CN113564128B - 一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 - Google Patents
一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113564128B CN113564128B CN202110941685.XA CN202110941685A CN113564128B CN 113564128 B CN113564128 B CN 113564128B CN 202110941685 A CN202110941685 A CN 202110941685A CN 113564128 B CN113564128 B CN 113564128B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- colloidal gold
- tobrfv
- pad
- immune
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 111
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 44
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 15
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 title description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims abstract 8
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 23
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 19
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 claims description 19
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 4
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 208000018999 crinkle Diseases 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 14
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 241000702305 Tomato mottle virus Species 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 2
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。其由样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸顺次搭接粘贴在底板上构成。抗ToBRFV单克隆抗体标记胶体金后包被在金标垫上，抗ToBRFV另一个单克隆抗体和抗鼠IgG二抗分别包被在硝酸纤维素膜检测(T)线和控制(C)线。本发明的ToBRFV胶体金免疫试纸条可准确、特异、灵敏的检测田间番茄中的ToBRFV。该试纸条在5min内可通过肉眼观察检测结果，非常适合田间大批量样品检测，在实际生产中具有很好的应用价值，对ToBRFV的诊断、监测及预警提供物质支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。
背景技术
病毒病严重威胁番茄的安全化生产。番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV)是一个新发病毒，于2015年首次报道，现在已经传播到美洲、亚洲、欧洲和非洲十几个国家，2019年，ToBRFV在中国山东发生。该病毒可导致番茄果实产生褐色皱缩坏死斑或黄色斑，严重危害番茄的产量和质量。该病毒属于烟草花叶病毒属，在体外非常稳定，可存活很长时间而不丧失传染力，可通过种子传播，也可通过农事操作等接触传播。目前，商业化的番茄品种中还未有抗性基因，且尚无有效的控制手段，因此该病毒对番茄安全生产造成巨大的威胁。该病毒已经引起国际上广泛重视，多个国家已经将其列入检疫对象。
ToBRFV的检测主要有：观察植株发病症状、血清学检测和分子生物学检测；其中，植株发病症状是病毒最直观的检测方式，但ToBRFV在番茄上产生的症状与同属烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)和番茄轻斑驳病毒(tomato mild mottle virus，ToMMV)产生的症状类似，因此，发病症状不能够确认侵染病毒种类。血清学检测最常用的是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但是，烟草花叶病毒、番茄花叶病毒和ToBRFV之间有交叉反应，因此，利用ELISA不能有效区分3种病毒。利用RT-PCR可准确检测出ToBRFV，但检测需要精密仪器和专业的操作人员，仅适用于少量样品的检测。
胶体金免疫试纸条操作简单，可在5-10分中内通过肉眼观察进行判断，对于田间应用十分适用。但由于ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV这4个病毒衣壳蛋白氨基酸之间一致率在85％以上，特异性识别ToBRFV胶体金试纸条的制备存在一定难度。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。采用该胶体金免疫试纸条能快速、特异、灵敏地检测番茄样品内的ToBRFV。该试纸条在5min即可用肉眼直接判读结果，适用于田间检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一组杂交瘤细胞株，包括：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14和分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16；上述两个杂交瘤细胞株均于2021年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学)；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14的保藏编号为CCTCCNO：C 2021207；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16的保藏编号为CCTCCNO：C 2021208。
