CN108330201A - 鉴定番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了鉴定番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用，包括用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的KASP引物和试剂盒，鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因的方法、以及区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄的方法。本申请所提供的分子标记可对番茄植株在苗期大通量地进行快速、准确的抗病性鉴定，从而提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。

Description

鉴定番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用
技术领域
本申请属于分子生物学领域，具体涉及番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用。
背景技术
番茄是一种在全世界栽培极为广泛的蔬菜，也是我国的主要栽培蔬菜之一。然而在番茄生产过程中，病毒病日益严重，导致产量和品质下降，因此选育抗病品种就显得十分重要。
番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)是番茄病毒病中发生最普遍的一种病原菌，是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员，属于正链RNA病毒的一种,主要通过田间操作(病毒沾染在手上或工具上)传播，或借助蚜虫吸取汁液传播,它既可以引起番茄叶片出现花叶或条斑,又可引起果实内部坏死,可致使番茄减产达65％。采用化学农药防治不仅效果差，而且易造成后期收获果实中农药残留超标，更严重的甚至污染生态环境，因此培育和推广抗番茄花叶病毒的番茄品种是最有效的方法。
当前已鉴定到三个抗番茄花叶病毒病抗病基因，分别是Tm-1、Tm-2和Tm-22，其中Tm-1位于第2号染色体上，抗番茄花叶病毒生理小种0和2，Tm-2和Tm-22位于地9号染色体上，二者是等位基因，Tm-2抗番茄花叶病毒生理小种0和1，Tm-22抗番茄花叶病毒生理小种0、1和2，Tm-22的抗谱最广。
目前在Tm-22的标记开发方面，目前已有一些可用的标记，如Tetra-primer ARMSPCR(四引物扩增受阻突变体系Ye.et al，2001)标记和CAPS标记(Lanfermeijer et al,2005)，前者需要设计内外两对引物进行PCR扩增，对PCR扩增条件要求极高，需要不断尝试和摸索适合的实验体系，后者需要对PCR产物进行酶切，操作复杂实验成本高，且易出现人为错误，这两种标记在使用的过程中自动化程度差，不适用于高通量、大规模操作。
发明内容
一方面，本申请提供了用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的KASP引物，其包含：正向引物1：5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和正向引物2：5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，其中所述正向引物1和正向引物2分别连接有不同的标签序列。
在一实施方案中，所述标签序列选自以下序列：标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
在一实施方案中，本申请所提供的KASP引物，包含：正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’。
在另一实施方案中，本申请所提供的KASP引物，包含：正向引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3。
在另一实施方案中，本申请所提供的KASP引物还包含选自以下任一种的反向引物：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’；5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’；和5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’。
本申请还提供了用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含本申请所提供的任一种KASP引物。
在一实施方案中，所述试剂盒还包含：i)选自以下的两种标签序列：标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，并且所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接；和ii)所述两种标签序列的互补序列，其分别与相同的淬灭基团相连接。在另一实施方案中，所述荧光基团分别为FAM荧光基团和HEX荧光基团，所述淬灭基团为BHQ淬灭基团。
在又一实施方案中，所述试剂盒还包含：扩增缓冲液、内参染料、dNTPs混合物、DNA聚合酶、MgCl2以及ddH2O。
此外，本申请提供了KASP引物或者试剂盒的以下用途：i)鉴定番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；ii)鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；iii)区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄，例如在Tm-2或Tm-22位点，区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄；iv)区分纯合的抗番茄花叶病毒番茄和杂合的抗番茄花叶病毒番茄，例如在Tm-2或Tm-22位点，区分纯合的抗番茄花叶病毒番茄和杂合的抗番茄花叶病毒番茄；v)番茄育种；或者vi)番茄花叶病毒病防控。
进一步地，本申请还提供了鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因的方法，其包括：利用本申请的KASP引物或者试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并检测和分析扩增产物。
此外，本申请还提供了区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄的方法，其包括：利用本申请的KASP引物或者试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并检测和分析扩增产物。
利用本申请提供的分子标记，可对番茄植株在苗期进行快速、准确的抗病性鉴定，大大降低苗期人工接种的工作量，其应用可提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。该标记可应用于番茄种质资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。
