CN103613563A - 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 - Google Patents

苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103613563A
CN103613563A CN201310667544.9A CN201310667544A CN103613563A CN 103613563 A CN103613563 A CN 103613563A CN 201310667544 A CN201310667544 A CN 201310667544A CN 103613563 A CN103613563 A CN 103613563A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
bacterium ester
benzothiostrobin
antigen
artificial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310667544.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103613563B (zh
Inventor
王鸣华
袁玉龙
华修德
施海燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201310667544.9A priority Critical patent/CN103613563B/zh
Publication of CN103613563A publication Critical patent/CN103613563A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103613563B publication Critical patent/CN103613563B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/68—Benzothiazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • C07D277/70—Sulfur atoms
    • C07D277/74—Sulfur atoms substituted by carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Abstract

本发明涉及苯噻菌酯抗原、抗体的制备及其应用，属于免疫化学分析技术领域。苯噻菌酯化学名称为2-[[(5-甲氧基-2-苯并噻唑)-硫甲基]-α-(E)-甲氧基亚甲基]苯乙酸甲酯。在碱性条件下，通过对苯噻菌酯结构中羧酸酯进行水解，合成了人工半抗原，其化学名称为2-[[(5-甲氧基-2-苯并噻唑)-硫甲基]-α-(E)-甲氧基亚甲基]苯乙酸，将其分别于牛血清蛋白和卵清蛋白偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫BALB／c雌性小鼠，制得苯噻菌酯的特异性单克隆抗体。这种抗体与其他化合物不发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫层析分析方法可用于快速、灵敏、方便和廉价检测环境和农产品中苯噻菌酯残留。

Description

苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
一、技术领域
本发明涉及一种苯噻菌酯人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。
二、背景技术
甲氧基丙烯酸酯类(Strobilurins)杀菌剂是以天然抗生素为先导开发成功的一类新型杀菌剂，具有广谱、高效、环境友好的特点，近年来成为杀菌剂创制研究的热点。苯噻菌酯(benzothiostrobin)是由华中师范大学研发的一种新型Strobilurins类杀菌剂。苯噻菌酯具有杀菌谱广，杀菌活性高，施用量低，持效期长等优点，具有保护及治疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出优越的防效，具有良好的市场开发前景。为预防苯噻菌酯应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。
目前苯噻菌酯残留检测方法采用仪器分析方法，如液相色谱分析法。这些仪器分析方法灵敏准确，但检测仪器昂贵、样品前处理较繁琐、检测费时费力、难以满足大量样品快速简便检测的需要。
免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优势。ELISA是一种将酶催化反应和免疫反应相结合的免疫标记测定技术，有酶催化反应的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性，在灵敏度方面有很大的优势。ELISA作为一种快速灵敏的检测方法，在许多小分子免疫分析中已得到较成熟的应用。通过化学合成苯噻菌酯半抗原和人工抗原，制备针对苯噻菌酯的特异性抗体，建立苯噻菌酯免疫学检测方法。该发明方法的完成，将解决苯噻菌酯半抗原合成，抗体制备等关键技术，建立苯噻菌酯的ELISA快速检测技术。该发明不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测、环境监测部门的水域监测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前国内外尚未见有关苯噻菌酯的人工半抗原、人工抗原和抗体的报道。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种制备苯噻菌酯半抗原、人工抗原及特异性单克隆抗体的制备方法。
技术方案
本发明包括：
1半抗原合成
对苯噻菌酯苯环上羧酸酯进行碱性水解合成了人工半抗原，再用碳二亚胺法与牛血清蛋白(BSA)偶联获得免疫抗原，用混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联获得包被抗原。其分子结构如下：
