CN111363856A

CN111363856A - 多重rt-pcr同时检测四种番茄病毒的方法

Info

Publication number: CN111363856A
Application number: CN202010376883.1A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 闫志勇; 赵梅胜; 马华玉; 刘灵芝; 杨广玲; 耿超; 田延平
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: CN111363856B

Abstract

本发明公开了一种多重RT‑PCR同时检测四种番茄病毒的方法，属于植物病毒检测技术领域。本发明根据TMV、ToMV、ToBRFV和TSWV全基因组序列的差异设计了4对特异性引物，建立了四重RT‑PCR检测体系，其检测的特异性强，DNA扩增片段的大小适宜，不同种类的病毒所对应的扩增产物的电泳条带之间有一定的距离，多重PCR结果一目了然，容易辨认特异性条带所对应的病毒。其检测的灵敏度高，TMV、ToMV、ToBRFV或TSWV的特异性引物均可检测出0.02pg的质粒模板(对应的拷贝数为1.8×10³)以及0.2ng番茄植物样品，完全可满足常规番茄样品的检测；本发明的检测体系对指导四种病毒的早期检测和防控有积极作用。

Description

多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法。

背景技术

病毒病是番茄安全生产的严重威胁。番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV)是2015年首次报道的一种烟草花叶病毒属病毒，该病毒已经传播到美洲、亚洲和欧洲的十个国家。该病毒侵染后会在番茄果实上引起畸形、黄色斑或褐色皱缩坏死等症状，导致番茄果实丧失市场价值。2019年，ToBRFV在中国山东发生。ToBRFV非常稳定，可存活很长时间而不丧失传染力，既可以通过种子传播，也可以通过整枝打叉等农事操作传播。因此，ToBRFV对番茄安全生产具有巨大的威胁，目前尚无有效的控制手段。

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(tomato mosaicvirus，ToMV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)是侵染番茄的另外几种重要的病原物，也会对番茄产量和质量造成巨大损失。ToBRFV和TMV、ToMV都属于烟草花叶病毒属，无法利用多克隆抗体区分开，目前也没有ToBRFV的多克隆抗体。ToBRFV和TSWV在番茄果实上产生的症状难以区分，二者复合侵染会导致番茄症状加重。因此，生产上亟需一种快速、准确、易操作的方法来检测ToBRFV，同时将其与TMV、ToMV、TSWV等侵染番茄的病毒区分开。

多重PCR(multiplex PCR)技术由于可以在一个反应管中同时扩增多个序列，实现了对多重病毒的同步检测，大大节约时间、成本以及模板，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。相比常规PCR，多重PCR效率高，节省了检测成本和检测时间。但没有关于同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV这四种番茄病毒的相关文献和专利。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法。采用本发明的方法可以实现同时区分TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV这四种番茄病毒，为番茄病毒病害的早期诊断与防治提供了技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测番茄病毒的多重RT-PCR引物组合，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测ToMV的引物对I，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于特异性RT-PCR检测ToBRFV的引物对II，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

用于特异性RT-PCR检测TSWV的引物对III，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

用于特异性RT-PCR检测TMV的引物对IV，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

进一步的，所述引物组合中还包括：用于特异性RT-PCR检测内参基因ubiquitin的引物对V，其序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明的第二方面，提供上述引物组合在制备同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒的试剂或试剂盒中的用途。

本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物组合。

进一步的，所述试剂盒中还包括：反转录酶、随机引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

本发明的第四方面，提供上述试剂盒在同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒中的用途。

本发明的第五方面，提供一种同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测番茄样品中的总RNA，反转录获得第一链cDNA；

(2)以步骤(1)中获得的第一链cDNA为模板，利用上述多重RT-PCR引物组合进行PCR扩增反应；

(3)对PCR产物进行分析，其中，999bp的片段为TMV，841bp的片段为TSWV，604bp的片段为ToBRFV，362bp的片段为ToMV，224bp的片段为ubiquitin。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增反应的体系为20μL，其含有：2×Taq Master Mix 10μL、模板1μL、ddH₂O 4μL、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的引物各0.5μL，引物浓度均为10μM。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s、53℃退火30s和72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸7min，一个循环。

本发明的有益效果：

本发明首次建立了能同时检测并区分TMV、ToMV、ToBRFV和TSWV的四重RT-PCR检测体系。其检测的特异性强，DNA扩增片段的大小适宜，不同种类的病毒所对应的扩增产物的电泳条带之间有一定的距离，多重PCR结果一目了然，容易辨认特异性条带所对应的病毒。其检测的灵敏度高，TMV、ToMV、ToBRFV或TSWV的特异性引物均可检测出0.02pg的质粒模板(对应的拷贝数为1.8×10³)，以及0.2ng番茄植物样品，完全可满足常规番茄样品的检测。

本发明建立的四重RT-PCR检测体系为番茄病害的早期诊断与防治提供了技术支持，具有积极的作用。

附图说明

图1：四重RT-PCR检测体系的特异性考察；TMV，ToMV，ToBRFV和TSWV不同组合侵染的番茄植株作为检测样品，图中，H:健康植株作为阴性对照；1:ToMV；2:ToBRFV；3:TSWV；4:TMV；5:ToMV和ToBRFV；6:ToMV和TSWV；7:ToMV和TMV；8:ToBRFV和TSWV；9:ToBRFV和TMV；10:TSWV和TMV；11:ToMV、ToBRFV和TSWV；12:ToMV、ToBRFV和TMV；13:ToMV、TSWV和TMV；14:ToBRFV、TSWV和TMV；15:ToMV、ToBRFV、TSWV和TMV；16:空白对照。

图2：四重RT-PCR检测体系的灵敏性考察；梯度稀释含有不同病毒片段的质粒作为模板，其中，1:200pg；2:20pg；3:2pg；4:0.2pg；5:0.02pg；6:0.002pg；7:0.0002pg。

图3：四重RT-PCR检测体系在植物样品浓度的灵敏性考察；梯度稀释含有不同病毒的番茄植株样本作为模板，其中，1:200ng；2:20ng；3:2ng；4:0.2ng；5:0.02ng；6:0.002ng；7:0.0002ng。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，ToBRFV对番茄安全生产具有巨大的威胁，但由于ToBRFV发现的时间较晚，相关研究尚不成熟，目前对于ToBRFV还没有有效的控制手段。另外，ToBRFV和TMV、ToMV都属于烟草花叶病毒属，无法利用多克隆抗体区分开，目前还没有ToBRFV的多克隆抗体。ToBRFV和TSWV在番茄果实上产生的症状难以区分，二者复合侵染会导致番茄症状加重。因此，生产上亟需一种快速、准确、易操作的方法来检测ToBRFV，同时将其与TMV、ToMV、TSWV等侵染番茄的病毒区分开。

基于此，本发明的目的是建立能同时检测并区分TMV、ToMV、ToBRFV和TSWV的四重RT-PCR检测体系。

多重RT-PCR要求在同一体系中进行多位点特异性扩增，是在单重RT-PCR的基础上加以改进，但又不是单一RT-PCR的简单混合，需要反复试验，才能建立最适宜的反应体系和反应条件。其中：

引物的设计是影响多重RT-PCR扩增效果的关键因素。本发明中的TMV，ToMV和ToBRFV为一个属病毒，且序列高度同源，其中ToBRFV与TMV、ToMV全基因组一致率达到80％以上。相对于设计不同属病毒的多重RT-PCR检测引物，设计同属病毒且基因组同源性较高的检测引物具有一定的难度。因此，确保这三个病毒引物的特异性是本发明的关键。我们首先用BioEdit软件比对本实验室获得的以及NCBI下载的TMV，ToMV，ToBRFV和TSWV全基因组序列，分析四个病毒分离物序列各自的保守区域，设计了23对针对ToBRFV的引物，经过筛选得到了5对相对更好的引物。在确保引物特异性的前提下，还需要进一步实现扩增片段长度的差异性，从而能够通过电泳区分开不同病毒，而且需要避免引物之间的相互干扰。为此，我们选择3对ToBRFV引物，与3对TMV引物、7对ToMV引物组成了29个组合，并进行进一步的筛选，获得了能区分这三种病毒、扩增产物大小又不同的特异性引物。然后又设计了针对TSWV的引物。最终，本发明优化设计后的引物组合如下：

ToMV-F：GTTTCATTGTGCTGTTGAGTAC；(SEQ ID No.1)

ToMV-R：AGAAGTACCCATATTGCTTCTTG。(SEQ ID No.2)

ToBRFV-F：CTTCCAAACGTGTACGCAC；(SEQ ID No.3)

ToBRFV-R：GTCGAGAGATATGTCGAATAGA。(SEQ ID No.4)

TSWV-F：CTGCACAATCCCAAGACA；(SEQ ID No.5)

TSWV-R GCTAAGAGATTGAGRAATGGTATAATAGATTC。(SEQ ID No.6)

TMV-F：TGTGCAACACTCCGCRAAT；(SEQ ID No.7)

TMV-R：CGGTTCGAGATCGAAAC。(SEQ ID No.8)

上述引物组合中的引物对均具有高的特异性和灵敏度，可以用于单独检测所对应的病毒，也可以组合起来检测ToMV、ToBRFV、TSWV和TMV这四种病毒。

另外，为了避免实验结果的假阴性，选取番茄的泛素延伸蛋白(ubiquitin)基因作为内参基因对照。因为即便是在病毒侵染条件下，该基因的表达依然非常稳定。

PCR反应条件对多重RT-PCR扩增效果也有较大影响。退火温度和循环数是影响多重RT-PCR扩增效果的关键条件。退火温度过低会导致引物的非特异性扩增，从而产生假阳性，而循环数过低会产生假阴性。本发明从影响多重RT-PCR扩增的退火温度和循环数等方面进行优化，建立了能同时检测并区分TMV，ToMV，ToBRFV和TSWV的四重RT-PCR检测体系，优化后的PCR反应体系为：20μL中含有10μL 2×Taq Master Mix(Vazyme,Nanjing,China)，0.5μL 10μM正向引物和反向引物，1μL模板；优化后的PCR程序为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s、53℃退火30s和72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸7min，一个循环。