附图说明
图1为KTm2S01标记的QuantStudioTM12K Flex Software分型结果。
图2为KTm2S02标记的QuantStudioTM12K Flex Software分型结果。
图3为KTm2S03标记的QuantStudioTM12K Flex Software分型结果。
图4为KTm2S02-2标记的QuantStudioTM12K Flex Software分型结果。
图5为KTm2S02-3标记的QuantStudioTM12K Flex Software分型结果。
以上各图中，横坐标和纵坐标数值均表示信号值；I处黑色圆点为感病材料moneymaker的扩增信号；II处浅灰色圆点为F2分离群体中杂合单株材料的扩增信号；III处深灰色圆点为抗病材料LA1791的扩增信号；靠近原点处的方块表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号；“X”表示无法判断的结果。
图6为人工诱发番茄花叶病毒病植株的表现型照片。
其中，左图为感病植株，叶片出现条斑，如图中黑色箭头所示；右图为抗病植株，叶片正常生长。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
单核苷酸多态性(SNP)标记技术，属于新一代标记技术，是个体间最常见的遗传变异形式，常出现的单核苷酸多态性有碱基的替换、碱基的插入和缺失，是植物复杂性状遗传研究的理想分子标记。
KASP(竞争性等位基因特异性PCR，Kompetitive Allele Specific PCR)是近几年发展起来的一项基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDel的新技术。该技术是由英国LGC公司发布，可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs和特定位点上的InDels进行非常准确的双等位基因评分，该实验方法具有高度的稳定性和准确性，同时支持个体重复实验和高通量研究。
KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR反应孔中，进行PCR扩增，最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。
本申请基于KASP技术，提供了可用于高通量鉴定番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22的KASP引物，包括特异性扩增引物和通用引物，结合应用条件严格的Touchdown PCR方法，建立了应用LGC高通量标记检测平台鉴定番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22的方法。
具体地，本申请人基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的tm-2(不抗病的等位基因)、Tm-2和Tm-22(抗病的等位基因)三个等位基因的序列，利用Sequencher5.1软件比对三者的序列，经分析发现tm-2与Tm-2和Tm-22有多处SNP位点。
本申请人根据可用于KASP标记开发的SNP位点需满足的要求(基因型在Tm-2和Tm-22中相同，与tm-2不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域)，经过大量实验针对第1043位(C/T)SNP位点筛选确定出特异性引物(正向引物)和通用引物(反向引物)。
在具体实施方案中，本申请所提供的正向引物包含5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，二者的最后一位碱基即为对应的SNP位点，并且在正向引物的5’端分别接有不同的标签序列(通用接头序列)，如标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
例如，本申请所提供的正向引物为KTm2S02-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’；或者正向引物为KTm2S02-F1’：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2’：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’。其中，下划线所示序列为添加的标签序列。
在具体实施方案中，本申请所提供的反向引物在满足产物要求(50-80bp)的前提下，序列可变。例如，本申请所提供的反向引物为KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’，KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，或者KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’。
可以将本申请所提供的引物制备成试剂盒以便于使用。因此，本申请还提供了用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含本申请所提供的KASP引物。
在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1和KTm2S02-F2，以及反向引物KTm2S02-R。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1和KTm2S02-F2，以及反向引物KTm2S02-R2。在又一实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1和KTm2S02-F2，以及反向引物KTm2S02-R3。
此外，在其他具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1’和KTm2S02-F2’，以及反向引物KTm2S02-R。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1’和KTm2S02-F2’，以及反向引物KTm2S02-R2。在又一实施方案中，本申请所提供的试剂盒包含正向引物KTm2S02-F1’和KTm2S02-F2’，以及反向引物KTm2S02-R3。
进一步地，在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒还包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其中，荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同，为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列与标签序列B相同，为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列与标签序列A的序列互补，为5’-CTTCCACTGGTTCAAGTACGA-3’，在其3’末端连接淬灭基团BHA；淬灭探针B的序列与标签序列B互补，为5’-CTTCCAGCCTCAGTTGCCTAA-3’在其3’末端连接淬灭基团BHA。
