CN111596062A

CN111596062A - 一种同时检测tmv和pvy的速测卡及其制备、使用方法

Info

Publication number: CN111596062A
Application number: CN201911424627.9A
Authority: CN
Inventors: 贾蒙骜; 郭玉双; 王亚琴; 张孝廉; 胡涛
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-08-28

Abstract

本发明涉及一种免疫金标速测卡，应用双抗体夹心免疫层析的原理，同时检测植物样本中的烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）。检测时，首先向加样孔中加入待检样本，如果样本中含有两种病毒或其中的一种，在样本层析移动的过程中，病毒会与金标垫上的胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，然后被NC膜相应病毒检测线（T线）上的抗体沉积，相应病毒的检测线（T线）显色，多余的金标单克隆抗体在继续移动过程中被控制线上的二抗沉积，控制线（C线）显色；如果样本中不含上述两种病毒，则两条检测线（T线）均不显色，控制线（C线）显色。应用该速测卡可现场对各种样品中TMV、PVY进行准确、快速和灵敏的检测。

Description

一种同时检测TMV和PVY的速测卡及其制备、使用方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的速测卡及其使用方法，具体是一种同时检测烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的速测卡及其制备、使用方法。

背景技术

烟草花叶病毒（以下简称TMV）为棒状病毒科（Virgaviridae），烟草花叶病毒属（Tobamovirus）病毒。病毒粒子为螺旋杆状，长300nm，直径18nm，病毒结构极为稳定，基因组为正单链RNA。TMV寄主植物多达350 余种，侵染烟草等茄科作物会出现明显的花叶和斑驳症状，并可造成严重的矮化或畸形，对农业生产危害极大。

马铃薯Y病毒（以下简称PVY），为马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒。病毒粒子为线状，基因组为正单链RNA。PVY有多种株系，其中N株系可以造成烟草等寄主叶脉坏死，严重时可以造成作物绝收。

目前常规检测TMV和PVY的方法为PCR，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。

以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安全检测、植物转基因检测等，但针对烟草病毒的检测较少，而同时检测TMV和PVY等的速测卡还未见有公开报道。

发明内容

本发明的目的在于克服竞争法检测技术的不足，提供一种基于双抗夹心法制备同时检测TMV和PVY的金标卡检测方法，并应用其针对叶片样品中TMV和PVY进行快速、现场和灵敏的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，包含：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，所述的金标垫固定有胶体金标记的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体，所述的NC膜有两条检测线，分别固定TMV或PVY特异性多克隆抗体。

所述的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体分别由分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到。

所述的在金标垫上固定5ng-50ng两种单克隆抗体，优化的量为TMV单克隆抗体24ng，PVY单克隆抗体24ng，NC膜上固定0.4μg-1.2μg两种特异性多克隆抗体，优化的量为TMV多克隆抗体0.4μg，PVY多克隆抗体0.4μg。

分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2019177，保藏单位：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏日期：2019-9-27，分类命名：杂交瘤细胞株FL085-01；分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为 CCTCC NO:C2019178，保藏单位：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏日期：2019-9-27，分类命名：杂交瘤细胞株FL204-46。

还包括封盖板，所述的封盖板设置加样孔和结果观察孔，加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和NC膜位置。

所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的制备方法，（1）将TMV和PVY的特异性多克隆抗体和二抗分别固定于NC膜上；（2）在碱性条件下将胶体金颗粒分别与抗TMV特异性单克隆抗体与抗PVY特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；（3）速测卡的组装：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，加盖封盖板与底板合并形成速测卡。

所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的使用方法，首先于加样孔中加入样品溶液并水平放置，样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，并与NC膜上的特异性抗原竞争结合试纸条上固定的特异性单克隆抗体，1min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断；如果只有控制线C线，没有相应的检测线T线，则表明为待检物质为阴性；既有控制线C线，又有相应的检测线T线，则表明待检物质为阳性。

本发明制得的新型TMV/PVY二合一速测卡对烟草叶片具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于烟草的快速检测。较现有的速测卡操作相比，具有以下特有优势。

（1）同一张卡上能同时检测TMV和PVY，而不是两张单种卡的简单物理性胶连，加样仅需1次，而且反应均在同一条件下进行。

（2）样品前处理完全统一，操作简单，100微升样品加样量即可。

（3）检测时间短（1 min）、结果判定标准统一。完全阴性结果（仅出现1条C线）；阳性（＋）：只要任何一条TMV/PVY的T线显色。

本发明提供的同时检测TMV和PVY的二合一免疫胶体金速测卡可为实际检测部门提供了快速、现场和灵敏的检测方法，主要应用于叶片样品的检测。

附图说明：

图1为本发明结构示意图；1 -结果观察孔；2-C线、控制线；3-TMV线；4-PVY线；5-加样孔。

具体实施方式

结合本发明的内容提供以下实施例:

（1）TMV、PVY单克隆抗体的制备

取保藏编号为C2019177的TMV单克隆抗体杂交瘤细胞株和保藏编号为C2019178的PVY单克隆抗体杂交瘤细胞株，在细胞培养瓶中扩大培养；

取7周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.2 mL。10天后腹腔接种一定数量的单克隆抗体杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大，用弯头滴管采集腹水，间接ELISA测定腹水抗体效价。

小鼠腹水离心15min（2000 rpm，室温），挑去上层油脂，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min（13000 rpm， 4 ℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30min，离心30min（13000 rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS（0.01M， pH7.4），4℃透析过夜，测定蛋白质含量，-20℃冻存备用。