Figure BSA0000098774090000021
2抗体制备
将制备好的免疫抗原免疫BALB／c雌性小鼠，免疫剂量为200μL／只(按蛋白浓度计)，共免疫五次。首次免疫由等体积的免疫抗原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后用等体积免疫抗原和弗氏不完全佐剂乳化。从第三次免疫开始，每次免疫后尾静脉采血，测定效价。待免疫血清效价稳定后，将生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2／0与上面血清效价最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆，最后得到一株能稳定分泌抗苯噻菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，再将这杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水，得到腹水后，采用Protein A免疫亲和柱纯化腹水得到抗体，冷冻干燥得到抗体冻干粉。
3免疫分析方法建立及应用
对制备的苯噻菌酯抗体进行效价、特异性及灵敏度的分析，建立苯噻菌酯的ic-ELISA。将建立的间接竞争酶免疫分析方法应用于环境样品和农产品中苯噻菌酯的残留量检测。
有益效果
本发明优点和积极效果表现在：
1新颖实用：苯噻菌酯抗原的合成与抗体制备技术具有重要的实用价值和实际意义。首次设计合成苯噻菌酯人工抗原，经免疫BALB／c雌性小鼠产生特异性单克隆抗体，为苯噻菌酯残留的高效快速分析提供了一种新的方法。传统的农药仪器分析前处理过程繁琐，成本高，耗时长，大量使用有机溶剂易造成环境污染，且对操作人员素质要求较高，难以满足农产品安全分析对快速、简便、准确、大量检测的需求。而本发明提供的苯噻菌酯免疫分析方法具有操作简单快速(只需要2-3小时)、分析成本低、分析容量大、安全可靠、容易普及推广，特别适用于大批量样品检测和现场监测，可以与传统仪器分析方法互为补充。
2准确度高：苯噻菌酯抗体经纯化制成冻干粉后的效价为2×106。抗体特异性识别苯噻菌酯，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀虫剂没有明显的交义反应。从而可知，所制备的抗体特异性强，可快速准确地分析检测苯噻菌酯在样本中的残留量。应用该免疫方法苯噻菌酯在实际样品中的的回收率为80.43-113.83％，变异系数低于7.8％，符合残留分析标准。
3灵敏度高：建立的ic-ELISA的抑制中浓度(IC50)为7.55μg／L，检测限(IC10，LOD)为0.428μg／L，线性范围为0.428-54μg／L。
四、具体实施方式
1人工半抗原的合成
对苯噻菌酯苯环上羧酸酯进行碱性水解，合成具有三个原子连接臂的半抗原，既最大限度的保留了苯噻菌酯特征基团，又形成了羧基末端基团，能较好的跟蛋白偶联。产物纯化后通过质谱(ESI)和核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定。苯噻菌酯人工半抗原的分子结构式为：
Figure BSA0000098774090000031
1.1人工半抗原的合成
称取8.02g(0.02mol)苯噻菌酯原药和30mL四氢呋喃加入到100mL的三角瓶中，然斤加入10.08mL5％氢氧化锂溶液(苯噻菌酯：氢氧化锂＝1：1.05)，室温下搅拌反应4个小时加入20mL水，用乙酸乙酯萃取三次，每次40mL，弃去有机相，水相用浓盐酸调节pH值至2.0，用乙酸乙酯萃取三次，每次30mL，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得黄色油状物用硅胶柱纯化，梯度洗脱：150mL的甲醇：二氯甲炕＝1：50(体积比)的混合液，100mL的甲醇：二氯甲烷＝1：30(体积比)的混合液，收集体积比为2：8的馏分，浓缩近干，得到半抗原。
1.2苯噻菌酯人工半抗原的鉴定
将纯化后的半抗原经ESI-MS、1H-NMR测定，以鉴定其分子结构。质谱和核磁共振谱信息如下：ESI-MS，m／z，346[M+H+]和368[M+Na+]。1H-NMR(400MHz，DMSO)，δ：3.79(s，2H，CH2COO)，3.86(s，3H，OCH3)，4.67(s，2H，SCH2)，7.01(dd，1H，ArH)，7.32-7.22(m，3H，ArH)，7.47(d，1H，ArH)，7.52(m，1H，ArH)，7.88(m，1H，ArH)，12.52(s，1H，COOH)。
从以上信息综合分析可知，所合成的产物为目标人工半抗原。
2人工抗原的合成
苯噻菌酯人工抗原的分子结构式如下：
Figure BSA0000098774090000041
2.1免疫抗原的合成
免疫抗原的合成采用碳二亚胺法。将69mg(0.2mmol)苯噻菌酯半抗原溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在溶液中加入69.0mg(0.6mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应15min，再加入62.7mg(0.3mmol)的二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应过夜。离心，取上清液0.5mL，将上清液缓慢加入到12mL浓度为10mg／mL牛血清蛋白(BSA)的碳酸盐缓冲溶液(CBS，0.1mol／L，pH9.6)中，磁力搅拌下反应4h。将反应完成斤的溶液装入预处理好的透析袋，4℃下先用蒸馏水透析3次(间隔2-3h)，然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01mol／L，pH7.4)透析72h，每天换液3-5次，即得免疫抗原，分装，保存于-20℃的冰箱中。
2.2包被抗原的合成