本发明的第二方面，提供单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合包括：单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16；所述单克隆抗体FL447-14由保藏编号为CCTCC NO：C2021207的杂交瘤细胞株分泌产生，所述单克隆抗体FL447-16由保藏编号为CCTCC NO：C2021208的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的第三方面，提供上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条，所述胶体金免疫试纸条包括底板，依次搭接固定于底板上的样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述免疫胶体金垫是结合有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的金标垫；
所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被单克隆抗体FL447-16，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
优选的，所述检测线与质控线之间相距6-6.5mm。
本发明的第五方面，提供上述胶体金免疫试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)调节胶体金溶液的pH为6.0-6.5，向胶体金溶液中加入单克隆抗体FL447-14，使单克隆抗体FL447-14的终浓度为18-22μg/ml；混合均匀，室温反应35-45min，加入BSA溶液终止反应，静置20-40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液；
(2)将步骤(1)制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；
(3)将单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体分别点射于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。
优选的，步骤(1)中，所述胶体金溶液按照如下方法制备：
将1％氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入新制备的1％枸橼酸钠溶液，继续搅拌加热至溶液出现红色，继续煮沸出现透明的橙红色，保持沸煮7-10min，自然冷却至室温。
优选的，步骤(1)中，所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为40nm。
优选的，步骤(1)中，所述免疫胶体金溶液中胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的浓度为1.5mg/ml。
优选的，步骤(1)中，所述BSA溶液的质量浓度为10％。
优选的，步骤(2)中，免疫胶体金溶液涂在金标垫上的涂覆量为2.5μl/cm2。
优选的，步骤(3)中，单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体均稀释至1mg/ml，用量均为0.7μl/cm；然后点射于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次制备了能够特异性识别番茄褐色皱果病毒的单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16。将单克隆抗体FL447-14和FL447-16组合使用能有效区分烟草花叶病毒、番茄花叶病毒和番茄轻斑驳病毒，不存在交叉反应。
(2)本发明的ToBRFV胶体金免疫试纸条可准确、特异、灵敏的检测田间番茄中的ToBRFV。该试纸条在5min内可通过肉眼观察检测结果，非常适合田间大批量样品检测，在实际生产中具有很好的应用价值，对ToBRFV的诊断、监测及预警提供物质支持。
附图说明
图1：本发明的ToBRFV胶体金免疫试纸条结构示意图。
图2：本发明的胶体金免疫试纸条的判定结果标准。
图3：ToBRFV胶体金免疫试纸的特异性分析。
图4：ToBRFV胶体金免疫试纸的检测病汁液灵敏度分析。
图5：ToBRFV胶体金免疫试纸的检测病毒粒子灵敏度分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，ToBRFV对番茄安全生产具有巨大的威胁，但由于ToBRFV发现的时间较晚，相关研究尚不成熟，目前对于ToBRFV尚无有效的控制手段，只能及早检测进行预防。利用RT-PCR虽然可准确检测出ToBRFV，但检测需要精密仪器和专业的操作人员，仅适用于少量样品的检测，并不适合于田间大量样品的检测。
胶体金免疫试纸条操作简单，可在5-10分中内通过肉眼观察进行判断，对于田间应用十分适用。但由于ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV这4个病毒衣壳蛋白氨基酸之间一致率在85％以上，特异性识别ToBRFV胶体金试纸条的制备存在一定难度。由于缺少特异性识别ToBRFV的单克隆抗体，目前还未见有检测ToBRFV胶体金试纸条的报道。
有鉴于此，本发明首先开发了能够识别ToBRFV的单克隆抗体。本发明将提纯的ToBRFV病毒粒子免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠；免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合；然后筛选得到17株杂交瘤细胞株，再制备腹水抗体并进行纯化，最终制备得到17种单克隆抗体。
由于不同杂交细胞株分泌的单克隆抗体识别ToBRFV的特异性会存在差异，本发明将获得的17个单克隆抗体分别作为标记抗体和划膜抗体，共272个配对组合。将272个组合分别检测ToBRFV样本，筛选出26对配对抗体能够快速检测到ToBRFV。随后将这26对配对抗体对TMV、ToMV和ToMMV进行交叉反应，发现FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体这一组合无交叉反应。因此，将单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16的组合用于特异性识别和检测ToBRFV，并将分泌单克隆抗体FL447-14的杂交瘤细胞株和分泌单克隆抗体FL447-16的杂交瘤细胞株进行了生物保藏。
基于本发明开发的单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16，本发明还设计了一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条。