硫酸铵沉淀后继续才用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5 mL0.4M PB缓冲液 (pH 7.0) 平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10 mL0.4M PB缓冲液 (pH 7.0) 平衡纯化小柱；5mL0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 7.0）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 M Tris-HCI(pH2.7)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性；10 mL0.4M PB缓冲液 (pH 7.0) 平衡纯化小柱；5 mL 20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱。

（2）兔多克隆抗体制备

取2月龄雌性新西兰大白兔一只进行免疫，共进行三次免疫，采取腹股沟皮下多点注射。每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为500 μg，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，耳静脉注射加强免疫。加强免疫14天后取血。

血清离心15 min（4000 rpm，室温），取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30 min，离心30 min（13000 rpm， 4 ℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01 M, pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30 min，离心30min（13000 rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS（0.01M, pH7.4），4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5 ml超纯水过柱，再用5 ml 0.4M PB缓冲液 (pH 7.0) 平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10 ml 0.4M PB缓冲液 (pH 7.0) 平衡纯化小柱；5 ml 0.1 M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 MTris-HCl (pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

（3）TMV/PVY二合一速测卡的制作

1）在封盖板（塑料板）有两个的孔，分别为加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm ，观察孔大小为4mm×18mm；加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和NC膜位置；

2）在底板（塑料板）依次粘贴样品垫（玻璃纤维膜）和的固定有胶体金标记抗体的试纸条、NC膜、吸收垫。玻璃纤维膜大小为4 mm×15 mm；金标记抗体试纸条大小为3 mm×4 mm；NC膜大小为4mm×28mm；吸收垫大小为4mm×19mm；

3）以HAuCl₄为原料，采用柠檬酸钠还原法制备粒径为25nm的胶体金，在碱性条件下将胶体金颗粒分别与TMV特异性单克隆抗体与PVY特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；

4）使用划膜喷金标机，在金标垫上固定5ng-50ng两种单克隆抗体，优化的量为TMV单克隆抗体24ng，PVY单克隆抗体24ng，NC膜上固定0.4μg-1.2μg两种多克隆抗体，优化的量为TMV多克隆抗体0.4μg，PVY多克隆抗体0.4μg；

5）使用划膜喷金标机，将TMV和PVY的特异性多克隆抗体和二抗（羊抗小鼠）分别固定于NC膜上，自然风干后，封闭缓冲液中封闭一小时、洗涤缓冲液中洗两次后在室温条件下自然风干；控制线C线上的二抗（羊抗小鼠），它是以抗体为抗原制备的可以识别抗体免疫球蛋白IgG的抗体，只要是抗体经过，它都会反应，因此用来做质控线。

6）加盖封盖板与底板合并形成速测卡；成速测卡于37 ℃干燥，时间为30 min。

4）成速测卡于37 ℃干燥，时间为30 min。

（4）TMV/PVY二合一速测卡检测病毒粒子效果评价

①加样孔中加入100μL空白样品液（pH 7.4 ，0.2mol/L PBS: 8g氯化钠、3.35 g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1 L），在室温条件下反应8分钟后在结果观察孔中观察显色结果。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线C线，T1线和T2线不显色。

②加样孔中加入100μL 1μg/ml的TMV病毒粒子溶液（采样同上的PBS溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T1线呈现明显的酒红色，检测线T2线无色。

③加样孔中加入100μL 1μg/ml的PVY病毒粒子溶液（采样同上的PBS溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线呈现明显的酒红色，检测线T1线无色。

④加样孔中加入100μL同时含有1μg/ml的TMV病毒粒子和1μg/ml的PVY病毒粒子溶液（采样同上的PBS溶液稀释配成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T1线、检测线T2线呈现酒红色。

（5）TMV/PVY二合一速测卡检测叶片样本效果评价

①加样孔中加入100μL 阴性叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中呈现明显的酒红色的控制线C线，检测线T1线、T2线不显色。

②加样孔中加入100μL TMV阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T1线呈现酒红色，检测线T2线无色。

③加样孔中加入100μL PVY阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线呈现酒红色，检测线T1线无色。

④加样孔中加入100μL TMV和PVY均为阳性的叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线、检测线T1线呈现酒红色。

经试验得到本检测卡检测灵敏度：PVY：300ppb，TMV：100ppb。

申请人声明，本发明专利通过上述实施例来说明本发明专利的技术方案，所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明专利的任何改进，均落在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，包含：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，其特征在于：所述的金标垫固定有胶体金标记的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体，所述的NC膜有两条检测线，分别固定TMV或PVY特异性多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，其特征在于：所述的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体分别由分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，其特征在于：所述的在金标垫上固定5ng-50ng两种单克隆抗体，优化的量为TMV单克隆抗体24ng，PVY单克隆抗体24ng，NC膜上固定0.4μg-1.2μg两种特异性多克隆抗体，优化的量为TMV多克隆抗体0.4μg，PVY多克隆抗体0.4μg。

4.根据权利要求2所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，其特征在于：分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2019177；分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO:C2019178。

5.根据权利要求1所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡，其特征在于：还包括封盖板，所述的封盖板设置加样孔和结果观察孔，加样孔对应样品垫的位置，结果观察孔对应金标垫和NC膜位置。

6.如权利要求1-5之一所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的制备方法，其特征在于：（1）将TMV和PVY的特异性多克隆抗体和二抗分别固定于NC膜上；（2）在碱性条件下将胶体金颗粒分别与抗TMV特异性单克隆抗体与抗PVY特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合；（3）速测卡的组装：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，加盖封盖板与底板合并形成速测卡。

7.根据权利要求1-5之一所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的使用方法，其特征在于：首先于加样孔中加入样品溶液并水平放置，1min后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断；如果只有控制线C线，没有相应的检测线T线，则表明为待检物质为阴性；既有控制线C线，又有相应的检测线T线，则表明待检物质为阳性。