包被抗原的合成采用混合酸酐法。将86.25mg(0.25mmol)半抗原，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后边搅拌边在溶液中加入60μL三正丁胺和30μL氯甲酸异丁酯，室温下反应1h，再缓慢加入到12mL的10mg／mL卵清蛋白(OVA)的CBS(0.1mol／L，pH9.6)中，磁力搅拌下反应2h，待反应完成后，装入透析袋，4℃下先用蒸馏水透析3次(间隔2-3h)，然后用PBS(0.01mol／L，pH7.4)透析72h，每天换液3-5次，即得包被抗原，分装，保存于-20℃的冰箱中备用。
2.3人工抗原的鉴定
对半抗原、载体蛋白及偶联物进行紫外(200nm～400nm)扫描。从紫外谱图看到偶联物紫外吸收光谱较载体蛋白和半抗原的吸收光谱发生了明显的变化，具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征，说明半抗原和载体蛋白偶联成功。根据它们在280nm波长下的摩尔吸光系数估算得到免疫抗原和包被抗原的结合比分别为17：1和9：1。
3抗体制备
3.1免疫BALB／c雌性小鼠制备抗血清
采用腹腔注射，免疫BALB／c雌性小鼠，初次免疫用等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化免疫原，免疫剂量为200μL／只(按蛋白浓度计)，3周后用弗氏不完全佐剂(FIA)乳化加强免疫，免疫剂量为200μL／只，以后每间隔2周加免一次，共加免4次。具体免疫方案见下表。
Figure BSA0000098774090000051
基础免疫前1周，鼠尾静脉采集阴性血，并制备血清作为阴性对照。从第三次免疫开始，每次免疫后尾静脉采血，用间接非竞争酶联免疫吸附分析法测定抗血清的效价(血清的稀释倍数即为效价)。
待免疫血清效价稳定后，将生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2／0与上面血清效价最好的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆，最后得到一株能稳定分泌抗苯噻菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，再将这杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水。
3.2抗体的纯化
单克隆抗体使用PALL Protein A柱进行纯化，具体步骤如下：
(1)用5～10倍柱体积的平衡缓冲液PB(0.025M，pH7.4)洗涤平衡Protein A柱；
(2)含抗体的高密度培养上清液12000rpm离心后，上清与4倍体积平衡缓冲液混合，缓慢加入层析柱；
(3)用5倍柱体积以上的平衡缓冲液洗柱，至流出液无蛋白检出；
(4)加入10倍柱体积的洗脱缓冲液(100mM柠檬酸钠，Ph4)洗脱吸附的抗体，收集洗脱液；
(5)向收集的洗脱液中加入1／3体积的1M Tris-HCl，pH8.0；
(6)超滤离心管去盐，冷冻抽干。
3.3抗体效价
经纯化制成的抗体冻干粉后的效价为2×106。
3.4抗体可变区氨基酸序列的测定
3.4.1提取mRNA
(1)收集细胞瓶里的杂交瘤细胞，弃上清，加TRIZOL试剂1ml，立即吹打。(观察：液体变粘稠，细胞脱壁)。
(2)将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5ml EP管中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇20秒。
(3)室温静置5分钟后，12000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清无色水相到EP管(DEPC处理过)，加等体积新开的异丙醇，颠倒离心管数次，混匀斤室温下静置10分钟。
(4)12000rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75％乙醇1.0ml洗涤(用DEPC水新配制)后，7500rpm，5min，4℃离心，重复两次洗涤。
(5)去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟，DEPC处理水20-30ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
(6)1.2％琼脂糖电泳，155，30min。
3.4.2反转录
用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录得到cDNA，-20℃冻存。
3.4.3DNA片段扩增及测序
用Trans-Tap酶试剂盒(北京全式金生物有限公司)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的DNA片段，进行测序(北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司)。
PCR条件：
轻链：95℃，5min---94℃，30s---49℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止
重链：95℃，5min---94℃，30s---60℃，30s---72℃，30s---重复循环30次---72℃，8min---12℃，终止
3.4.3抗体可变区氨基酸序列的确定
经过翻译序列为：
(1)抗体重链可变区氨基酸序列为：
QVKLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMTWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMTSLRSEDTAIYYCARLRTVVDYWGQGTTVTVSS；
(2)抗体轻链可变区氨基酸序列为：
ALMSASPGERVTLTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCQQWSSNPYTFGG。
4苯噻菌酯ic-ELISA的建立
4.1方法原理