在本发明的一种实施方案中，给出了检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条的制备过程，包括以下步骤：
(1)调节胶体金溶液的pH为6.0-6.5，向胶体金溶液中加入单克隆抗体FL447-14，使单克隆抗体FL447-14的终浓度为18-22μg/ml；混合均匀，室温反应35-45min，加入BSA溶液终止反应，静置20-40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液；
(2)将步骤(1)制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；
(3)将单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体分别点射于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。
本发明的胶体金免疫试纸条的检测原理为：试纸条根据“抗体-抗原-抗体”夹心免疫层析原理设计，滴加样品后，在毛细作用下，样品溶液向上迁移，达到免疫胶体金垫时，金标单克隆抗体a将被溶解。当样品中为ToBRFV阳性时，ToBRFV将和金标单克隆抗体a结合，并一起向上迁移，达到固定有单克隆抗体b的检测线时，形成“金标抗体a-病毒-抗体b”复合物，最终形成一条红色沉淀线，而未被固定的金标抗体a继续上行至羊抗鼠IgG抗体处，形成“金标抗体-IgG”复合物，形成红色沉淀线，此线为质控线。当样品为ToBRFV阴性时，金标抗体溶解在样品中，并一起向上迁移，达到固定有单克隆抗体b的检测线时，不能被固定，检测线处不出现红色条带，未被固定的金标抗体继续上行至羊抗鼠IgG抗体处，形成“金标抗体-IgG”复合物，形成红色沉淀线，此线为质控线。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：ToBRFV山东分离物(ToBRFV-SD)采自山东禹城，接种12天后采取系统叶片进行病毒粒子提纯。该分离物的生物学特性和分子检测体系已经发表在2021年Journal ofIntegrative Agriculture，20(7):1871-1879。自申请日之日起20年内公众可从申请人处获得ToBRFV山东分离物(ToBRFV-SD)以用于重复本实验。
实施例1：ToBRFV单克隆抗体制备
1.1免疫小鼠
利用采自山东禹城的ToBRFV分离物(ToBRFV-SD)接种番茄，接种12天后采取系统叶片进行病毒粒子提纯。将提纯的ToBRFV粒子对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，共进行三次免疫，采取皮下多点注射。每次每只小鼠抗原免疫用量为25μg共100μL，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。
1.2单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.2.1细胞融合
将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞按10:1比例进行混匀，1500rpm离心6min后弃上清后，加入1mL 50％PEG，融合3分钟，用细胞培养基终止融合后1500rpm离心6min。沉淀的细胞用培养液洗涤一次，加入用HAT细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。
1.2.2阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先对所有细胞孔通过间接法ELISA筛选强阳性的细胞孔。将阳性的各细胞孔在24孔细胞培养板中进行扩大培养。采用有限稀释法获得单克隆细胞株。将获得的17株单克隆杂交瘤细胞扩大培养，随后冻存和用于制备腹水。
1.3单克隆抗体的大量制备与纯化
1.3.1小鼠腹水的制备
取6周龄健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，一至两周后，小鼠腹腔注射106个杂交瘤细胞，7-10天后见小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，腹水在室温条件下4000rpm离心15min，上清液即为单克隆抗体腹水。
1.3.2单克隆抗体的纯化
在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和后继续搅拌30min。在4℃条件下13000rpm离心30min，弃上清。沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH 7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％后继续搅拌30min，在4℃条件下13000rpm离心30min，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH 7.4)，4℃透析过夜。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，对纯化后的抗体采用BCA法进行浓度测定，最终纯化得到17个单克隆抗体(单克隆抗体FL447-01～单克隆抗体FL447-17)。
1.4特异性识别ToBRFV的单克隆抗体组合的筛选
将获得的17个单克隆抗体分别作为标记抗体和划膜抗体，共272个配对组合。通过将这272个配对组合制备成简易的胶体金试纸条装置，分别检测ToBRFV样本，检测结果见表1。
表1：
注：表中的“-”代表和ToBRFV无反应，“+”代表和ToBRFV有反应，“+”前的数字代表反应信号强度，数字越大，表示反应信号强度越高。
“标记抗体”是指用胶体金颗粒进行标记的单克隆抗体；“划膜抗体”是指点射于硝酸纤维素膜上形成检测线的单克隆抗体。标记抗体和划膜抗体所对应的数字1-17分别表示所制备的17个单克隆抗体(数字1对应单克隆抗体FL447-01，数字2对应单克隆抗体FL447-02，依次类推)
由此筛选出26对配对单克隆抗体能够快速检测到ToBRFV，随后将这26对配对抗体制备成简易的胶体金试纸条装置，考察其对TMV、ToMV和ToMMV的交叉反应，检测结果见表2。
表2：
注：表中的“-”代表和相应的检测对象无反应，“+”代表和相应的检测对象有反应，“+”前的数字代表反应信号强度，数字越大，表示反应信号强度越高。
结果发现，FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体无交叉反应，其它配对抗体组合均存在一定程度的交叉反应。
