CN101993855A - 杂交瘤细胞株1c11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杂交瘤细胞株1C11、其分泌产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株1C11可以用于制备高效价黄曲霉毒素抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达5.12×10⁶；该抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的50％抑制浓度即IC₅₀依次为1.2，1.3，2.2和18.0pg/mL，是目前所报导的对四种黄曲霉毒素灵敏度最高的抗体，其用于测定黄曲霉毒素总量，即黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的总含量，实际应用价值大。

Description

杂交瘤细胞株1C11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株1C11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中最主要的是黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2。

黄曲霉毒素污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正比。黄曲霉毒素广泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，而且往往是多种黄曲霉毒素同时存在，为此世界各国都规定了黄曲霉毒素总量(B1+B2+G1+G2)在食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强对食品及饲料中黄曲霉毒素总量的检测、特别是速测，及时了解和掌握食品及饲料的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一股实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以，要研究建立针对黄曲霉毒素总量的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素总量的抗体。目前，国内外已有很多针对单一组分的黄曲霉毒素单克隆或多克隆抗体的报道，但针对黄曲霉毒素总量的抗体尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株1C11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用。

本发明提供了杂交瘤细胞株1C11，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201013。其具有序列表中SEQ Gene NO.1所示的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ Gene NO.2所示的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein NO.1所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ Protein NO.2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。

抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体在黄曲霉毒素总量测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株1C11是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2共4种作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株1C11。

本发明提供的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集含有抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的小鼠腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株1C11可以用于制备高效价黄曲霉毒素抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达5.12×10⁶，即鼠腹水抗体稀释5.12×10⁶倍时的溶液测定结果为阳性。

(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的50％抑制浓度即IC₅₀依次为1.2，1.3，2.2和18.0pg/mL，是目前所报导的对四种黄曲霉毒素灵敏度最高的抗体。

(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体可用于测定黄曲霉毒素总量，即黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的总含量，实际应用价值大。

附图说明

图1为本发明的快速检测黄曲霉毒素总量的免疫层析试纸的正视图。图中：1纸板、2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线。

图2为本发明的快速检测黄曲霉毒素总量的免疫层析试纸的左视图。图中：1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫。

图3为实施例4中应用本发明提供的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体制备的试纸条检测样品的结果判定图。图中：1对照试纸条；2检测试纸条；3质控线；4检测线。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株1C11的制备

1.动物免疫

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠40μg/mL。前3次每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。

黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA购于Sigma-Aldrich公司。

2.细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50％聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合后1分钟加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20％胎牛血清，2％生长因子和1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。

上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2共4种作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株1C11。

实施例2：杂交瘤细胞株1C11抗体可变区序列测定

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系1C11的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’(22mer)和5’-TGA GGAGAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTTGGT GCC-3’(24mer)和5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长357bp，序列如SEQ ID NO：1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由119个氨基酸组成，序列如SEQ GENE ID NO：3所示。轻链可变区编码基因序列长311bp，序列如SEQ GENE ID NO：2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由101个氨基酸组成，序列如SEQ GENE ID NO：4所示。

实施例3：抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的制备、纯化以及其亚型及特性鉴定

将实施例2获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株1C11分泌的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的亚型为IgG2a。用间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的灵敏度分别为1.2，1.3，2.2和18.0pg/mL、交叉反应率分别为100.0％，94.3％，54.5％和6.7％。

实施例4：抗体应用

将杂交瘤细胞株1C11分泌的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体用于制备快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条，制备方法包括以下步骤：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，即得吸水垫；

(2检测垫的制备

检测线的包被：

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA配制成0.1mg/mL的包被液A；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为80ng，然后于37℃条件下干燥15分钟；

所述的包被液A为：10mg市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA，1g牛血清白蛋白，1g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体配成0.5mg/mL的包被液B；于距检测线5mm的位置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200ng，然后于37℃条件下干燥15分钟；

所述的包被液B为将50mg兔抗鼠多克隆抗体，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm。

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于37℃条件下干燥16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

所述的封闭液A为1g牛血清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。

(4)金标垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于37℃条件下干燥16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素总量通用单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体为144ng，然后真空冷冻干燥6h，置干燥器中室温保存；

所述的封闭液B为1g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

所述的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5.5；在搅拌的状态下缓慢加入2mL 0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液的质量浓度为0.04mg/mL；

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；

所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶解在10mL纯水中制成；所述的10％牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；

(5)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条，见图1和图2。

上述快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条的应用：

称取已磨细1#和2#待测样品，加入体积浓度为80％的甲醇水溶液，待测样品与甲醇水溶液的质量体积比为3g/mL，混匀，在50℃水浴下超声提取8分钟，静置10分钟，将上层清液即提取液用水稀释2.5倍，使稀释液中甲醇的终浓度为32％，得样品溶液，再取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条(作检测试纸条)的样品垫，同时取100μL水做为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取结果。

检测结果：1#检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色，则判为阳性结果，表明待测样品中的黄曲霉毒素总量即黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的总含量高于0.5ng/g，见图3-1；2#检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，则判为阳性结果，表明待测样品中的黄曲霉毒素总量即黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的总含量高于或等于0.5ng/g，见图3-2。

Claims (5)

1.杂交瘤细胞株1C11，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C201013。

2.抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生。

3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体在黄曲霉毒素总量测定中的应用。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1C11的制备方法，其特征在于：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2共4种作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株1C11。

5.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集含有抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的小鼠腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体。

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