例如，上述的荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B可来自LGC公司的KASP V4.0 Master mix(low ROX)试剂盒。
在又一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒还包含用于进行PCR扩增的其他试剂，例如扩增缓冲液、内参染料、dNTPs混合物、DNA聚合酶、MgCl2和ddH2O等。
本申请所提供的可准确稳定地鉴定番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22的KASP引物或包含该KASP引物的试剂盒，可用于鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因，并且作为共显性标记进一步区分纯合的抗番茄花叶病毒番茄和杂合的抗番茄花叶病毒番茄，从而进行番茄育种以及番茄花叶病毒病防控等。
在一实施方案中，本申请提供了鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因的方法，其包括利用本申请提供的KASP引物或者试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并检测和分析扩增产物。
在具体实施方案中，当KASP引物包含：正向引物，例如KTm2S02-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，以及选自以下任一种的反向引物：KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’，KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，和KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’时，若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的番茄样品不含番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；若仅检测到HEX荧光或者同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的番茄样品含有番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22。
在具体实施方案中，当KASP引物包含：正向引物，例如KTm2S02-F1’：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2’：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，以及选自以下任一种的反向引物：KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’，KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，和KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’时，若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的番茄样品不含番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；若仅检测到FAM荧光或者同时检测到FAM荧光和HEX荧光，则待鉴定的番茄样品含有番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22。
在具体实施方案中，所述番茄样品选自叶片、种子和果实中的任一种。
在另一具体实施方案中，本申请提供了区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄的方法，其包括利用本申请提供的KASP引物或者试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并分析扩增产物。
在具体实施方案中，当KASP引物包含：正向引物，例如KTm2S02-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，以及选自以下任一种的反向引物：KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’，KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，和KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’时，若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的番茄样品为感番茄花叶病毒番茄；若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的番茄样品为纯合的抗番茄花叶病毒番茄；或者，若同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的番茄样品为杂合的抗番茄花叶病毒番茄。
在具体实施方案中，当KASP引物包含：正向引物，例如KTm2S02-F1’：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和KTm2S02-F2’：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，以及选自以下任一种的反向引物：KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’，KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，和KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’时，若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的番茄样品为感番茄花叶病毒番茄；若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的番茄样品为纯合的抗番茄花叶病毒番茄；或者，若同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的番茄样品为杂合的抗番茄花叶病毒番茄。
在具体实施方案中，所述番茄样品选自叶片、种子和果实中的任一种。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 KASP标记的开发