因此，选取FL447-14作为标记抗体/FL447-16作为划膜抗体这个配对组合作为特异性识别ToBRFV的单克隆抗体组合。
对单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16用SouthernBiotech抗体亚型检测试剂盒进行检测，结果表明：FL447-14和FL447-16单抗亚型分别为IgG1和IgG2a。
以1μg/ml ToBRFV病毒粒子作为抗原，通过ELISA间接法对单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16的效价进行检测，结果表明：单克隆抗体FL447-14的效价为1:243000，单克隆抗体FL447-16的效价为1:243000。
将分泌单克隆抗体FL447-14的杂交瘤细胞株和分泌单克隆抗体FL447-16的杂交瘤细胞株进行了生物保藏，生物保藏信息如下：
保藏材料：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16。
保藏机构：中国典型培养物保藏中心。
保藏日期：2021年8月15日
保藏编号：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14的保藏编号为CCTCC NO：C 2021207；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16的保藏编号为CCTCC NO：C 2021208。
实施例2：ToBRFV胶体金免疫试纸的制备及使用方法
1、ToBRFV胶体金免疫试纸的制备：
1.1胶体金溶液配备：
(1)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。
(2)1％氯金酸溶液配制：将1g氯金酸溶于100mL超纯水中。
(3)1％枸橼酸钠溶液配制：将1g枸橼酸钠溶于100mL超纯水中。
(4)胶体金的制备：量取90mL超纯水于烧杯中，加入1mL 1％氯金酸溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2mL新制备的1％枸橼酸钠溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮7-10min，自然冷却至室温，加超纯水定容100mL。倒入棕色瓶，4℃避光保存。
1.2抗体标记
取1.5ml制取好的胶体金，用0.1M的K2CO3调节pH值为6-7，加入30μg单克隆抗体a，混合均匀，室温反应40min。加入10％的BSA(m/v)终止，静置30min。先用低速(1500r/min)离心弃去凝聚的金胶粒沉淀。然后用高速(8500r/min)离心30分钟。仔细吸去上清，沉淀物用金标液(PBS缓冲液，含1％BSA(m/v)，1％吐温20(v/v))复溶制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液(1.5mg/mL)于4℃保存。
1.3喷金
将终浓度1.5mg/mL的免疫胶体金溶液喷于金标垫，涂覆量2.5μl/cm2，制备免疫胶体金垫，烘干待用。
1.4划膜
利用划膜机将浓度为1mg/ml的单克隆抗体b点在硝酸纤维素膜检测(T)线上，将浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG点在硝酸纤维素膜质控(C)线上，涂覆量均为0.7μl/cm，使T线和C线之间相距6～6.5mm。
1.5组装
将样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次粘贴到底板上，组装ToBRFV胶体金试纸条(图1)。
2、胶体金免疫试纸检测ToBRFV的步骤
2.1.样品制备：将0.1g番茄叶片和5mL 0.01M PBS缓冲液(pH7.2)在研钵中研磨均匀，吸取匀浆液到离心管中，12000rpm离心2min或静置5min。
2.2.加样：平放ToBRFV胶体金免疫试纸，用吸管吸取3滴(约100μL)匀浆液到加样孔中。
2.3.肉眼判读结果：加样5min根据图2判读结果。C线和T线同时显色，代表样品为阳性；C线显色、T线不显色，代表样品为阴性；C线不显色、T线显色或者C线和T线不显色代表试纸条失效。
实施例3：ToBRFV胶体金免疫试纸的特异性分析
取100μL健康番茄样品、感染TMV的番茄样品、感染ToMV的番茄样品、感染ToMMV的番茄样品、感染ToBRFV的番茄样品的稀释液(1：50)加到胶体金免疫试纸加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图3)。检测结果显示，当稀释度为1：50加样后5min，感染ToBRFV的番茄样品为阳性，其余样品为阴性，表明该试纸条具有较高的特异性。
实施例4：ToBRFV胶体金免疫试纸的灵敏度分析
1、检测感染ToBRFV的番茄样品
首先制备1：100稀释的健康番茄样品以及1：100、1：400、1：1600、1：6400、1：12800、1：25600稀释的感染ToBRFV的番茄样品稀释液。各取100μL加到加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图4)。检测结果显示，加样后5min，1：100、1：400、1：1600、1：6400、1：12800稀释的感染ToBRFV的番茄样品为阳性，表明该试纸条具有较高的灵敏度。
2、检测ToBRFV粒子
首先制备50μg/mL、5μg/mL、500ng/mL和50ng/mL的ToBRFV粒子稀释液。取100μL各稀释液到加样孔中，加样5min后肉眼判读结果(图5)。检测结果显示，加样后5min，50μg/mL、5μg/mL和500ng/mL的ToBRFV粒子稀释液为阳性，50ng/mL呈微弱阳性。
ToBRFV胶体金免疫试纸能快速、特异、灵敏地检测番茄样品内的ToBRFV。该试纸条在5min即可用肉眼直接判读结果，适用于田间检测。限定条件下不与健康番茄和感染TMV、ToMV、ToMMV的番茄样品反应。最低可检测稀释12800倍ToBRFV侵染的番茄样品(含约8μg植物组织)和500ng/mL的ToBRFV粒子稀释液(含50ng病毒粒子)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一组杂交瘤细胞株，其特征在于，包括：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14和分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16；所述分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14的保藏编号为CCTCC NO：C 2021207；所述分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16的保藏编号为CCTCC NO：C 2021208。