利用设计的引物和优化后的PCR反应条件可分别扩增出999bp的TMV片段，841bp的TSWV片段，604bp的ToBRFV片段，362bp的ToMV片段和224bp的ubiquitin片段。上述扩增片段的大小适宜，相邻的条带之间有一定的距离并且有指示条带作为参照，通过电泳对结果进行判断时，多重PCR的结果一目了然，容易辨认特异性条带所对应的病毒。

本发明所建立的体系同时检测并区分TMV、ToMV、ToBRFV和TSWV，最低检测限为1.8×10³拷贝数，可从0.2ng番茄植物样品中检测出这4种病毒。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：引物设计

针对TMV，ToMV，ToBRFV和TSWV全基因组各自的保守区域以及扩增片段的长度，设计特异性引物(表1)。随后针对特异性引物进行四重RT-PCR检测体系的建立。

表1：引物名称、序列、位置及扩增片段长度

注：R表示A或G。

实施例2：病叶总RNA提取

利用TransZol(TransGen Biotech)提取感病番茄叶片总RNA。将100mg叶片于液氮中研磨，加入1mL TransZol室温静置5min，加0.2mL氯仿混匀，室温静置5min。4℃10000g离心15min，取500μL上清加入到500μL异丙醇，室温孵育10min。4℃10000g离心15min。弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇清洗，7500g离心5min，吸净残留的液体。沉淀加50μL RNA溶解液，60℃孵育10min后进行反转录，或者保存于-80℃备用。

实施例3：反转录

用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme)进行反转录。随机引物50ng，RNA500ng，加水至8μL，65℃变性5min后，迅速置冰上2min。加入10μL 2×RT mix和2μL

Enzyme Mix，25℃5min，50℃30min，85℃2min。反转录产物直接进行PCR，或放于-20℃保存。

实施例4：PCR

取1μL实施例3中反转录得到的cDNA产物进行PCR扩增(2×Taq Master Mix购自Vazyme)。PCR反应体系为：20μL中含有10μL 2×Taq Master Mix(Vazyme,Nanjing,China)，0.5μL 10μM正向引物和反向引物，1μL模板，4μL ddH₂O。PCR程序为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s、53℃退火30s和72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸7min，一个循环。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，120V 30min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统观测电泳结果并拍照记录。

实施例5：四重RT-PCR特异性评估

利用上述PCR体系和程序对四种病毒模板的不同组合进行PCR扩增，进行引物特异性评估。结果如图1所示，结果表明，当只含有TMV，ToMV，ToBRFV或TSWV其中一个病毒时，该检测体系能够特异性扩增一个病毒对应的片段；当两种病毒任意组合时，该体系能够特异性扩增出两个病毒对应的片段；当三种病毒任意组合时，该体系能够特异性扩增出三个病毒对应的片段；当四种病毒同时存在时，该体系能够特异性扩增出四个病毒对应的片段。因此该体系能够特异性检测TMV，ToMV，ToBRFV或TSWV四种病毒。

实施例6：四重RT-PCR灵敏度评估

利用上述PCR体系和程序对梯度稀释的质粒模板(200pg,20pg,2pg,0.2pg,0.02pg,0.002pg,0.0002pg)和番茄植株样品RNA模板(200ng,20ng,2ng,0.2ng,0.02ng,0.002ng,0.0002ng)进行PCR扩增，进行引物灵敏性评估。结果如图2和3所示，结果表明TMV，ToMV，ToBRFV或TSWV的特异性引物均可检测出0.02pg的质粒模板(对应的拷贝数为1.8×10³)，以及0.2ng番茄植物样品。

以上结果表明，本发明建立了能区分ToBRFV、TMV、ToMV和TSWV四重RT-PCR检测体系，对指导ToBRFV的早期检测和防控有积极作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttcattgt gctgttgagt ac 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaagtaccc atattgcttc ttg 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttccaaacg tgtacgcac 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgagagat atgtcgaata ga 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgcacaatc ccaagaca 18

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctaagagat tgagraatgg tataatagat tc 32

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtgcaacac tccgcraat 19

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggttcgaga tcgaaac 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtggtggtg ctaagaag 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taggtgagcc cacacttacc 20

Claims

1.一种检测番茄病毒的多重RT-PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合中还包括：用于特异性RT-PCR检测内参基因ubiquitin的引物对V，其序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。

3.权利要求1或2所述的多重RT-PCR引物组合在制备同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒的试剂或试剂盒中的用途。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的引物组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：反转录酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒中的用途。

7.一种同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV四种番茄病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测番茄样品中的总RNA，反转录获得第一链cDNA；

(2)以步骤(1)中获得的第一链cDNA为模板，利用权利要求1或2所述的多重RT-PCR引物组合进行PCR扩增反应；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增反应的体系为20μL，其含有：2×Taq Master Mix 10μL、模板1μL、ddH₂O 4μL、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的引物各0.5μL，引物浓度均为10μM。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s、53℃退火30s和72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸7min，一个循环。