于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分别下载tm-2、Tm-2和Tm-22三个等位基因的序列，其登录号依次为AF536199、AF536200和AF536201。其中，tm-2是不抗病的等位基因，Tm-2和Tm-22是抗病的等位基因。
利用Sequencher5.1软件比对三者的序列，经分析发现tm-2与Tm-2和Tm-22有多处SNP位点。
可用于KASP标记开发的SNP位点需满足如下要求：基因型在Tm-2和Tm-22中相同，与tm-2不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域。
最终，选择第516位C/T、第1043位C/T和第837位C/T三个位点；上述三个位点中tm-2的基因型均为C，Tm-2和Tm-22的基因型均为T。
针对上述三个位点分别设计引物，其序列依次为，其中下划线所示序列为添加的标签序列：
第1043位C/T：
KTm2S01-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGTGAATATTGGTAGAAATATAGC-3’，
KTm2S01-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTGAATATTGGTAGAAATATAGT-3’，
KTm2S01-R：5’-TCTGTTCTTTCTCTTGCCCTTA-3’；
第516位C/T：
KTm2S02-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，
KTm2S02-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，
KTm2S02-R：5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’；
第837位C/T：
KTm2S03-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACTTGTCCTTCCTGAATGTGAC-3’，
KTm2S03-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACTTGTCCTTCCTGAATGTGAT-3’，
KTm2S03-R：5’-ACGTGATTATCATTCTACTGCCG-3’。
实施例2分子标记的扩增
本实施例中所使用的材料为已知的抗番茄花叶病毒病材料LA1791和感番茄花叶病毒病材料moneymaker(均来源于美国番茄遗传资源中心)。
使用CTAB法提取番茄叶片中的基因组DNA，提取所得DNA溶液浓度为10-50ng/μl，保存于-20℃。
使用KASP V4.0 Master mix(low ROX)试剂盒(LGC公司)配置PCR反应体系，反应总体积为5μl，包括：2xLGC Master mix，2.5μl；DNA提取液(10-50ng/μl)，1μl；引物KTm2-F1，0.06μl(10pmol/μl)；引物KTm2-F2，0.06μl(10pmol/μl)；引物KTm2S01-R或KTm2S02-R或KTm2S03-R，0.24μl(10pmol/μl)；以及ddH2O，1.14μl。设置三个技术重复。
PCR反应程序为：94℃15min；94℃20sec，61-55℃(每循环下降0.6℃)1min，10个循环；94℃20sec，55℃1min，31个循环；25℃10sec。
使用ABI QuantStudioTM12K Flex PCR仪对PCR产物进行基因分型，使用该仪器自带的QuantStudioTM12K Flex Software进行分析，其中设定FAM荧光信号靠近纵轴，HEX荧光信号靠近横轴。
KTm2S01、KTm2S02和KTm2S03标记分型结果依次见图1、图2和图3。在这些图中，横、纵坐标数值表示信号值；I处黑色圆点为感病材料moneymaker扩增信号(仅检测到FAM荧光信号)；III处深灰色圆点为抗病材料LA1791扩增信号(仅检测到HEX荧光信号)；靠近原点处的方块表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号；“X”表示无法判断的结果。两种基因型的扩增信号分别与原点的连线夹角越接近于直角说明分型效果越好。
结果表明，KTm2S01和KTm2S03无法将两种基因型区分，设计失败；而KTm2S02对LA1791的扩增信号按预期靠近横轴，对moneymaker的扩增信号按预期靠近纵轴，能很好的将两种基因型进行区分，设计成功。
对KTm2S02成功分型的第516位C/T位点，另设计两条通用反向引物，其序列为：
KTm2S02-R2：5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’，
KTm2S02-R3：5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’。
将上述反向引物分别与KTm2S02-F1和KTm2S02-F2进行组合，组合命名为KTm2S02-2和KTm2S02-3，用于分型。
KTm2S02-2和KTm2S02-3的分型结果依次见图4和图5。图中，横纵坐标数值表示信号值；I处黑色圆点为感病材料moneymaker的扩增信号(仅检测到FAM荧光信号)；III处深灰色圆点为抗病材料LA1791的扩增信号(仅检测到HEX荧光信号)；靠近原点处的方块表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
结果表明，KTm2S02-2、KTm2S02-3对LA1791的扩增信号按预期靠近横轴，对moneymaker的扩增信号按预期靠近纵轴，均能很好的将两种基因型进行区分，设计成功。
实施例3使用KTm2S02、KTm2S02-2及KTm2S02-3鉴定抗病番茄和感病番茄
以本申请人选育的高世代纯合抗病材料ZZ01为父本，感病材料moneymaker为母本，二者杂交制备F1，F1自交获得180株的F2分离群体。
对F2群体的植株进行接种病毒鉴定，在7-8片真叶期摩擦接种烟草花叶病毒(方中达，《植物病理研究方法》，中国农业出版社，2007)，两周后调查发病情况，统计F2群体的抗病与感病单株。病情调查分为6个等级：0级无任何症状；1级心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级花叶或茎上产生坏死斑点；5级重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎叶和叶脉系统坏死；9级植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡。0、1、3级判定为抗病，5、7、9级判定为感病。
结果显示，抗病单株136株，感病单株为44株；在统计学上，符合孟德尔遗传规律3：1的分离比例，说明表现型观察准确。图6为人工诱发番茄花叶病毒病表现型照片，其中左图为感病植株，叶片出现条斑，如图中黑色箭头所示；右图为抗病植株，叶片正常生长。
采用如实施例2所述的方式，分别提取180株材料的DNA样本，使用KTm2S02、KTm2S02-2及KTm2S02-3三组引物组分别进行PCR扩增，使用ABI QuantStudioTM12K FlexPCR仪对PCR产物进行基因分型，其中设定FAM荧光信号靠近纵轴，HEX荧光信号靠近横轴。