2. 单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括：单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16；所述单克隆抗体FL447-14由保藏编号为CCTCC NO：C 2021207的杂交瘤细胞株分泌产生，所述单克隆抗体FL447-16由保藏编号为CCTCC NO：C 2021208的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。
4.一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于，所述胶体金免疫试纸条包括底板，依次搭接固定于底板上的样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述免疫胶体金垫是结合有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的金标垫；
所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被单克隆抗体FL447-16，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体；
所述单克隆抗体FL447-14由保藏编号为CCTCC NO：C 2021207的杂交瘤细胞株分泌产生；所述单克隆抗体FL447-16由保藏编号为CCTCC NO：C 2021208的杂交瘤细胞株分泌产生。
5.根据权利要求4所述的胶体金免疫试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线之间相距6-6.5mm。
6.权利要求4或5所述的胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）调节胶体金溶液的pH为6.0-6.5，向胶体金溶液中加入单克隆抗体FL447-14，使单克隆抗体FL447-14的终浓度为18-22μg/ml；混合均匀，室温反应35-45min，加入BSA溶液终止反应，静置20-40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体FL447-14的免疫胶体金溶液；
（2）将步骤（1）制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；
（3）将单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体分别点射于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
（4）在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胶体金溶液按照如下方法制备：
将1%氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入新制备的1%枸橼酸钠溶液，继续搅拌加热至溶液出现红色，继续煮沸出现透明的橙红色，保持沸煮7-10min，自然冷却至室温。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为40 nm。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，免疫胶体金溶液涂在金标垫上的涂覆量为2.5 μl /cm2。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，单克隆抗体FL447-16和羊抗鼠IgG抗体均稀释至1mg/ml，用量均为0.7 μl/cm；然后点射于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110941685.XA CN113564128B (zh) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 |
| ZA2022/04061A ZA202204061B (en) | 2021-08-17 | 2022-04-11 | Immunocolloidal gold test strip for detecting tomato brown rugose fruit virus and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110941685.XA CN113564128B (zh) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113564128A CN113564128A (zh) | 2021-10-29 |
| CN113564128B true CN113564128B (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=78171846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110941685.XA Active CN113564128B (zh) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113564128B (zh) |
| ZA (1) | ZA202204061B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2927915A1 (es) * | 2021-05-07 | 2022-11-11 | Abiopep S L | Anticuerpos a la proteina capsida del tobrfv y su uso en metodos de deteccion del tobrfv |
| CN113846095B (zh) * | 2021-11-09 | 2022-07-08 | 中国科学院西北生态环境资源研究院 | 车前草花叶病毒的检测卡、检测引物组合物、gica-rt-lamp试剂盒 |
| CN113913558B (zh) * | 2021-11-09 | 2022-07-19 | 中国科学院西北生态环境资源研究院 | 一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363856A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-07-03 | 山东农业大学 | 多重rt-pcr同时检测四种番茄病毒的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11730135B2 (en) * | 2017-06-01 | 2023-08-22 | Vilmorin & Cie. | Resistance in plants of Solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus |
-
2021
- 2021-08-17 CN CN202110941685.XA patent/CN113564128B/zh active Active
-
2022
- 2022-04-11 ZA ZA2022/04061A patent/ZA202204061B/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363856A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-07-03 | 山东农业大学 | 多重rt-pcr同时检测四种番茄病毒的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Real-time tracking of tomato brown rugose fruit virus;Van de Vossenberg B T L H等;《PLoS ONE》;20201231;第15卷(第10期);第e0234671篇 * |
| 山东农业大学李向东团队在番茄褐色皱果病毒诊断和检测技术方面取得最新进展;刘刚;《农药市场信息》;20200801(第15期);第53页 * |
| 警惕新发病毒番茄褐色皱果病毒Tomato brown rugose fruit virus对我国番茄产业的危害;闫志勇等;《植物保护》;20201008(第05期);第316-320页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA202204061B (en) | 2022-06-29 |
| CN113564128A (zh) | 2021-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113564128B (zh) | 一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 | |
| Lima et al. | Serology applied to plant virology | |
| CN104862285B (zh) | 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用 | |
| CN109187967A (zh) | 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法 | |
| US5104789A (en) | Monoclonal antibodies which discriminate between strains of citrus tristeza virus | |
| CN106636004B (zh) | 一种tmv-cmv-pvy三重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN103044528B (zh) | 一种草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用 | |
| CN103364561A (zh) | 猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测试纸及制备方法 | |
| CN107722110A (zh) | 一种新型的猪轮状病毒疫苗的vp6抗原 | |
| CN108872580B (zh) | 一种检测新型鹅细小病毒的胶体金试纸条及其制备方法 | |
| CN105543177A (zh) | 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN112458060B (zh) | 1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用 | |
| CN110904053B (zh) | 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN110791480B (zh) | 菜豆普通花叶病毒的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN112592899A (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN110257341B (zh) | 分泌抗马铃薯m病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN118185880A (zh) | 一种检测甘蔗花叶病毒的胶体金免疫试纸条及专用抗体 | |
| CN111596062A (zh) | 一种同时检测tmv和pvy的速测卡及其制备、使用方法 | |
| Koenig | Serology and immunochemistry | |
| CN111077317A (zh) | 一种检测tswv的速测卡及其制备、使用方法 | |
| CN104513811A (zh) | 分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| Balamuralikrishnan et al. | Serological specificity and titre of Sugarcane mosaic virus polyclonal antisera raised under varying immunization procedures and bleeding time/Serologische Speziiität und Titer der polyclonalen Antiseren des Sugarcane mosaic virus, gewonnen durch unterschiedliche Immunisierungsprozeduren und Blutentnahmetermine | |
| CN104513812B (zh) | 分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN111562379B (zh) | 一组用于早期食管癌筛查的多指标联合检测胶体金试纸条 | |
| KR102092468B1 (ko) | 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 리신 독소 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |