CN104164483A

CN104164483A - 利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm22的方法

Info

Publication number: CN104164483A
Application number: CN201410237033.8A
Authority: CN
Inventors: 金凤媚; 薛俊; 宋建; 刘仲齐
Original assignee: TIANJIN CITY AGRICULTURAL BIO-TECH RESEARCH CENTER
Current assignee: TIANJIN CITY AGRICULTURAL BIO-TECH RESEARCH CENTER
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2034-05-30
Also published as: CN104164483B

Abstract

本发明提供一种检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物具有SEQIDNO:1–SEQIDNO:4所示的DNA序列。本发明还提供利用上述特异性引物检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的试剂盒。利用本发明的试剂盒检测番茄花叶病毒基因Tm2²基因，操作简便，准确性高。

Description

利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm22的方法

技术领域

本发明属于植物保护技术，涉及番茄花叶病抗性基因的检测方法，更具体的说是一种快速、简捷、经济的抗番茄花叶病毒基因Tm2²的检测方法。

背景技术

番茄花叶病是世界性的番茄病害, 分布极其广泛, 危害十分严重。主要症状表现为花叶、蕨叶、矮化、黄化、坏死等症状。一旦发病，就会迅速传播蔓延, 给生产造成不可估量的损失。随着人们对番茄与TMV之间关系的深入研究。发现番茄属里可供番茄育种工作者使用的抗TMV基因主要有三个：Tm-1、Tm-2、Tm2²(Tm-2ａ)，其中来源于番茄种质资源I. P. 128650 ( L .chilense) 的变异株的Tm-2²基因对不同株系均表现高抗性。针对这一基因Dax等人已开发出一个SCAR标记。本研究就是在该标记的基础上，利用等位基因特异性PCR方法开发出一种费用低廉的PCR方法检测Tm2²。该方法不需PCR后的酶切，只需一步PCR就可检测出Tm2²基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

发明内容

目前Tm2²基因的SCAR标记检测方法中需要进行PCR和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测成本高昂，检测时间太长等缺点，发明人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用等位基因特异性PCR的方法建立了Tm2²基因的检测体系。此方法无酶切、操作简单是一种成本低且简单方便的Tm2²基因检测的新方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄中Tm2²基因。

本发明的内容如下：

一种检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物具有

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

本发明进一步公开了一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括：

模板DNA 20~60 ng，

Taq DNA聚合酶 0.5 U，

dNTPs each 10mmol/L 0.5μL，

10×PCR缓冲液2.5μL，

引物对1：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL， TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

引物对2：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL，TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

用双蒸水补足25μL。

本发明更进一步公开了试剂盒在用于检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²方面的应用。

本发明还公开了利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm2²的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）基因组DNA提取：从叶片中提取基因组总DNA（王关林，植物基因工程，第2版，北京：科学出版社，2002）。

（2）引物的设计：

以植物总DNA为模板，设计特异性引物，对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中：

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

（3）PCR反应体系：

反应总体积为25μL，包括模板DNA 20~60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10μmol/L）2.5μL，3^，端引物（10μmol/L ）2.5μL，PCR反应条件为：95℃热启动之后，进行PCR扩增；循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，退火54℃30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200），PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明更加详细的步骤如下：

1. 材料和方法

1.1材料

抗病纯合：CLN2264D（3165）来自番茄遗传研究中心（对外有售）。

感病纯合：viginia 73-45来自番茄遗传研究中心（对外有售）。

杂合型：3110（ CLN2264D× viginia 73-45获得的F1代）F1代的获得方法参见余诞年，《番茄遗传学》，湖南科学技术出版社，1999年出版。市售商品种：041（珍奇）、120（宝大903）、511（金鹏强帅）、593（思贝德）、620（浙粉703）、630（中杂9号）（为了方便起见，本研究用代号代替商品名）。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取

从叶片中提取基因组总DNA，按CTAB法提取（王关林，植物基因工程，第2版，北京：科学出版社，2002）。

1．2．2酶切位点的验证

根据Dax等人设计的1对引物，用于Tm2²的950bp的片段。引物序列分别为：

Tm 2-2F：5'-C A C C TTTC C C TC TC C A A -3'

Tm 2-2R：5'-C A C C TTTC C C C TA A A G C -3'

经PCR扩增后感病品种和抗病品种均可扩增出950bp和1000bp的条带，其中感病品种950bp的条带用HindiIII （A|AGCTT）酶切可切出500bp和450bp的条带，抗病品种不被酶切。

抗感品种的scar片段克隆

利用Tm 2-2F和Tm 2-2R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20~60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10 μmol/L）2.5μL，3^，端引物（10μmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用奥莱博有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆。在Takara公司进行测序。

抗性基因特异性引物的设计

因为感病品种有一HindIII酶切位点，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物。为了在不同材料中检测目标SNP，采用等位基因特异性PCR方法（allele-specific PCR,AS-PCR）。其引物设计原理为：以等位基因SNP为约束条件，设计特异的上游引物，将SNP置于引物的3′端的不同位置并在特异性引物的3′端引入1个或2个错配碱基，以增强等位基因特异性PCR的扩增效果。以产物长度便于电泳和紫外分析为约束条件，利用primer3再设计一个公用下游引物（表1）。设计引物时尽可能减少发夹结构，引物二聚体和交叉二聚体等。特异性引物的3^，端分别与抗病品种和感病品种的SNP位点相匹配。与特异性引物相匹配的等位片段有扩增产物，不匹配的没有扩增产物。

反应体系

反应总体积为25μL，包括模板DNA 20~60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10μmol/L）2.5μL，3^，端引物（10μmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。

循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min。退火温度视引物而定。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

结果和分析

2.1材料的测序验证

将含有抗病基因的品种CLN2264D 和含有感病基因的品种viginia 73-45进行克隆，经PCR检测为阳性的克隆送到上海生工公司测序。测序结果发现抗病品种在238和239位为TA而感病材料为GC（如图1）。通过美国国家生物信息中心NCBI的GeneBank对比，结果表明克隆获得的片段为番茄第9条染色体的一段序列（GenBank: EU139075.1）。图1 包含SNP的基因序列。

依测序结果设计的引物

共设计了11条引物，引物1-5扩增抗病基因型，6-9扩增感病基因型（表1）。引物10是扩增抗病基因型的公用引物，大小约为585bp，引物11是扩增感病基因型的公用引物，大小约为290bp。引物1是抗病基因型的原序列，将突变位点设计在了引物的3'末端，引物2在3'端的第三个碱基A引入了错配碱基C，形成C- T错配。引物3在3'端的第三个碱基A引入了错配碱基G，形成G-T错配。引物4在3'端的第四个碱基A引入了错配碱基C，形成C－T错配。为了提高等位基因的扩增的稳定性，在引物5中引入了两个错配碱基，3'端的第三、四个碱基AA 替换成CG ，形成CG-TT 错配。引物6-9的设计原理与引物1-4相同。引物7在3'端的第三个碱基A引入了错配碱基C，形成C- T错配。引物8在3'端的第三个碱基A引入了错配碱基G，形成G-T错配。引物9在3'端的第四个碱基A引入了错配碱基C，形成C－T错配。

表1 依测序结果设计的引物

2.3 Tm2R/F 引物扩增及酶切

分别以已知抗病品种和感病品种的番茄DNA为模板，利用Tm2R/F引物进行扩增，得到950bp和1000bp左右预期的目的条带（图2）。PCR产物用HindIII进行酶切，各品种的酶切结果不尽相同（图3）。抗病品种不被HindIII酶切，而感病品种经HindIII消化后，将950bp的条带切成了500bp和450bp的两条带，杂合型3110的950bp条带则不被完全酶切，这一结果与前人报道的结果一致（Dax, et al.,1998）图2，图3。

2.4 不同引物在抗病品种中的扩增结果

引物1是以抗病品种的原序列为引物，将两个SNP碱基置于引物的3′端。结果表明，退火温度在50℃-58℃的范围内，抗病品种和感病品种中均扩增了相应大小的条带。证明该引物不能有效阻止基因与引物的错配，从而不能有效区分抗感品种（图4中的泳道1、2）。鉴于此，引物2和3在设计时将SNP邻近位点引入错配碱基。发现不同的错配类型对PCR 的结果有影响。引物2由A换成c，形成C-T错配和引物5最后两个碱基由AA换成CG,形成CG-TT错配均不能有效区分出抗病品种和感病品种；引物3由A换成g，形成G-T错配可在适当的反应体系中扩增出目的条带，而且可有效识别抗感性如图5，其中泳道1为抗病品种，泳道2为感病品种，泳道3为杂合型。在抗病品种和杂合型品种中，因含有抗性基因的碱基，目的条带被扩增出来，而在感病品种中无扩增，这样就区分出了品种的抗感性。引物4与 SNP隔一个为引入的错配碱基,由A换成C，形成C-T错配有扩增但不稳定，见图4，图5。

2.5 感病品种不同引物的扩增结果

在感病品种的特异性引物的筛选中，引物6为未引入任何错配碱基的原始引物，在扩增时退火温度提高到60℃时，亦未能区分出抗、感类型（图4中的泳道3、4）。引物7、8、9的设计原理同抗病引物2、3、4。引物7将SNP邻近位点引入错配碱基，由A换成g，形成G-T错配在抗感品种中未扩增出任何条带；引物8和引物9都是形成C-T错配，只是位置不一样，结果引物8经过反复试验在退火温度为53-55℃的范围内可在感病品种中扩增出目的条带，而抗病品种未能扩增出条带，为了与抗病品种的带型区别来，在下游设计了一个引物使扩增产物形成290bp左右的条带（图6）。

2.3退火温度的确定

在抗病品种的SNP的检测中，未引入错配碱基的引物，退火温度从50℃升高至60℃，抗病品种和感病品种均有与目的条带大小一样的条带出现，从而无法区分抗感类型。在与SNP相邻的位置引入错配碱基的引物Tmfk-g在54℃时能区分出抗感类型，而双碱基的错配则在任何温度下均无扩增温度均无理想结果。

在感病品种的SNP的检测中，未引入错配的原序列引物的扩增结果与抗病引物的相似，未能区分出抗感类型。引物Tmfg-g在调整的任何体系中均未扩增出目的条带。引物8和引物9在退火温度为53-55℃的范围内可在感病品种中扩增出目的条带。

2.4特异性引物有效性的验证

利用筛选出来的特异性PCR引物对地方品种编号为041、120、511、593、620、630的品种进行检测。用Tm2R/F 引物扩增出预期的目的条带（图7），将该PCR产物用HindIII酶切，041和120未被切开，而511、593、620、630的950bp的条带均被切开（图8），说明041和120为抗病品种，511、593、620、630为感病品种。

将这6个样品的基因组DNA分别用Tmfk-g/TmR801和Tmfg-c/TmR2 引物对在筛选出来的最佳反应体系中时进行扩增，结果在用抗性引物Tmfk-g/TmR801扩增时041和120能扩增出约585bp的条带而其它4个品种无扩增，用感病引物Tmfg-c/TmR2扩增时，511、593、620、630扩增出约290bp的目的条带，而其它两种无扩增。与利用酶切法区分抗感性的结果。

本发明利用等位基因特异性PCR的方法建立的Tm2²基因检测方法所具有的积极效果在于：

本发明公开的检测方法与其它的Tm2²分子标记检测方法不同，该方法只需要一次PCR就能区分出番茄对ToMV的抗感性，不需要酶切或其它贵重仪器。具有简单快捷的特点。

附图说明：

图1为图1 包含SNP的基因序列，其中蓝色碱基序列为HindIII酶切位点，绿色阴影部份为SNP；

图2 Tm2R/F 引物扩增图；其中1. CLN2264D; 2.viginia 73-45; 3.3110（F1）M. DNA Marker；

图3 PCR产物HindIII酶切图；其中1.CLN2264D; 2.viginia 73-45; 3.3110（F1）M.DNA Marker；

图4引物1的扩增结果图；其中1. CLN2264D; 2. viginia 73-45; 3. CLN2264D;4. viginia 73-45;M.DNA Marker ；

图5引物3的扩增结果图其中1. CLN2264D; 2.viginia 73-45; 3.3110（F1）M. DNA Marker；

图6引物8下游引物TmR2的扩增结果图；其中1.CLN2264D; 2.viginia 73-45; 3.3110（F1）；M. M.DNA Marker；

图7 Tm2R/F 引物扩增图；其中1.041；2.120；3.511；4.593；5.620；6.630；M. M.DNA Marker；

图8 PCR产物HindIII酶切图；其中1.041；2.120；3.511；4.593；5.620；6.630；M. M.DNA Marker；

图9 引物Tmfk-g/TmR801 和Tmfg-c/TmR2的扩增结果图；其中：1-6为Tmfk-g/TmR801的扩增结果；7-12为Tmfg-c/TmR2的扩增结果；1.041；2.120；3.511；4.593；5.620；6.630；7.041；8.120；9.511；104.593；11.620；12.630。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

一种试剂盒，包括：

模板DNA 20~60 ng，

Taq DNA聚合酶 0.5 U，

dNTPs each 10mmol/L 0.5μL，

10×PCR缓冲液2.5μL，

引物对1：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL。 TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

引物对2：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL。TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

实施例2

实际应用：

1.材料：

2009年春以CLN5915（3164）为父本（市售），L-402（市售）。

2.方法

2.1育苗

将F2代番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到5片叶时进行检测。

2.2 DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取。

2.3等位基因特异性扩增

扩增抗病基因的引物对：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAg TA 3′

TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

扩增感病基因的引物对：

Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAc GC 3′

TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

反应总体积为25μL，包括模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10μmol/L）2.5μL，3^，端引物（10μmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。

循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，退火54℃30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200），PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4结果

用抗病引物对Tmfk-g/TmR801扩增时，抗病品种CLN5915（3164）能扩出约585bp的条带，感病品种L-402无条带；

用感病引物对Tmfg-c /TmR2扩增时，感病品种L-402能扩出290bp的条带，抗病品种CLN5915（3164）无条带。证明该方法能有效区分出番茄对ToMV的抗感性。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业生物技术研究中心

<120> 利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm2²的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatgagtag ttcaacccag ta 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctctcaagaa caccatag 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatgagtag ttcaacccac gc 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgatgttga aggtgatatg atga 24

Claims

1.一种检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物具有

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′ 。

2.一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。

3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒，还包括

模板DNA 20~60 ng，

Taq DNA聚合酶 0.5 U，

dNTPs each 10mmol/L 0.5μL，

10×PCR缓冲液2.5μL，

引物对1：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL， TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

引物对2：

5^，端引物 10μmol/L 2.5μL，Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

3^，端引物 10μmol/L 2.5μL，TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′。

4. 权利要求2-3任一项所述的试剂盒在用于检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²方面的应用。

5.一种利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm2²的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）基因组DNA提取：从叶片中提取基因组总DNA，按CTAB法提取；

（2）引物的设计：

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801: 5′ ctctcaagaacaccatag 3′

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

TmR2: 5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′

（3）PCR反应体系：