确检测出‘银辉三号’杂交种子与其父母本种子，可运用于制种生产实践中。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种用于鉴定印度南瓜'银辉三号'杂交种子纯度的分子标记及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 91

<212> DNA

<213> 父本'9-6' 的SSR引物扩增片段

<400> 1

cccaaattca aaagaaaatc tagggttcga gagagagaga aattgggggc aattcggtct 60

gatttaactg gattcggtct gatttaactg g 91

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 母本'088' 的SSR引物扩增片段

<400> 2

cccaaattca aaagaaaatc tagggttcga gagagagaga gagagagaga gagaaattgg 60

gggcaattcg gtctgattta actgg 85

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Yinhui3-F

<400> 3

cccaaattca aaagaaaatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Yinhui3-R

<400> 4

ccagttaaat cagaccgaat 20

Claims

1.一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的SSR分子标记Yinhui3，其特征在于，用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3-F和Yinhui3-R，其中上游引物Yinhui3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物Yinhui3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；通过所述引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R能够同时特异性扩增出SEQ ID NO.1所示的91bp核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的85bp核苷酸序列的杂交F₁单株则为真杂交种，缺少SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2中任意一条核苷酸序列的杂交F₁单株则为假杂交种。

2.权利要求1所述SSR分子标记Yinhui3及其引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选、南瓜分子标记辅助育种中的应用。

3.一种印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)对步骤2)所得的PCR产物进行凝胶电泳；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的扩增程序为：94℃5分钟；94℃45秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每10μL所述PCR扩增反应的体系中包括1×Taq Buffer，1.5mmol/LMgCl₂，200μmol/L dNTPs，引物各0.2μmol/L，30ng模板DNA，0.5UTaq DNA Polymerase。