结果显示，三组引物检测结果相同，检测分型结果同图2中III的单株数为47(仅检测到HEX荧光信号，为纯合的抗病材料)、检测带型同图2中II的单株数为89(同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，为杂合的抗病材料)、检测带型同图2中I的单株数为44(仅检测到FAM荧光信号，为感病材料)。
在统计学上，上述结果符合孟德尔遗传规律1：2：1的分离比例，说明基因型检测准确；并且，前两者的表现型均为抗病，第三者的表现型均为感病，基因型与表现型结果相吻合。
上述结果表明，所设计的三组引物均能够准确的对抗病番茄和感病番茄进行鉴定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 中国种子集团有限公司
<120> 鉴定番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用
<130> 16C12754CN
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggtgaatat tggtagaaat atagc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggtgaatat tggtagaaat atagt 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctgttcttt ctcttgccct ta 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caatatgcta caagccaaat tactc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caatatgcta caagccaaat tactt 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgggcatgc caactatgga aacaac 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaacttgtcc ttcctgaatg tgac 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaacttgtcc ttcctgaatg tgat 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgtgattat cattctactg ccg 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caactatgga aacaactcca taatg 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaaacaactc cataatgcaa atc 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (10)

1.用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的KASP引物，其包含：
正向引物1：5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和
正向引物2：5’-CAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’，
其中所述正向引物1和正向引物2分别连接有不同的标签序列。
2.如权利要求1所述的KASP引物，其中所述标签序列选自以下序列：
标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和
标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
3.如权利要求1所述的KASP引物，其包含：
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3’；或者
正向引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC-3’，和
正向引物2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT-3。
4.如权利要求1或2所述的KASP引物，其还包含选自以下任一种的反向引物：
5’-CCGGGCATGCCAACTATGGAAACAAC-3’；
5’-CAACTATGGAAACAACTCCATAATG-3’；和
5’-GAAACAACTCCATAATGCAAATC-3’。
5.用于鉴定番茄花叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含权利要求1至4中任一项所述的KASP引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其还包含：i)选自以下的两种标签序列：标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，并且所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接；和ii)所述两种标签序列的互补序列，其分别与相同的淬灭基团相连接；
任选地，所述荧光基团分别为FAM荧光基团和HEX荧光基团，所述淬灭基团为BHQ淬灭基团。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其还包含：扩增缓冲液、内参染料、dNTPs混合物、DNA聚合酶、MgCl2以及ddH2O。
8.如权利要求1至4中任一项所述的KASP引物，或者权利要求5至7中任一项所述的试剂盒，其用于：
i)鉴定番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；
ii)鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因Tm-2或Tm-22；
iii)区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄；
iv)区分纯合的抗番茄花叶病毒番茄和杂合的抗番茄花叶病毒番茄；
v)番茄育种；或者
vi)番茄花叶病毒病防控。
9.鉴定番茄是否含有番茄花叶病毒抗性基因的方法，其包括：
利用权利要求1至4中任一项的KASP引物或权利要求5至7中任一项所述的试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并检测和分析扩增产物。
10.区分抗番茄花叶病毒番茄和感番茄花叶病毒番茄的方法，其包括：
利用权利要求1至4中任一项的KASP引物或权利要求5至7中任一项所述的试剂盒来扩增待鉴定的番茄样品，并检测和分析扩增产物。
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