采用间接竞争免疫分析方法。将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体。固相抗原，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗原上的抗体就少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，显色就减弱，结合率降低，反之，则显色增强，结合率升高，因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的结合率，推算出待测农药的浓度。
4.2抗原抗体工作浓度
ic-ELISA抗原抗体工作浓度的确定用方阵滴定法，选择OD值为1.0时的抗原抗体稀秆浓度。经实验，包被抗原浓度0.500μg/mL，抗体浓度0.035μg／mL作为最适工作浓度。
4.3间接竞争免疫反应程序
4.3.1包被
用CBS缓冲液(0.05mol／L，pH9.6)将包被抗原稀秆至最适浓度，100μL／孔加入96孔酶标板(MaxisorpTM透明聚乙烯板)，4℃包被过夜；
4.3.2封闭
取出包被好的酶标板，弃去包被液，用0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)洗涤后，加入用PBS缓冲溶液稀释的1.0％的OVA的PBS(0.01M，pH7.4)封闭液200μL／孔，于37℃温箱中温育50min。
4.3.3加样
取经封闭和洗涤后的酶标板，加入系列浓度的苯噻菌酯标准液或待测样品提取液50μL／孔，再加入抗体稀秆液50μL／孔，同时设置空白对照和阴性对照，37℃温育1h。
4.3.4加酶标二抗
弃去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠10000倍稀释液100μL/孔，37℃温育1h，弃去孔内液体，用PBST溶液洗涤。
4.3.5显色反应
加入四甲基联苯胺(TMB)-H2O2底物溶液100μL／孔，37℃温箱中温育15min，用50μL／孔2mol／LH2SO4终止反应。在iMarkTM酶标仪上测定490nm波长下的吸光值(A)。
4.4标准曲线和灵敏度
根据结合率与苯噻菌酯浓度的对数作图即得到标准曲线，计算抑制中浓度(IC50)及最低检测限(IC10，LOD)。结合率(B／Bo，％)以下式计算：
B／Bo(％)＝[(Ax-Amin)／(Amax-Amin)]×100
式中：Ax为不加药时的吸光值，Amax为阴性对照的吸光值，Amin为空白对照的吸光值。
标准曲线的线性方程为：B／Bo(％)＝-24.549LogC+17.168
苯噻菌酯浓度在0.428-54μg/L范围内，呈线性关系，相关系数为R2＝0.9976，IC50为7.55μg／L，LOD为0.428μg／L。
4.5抗体的特异性
抗体的特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性越好。
制备的抗体除与吡啶醚菌酯有微弱的交义反应外(CR％＝0.34％)，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂没有交叉反应(CR％＜0.05％)。从而可知，所制备的抗体特异性强，可以用于苯噻菌酯的分析。
5样品添加分析
5.1提取方法
5.1.1水样
水样(或经过滤)添加苯噻菌酯制成三个不同浓度水平(0.01，0.05，0.5mg/kg)的样品，重复3次，设置对照。混匀，放置过夜后，用含10％甲醇的PBS与待测水样等量混匀进行测量。
5.1.2土壤或农产品样品(大米，梨，番茄)
称取粉碎后的样品10g，装入三角瓶中。苯噻菌酯添加的方式与水样相同。混匀，放置过夜，在样品中加入20mL乙腈超声萃取15min两次。在4000rpm离心5min，合并两次上清液，倒入盛有5g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡，使乙腈与水分层，静置10min，取25mL至平底烧瓶。用旋转蒸发器浓缩近干，用含5％甲醇的PBS定容。
5.2样品的ELISA分析
样品分析步骤参考4.3。经分析可知，该ELISA的苯噻菌酯回收率为80.43-113.83％，平均变异系数为1.2-7.8％。
实际样品中苯噻菌酯残留量检测参照5.1和5.2方法进行。
本发明建立的苯噻菌酯残留的免疫分析方法符合苯噻菌酯残留分析标准。该方法可用于环境和农产品中苯噻菌酯的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量检测和现场监测。

Claims (9)

1.式(I)所示化合物： 
Figure FSA0000098774080000011
2.式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：在氢氧化锂碱性条件下，将苯噻菌酯水解反应，获得所述化合物。 
3.式(II)所示人工抗原： 
Figure FSA0000098774080000012
。
4.权利3所述的人工抗原，其特征在于：采用碳二亚胺法将人工半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联，采用混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联。 
5.权利要求3或4所述人工抗原在制备苯噻菌酯特异性抗体中的应用。 
6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 
7.以权利要求3或4所述人工抗原为免疫原制备得到的单克隆抗体。 
8.权利要求7所述单克隆抗体，其特征在于：抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMTWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMTSLRSEDTAIYYCARLRTVVDYWGQGTTVTVSS：轻链可变区氨基酸序列为：ALMSASPGERVTLTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCQQWSSNPYTFGG。 
9.权利要求3或4所述人工抗原，或，权利要求7或8所述单克隆抗体在检测苯噻菌酯单中的应用。 
CN201310667544.9A 2013-12-11 2013-12-11 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 Active CN103613563B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310667544.9A CN103613563B (zh) 2013-12-11 2013-12-11 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310667544.9A CN103613563B (zh) 2013-12-11 2013-12-11 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103613563A true CN103613563A (zh) 2014-03-05
CN103613563B CN103613563B (zh) 2015-05-13

Family

ID=50164293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310667544.9A Active CN103613563B (zh) 2013-12-11 2013-12-11 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103613563B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104987361A (zh) * 2015-07-15 2015-10-21 南京农业大学 苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽及其用途
CN105153280A (zh) * 2015-07-15 2015-12-16 南京农业大学 苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用途
CN107417579A (zh) * 2017-06-19 2017-12-01 宁波市农业科学研究院 L‑月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN107473961A (zh) * 2017-06-19 2017-12-15 宁波市农业科学研究院 抗倒酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN109497054A (zh) * 2018-12-28 2019-03-22 南京高正农用化工有限公司 一种代森联和吡啶醚菌酯复配的水分散粒剂及其制备方法
CN109946454A (zh) * 2018-12-25 2019-06-28 苏州快捷康生物技术有限公司 一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用
CN110642793A (zh) * 2019-09-24 2020-01-03 北京勤邦生物技术有限公司 嘧菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268780A (zh) * 2008-05-08 2008-09-24 华中师范大学 一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、制备方法及用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268780A (zh) * 2008-05-08 2008-09-24 华中师范大学 一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、制备方法及用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEP V. MERCADER ET AL.: "Hapten Synthesis and Monoclonal Antibody-Based Immunoasay Development for Detection of the Fungicide Trifloxystrobin", 《J. AGRIC. FOOD. CHEM》, vol. 56, no. 8, 29 March 2008 (2008-03-29), pages 2581 - 2588 *
JOSEP V. MERCADER ET AL.: "Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to the Strobilurin Pwsticide Pyraclostrobin", 《J. AGRIC. FOOD. CHEM.》, vol. 56, no. 17, 9 August 2008 (2008-08-09), pages 7682 - 7690 *
王俊东等: "精恶唑禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究", 《分析化学》, vol. 37, no. 1, 31 January 2009 (2009-01-31) *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104987361A (zh) * 2015-07-15 2015-10-21 南京农业大学 苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽及其用途
CN105153280A (zh) * 2015-07-15 2015-12-16 南京农业大学 苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用途
CN105153280B (zh) * 2015-07-15 2018-10-30 南京农业大学 苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用途
CN104987361B (zh) * 2015-07-15 2020-02-14 南京农业大学 苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽及其用途
CN107417579A (zh) * 2017-06-19 2017-12-01 宁波市农业科学研究院 L‑月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN107473961A (zh) * 2017-06-19 2017-12-15 宁波市农业科学研究院 抗倒酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN107417579B (zh) * 2017-06-19 2022-07-19 宁波市农业科学研究院 L-月桂酰胺精氨酸盐酸盐乙醇酯人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN109946454A (zh) * 2018-12-25 2019-06-28 苏州快捷康生物技术有限公司 一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用
CN109946454B (zh) * 2018-12-25 2022-05-27 苏州快捷康生物技术有限公司 一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用
CN109497054A (zh) * 2018-12-28 2019-03-22 南京高正农用化工有限公司 一种代森联和吡啶醚菌酯复配的水分散粒剂及其制备方法
CN110642793A (zh) * 2019-09-24 2020-01-03 北京勤邦生物技术有限公司 嘧菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103613563B (zh) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103613563B (zh) 苯噻菌酯半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途
CN101413955B (zh) 一种检测玉米赤霉烯酮的elisa测试盒及制备及检测方法
BRPI0915086B1 (pt) Detecção do uso de canabis
CN102827076B (zh) 一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用
CN101993855A (zh) 杂交瘤细胞株1c11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用
CN106366021B (zh) 一种氨基甲酸乙酯半抗原组合、人工抗原组合及其制备方法与应用
CN101245032A (zh) 隐孔雀石绿半抗原及制备得到的抗体和抗体的应用
US20230167196A1 (en) Anti-phenacetin monoclonal antibody hybridoma cell strain ad and its preparation method and application
CN104569404A (zh) 直接竞争trfia法检测喹乙醇的方法
CN101776685B (zh) 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102875671A (zh) 噻虫胺抗原、抗体及其应用
CN105541655A (zh) 辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗原及其应用
CN104119277A (zh) 一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用
CN105301252A (zh) 一种用于赭曲霉毒素a富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
CN103215230A (zh) 杂交瘤细胞株afm1b7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素m1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒
CN104974256B (zh) 一种抗噻虫啉单克隆抗体及其用途
CN105624119B (zh) 杂交瘤细胞株yqqd8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体
CN105277423A (zh) 一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
CN101995460B (zh) 莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法
CN102942519B (zh) 烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN102295698B (zh) 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒
CN103524362A (zh) 孔雀石绿人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN103508910B (zh) β-兴奋剂类半抗原及其制备方法和应用
CN208506058U (zh) 一种用于检测玉米赤霉醇的食品检测试剂盒
CN105440137A (zh) 抗莱克多巴胺的抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant