CN105624119B - 杂交瘤细胞株yqqd8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达2.56×106。由其分泌产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体可以较好地识别辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％‑170％；可应用于定量测定辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量。

Description

杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成 辣椒素通用单克隆抗体
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
背景技术
辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90％，并提供了约90％的辣热感刺激。除了赋予食品辛辣味被用作调味品以外，辣椒素类物质还具有消炎镇痛、抗病菌、抗肿瘤作用，能促进脂肪燃烧、降低血脂，抑制胃酸分泌、对胃黏膜损伤有保护作用等药用价值。在农药领域，辣椒素类物质被认为是一种理想的无公害农药，已有报道被应用于水果、蔬菜、谷物等作物上，免除了耐药性及残留检验。在轻工业领域可被用于高档特种防污涂料，防止海洋水生物对船体的附着；用于电缆材料中以驱赶老鼠啃咬等。合成辣椒素具有与天然辣椒素类似的结构部和功能，且在价格和辣度上比天然辣椒素更占优势，也被广泛应用于医药、杀虫剂、防污涂料、军事武器等领域。因此，辣椒素类物质总量分析测定方法的研究对辣椒产品的研发与标准化及其品质评价意义重大。
现有的辣椒素类物质分析检测方法包括感官鉴定法、凯氏定氮法、化学检测法(包括呋喃甲醛法、三氯化铁法和氧氯钒法)、分光光度法、光谱测定法、薄层色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用等。其中感官鉴定法是最早评估辣度的方法，虽然简单直接,但检测结果易受主观因素影响，重复性差、敏感度变化大，且香味对辣味的影响、心理上的预料没有标准。化学检测法多用于辣椒素类物质的定性分析。薄层色谱法由于操作复杂费时，且测定结果灵敏度和准确度不高，应用较少。高效液相色谱法、色谱-质谱联用等现代仪器检测方法是辣椒素类物质最常用的检测方法，其灵敏度高、准确性好，但是仪器设备昂贵，，对实验环境要求高，且要求专业操作人员，难以实现快速检测。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。
免疫分析是基于抗原、抗体的特异性识别反应的一种分析方法，其核心试剂是高质量的特异性抗体。所以要建立辣椒素类物质总量免疫分析方法，首先要获得抗辣椒素类物质的通用抗体。由于辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素应用较多，且含量相比其他辣椒素类物质多。因此，制得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用抗体即可满足检测需求。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性强、稳定性好，一旦建立杂交瘤细胞株后，可连续稳定生产抗体。目前，国内外鲜有针对辣椒素类物质抗体的报道，特别是辣椒素类物质单克隆抗体未见报道。因此，研制辣椒素类物质单克隆抗体不仅填补了辣椒素类物质免疫检测的空白，为辣椒素类物质的快速检测开辟新思路，对实现辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量免疫定量检测具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
提供杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。
抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
本发明提供的杂交瘤细胞株YQQD8是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：以香兰素胺盐酸盐与丁二酸酐为原料，经一步反应合成人工半抗原化合物，将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联后即得辣椒素类物质通用人工完全抗原。将BALB/c小鼠经辣椒素类物质通用人工完全抗原免疫2-4次后，用2倍于前一次免疫剂量的辣椒素类物质完全抗原Capsaicin-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，融合细胞用液体培养基进行培养。采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗辣椒素类物质而不抗包被抗原载体蛋白OVA(卵清白蛋白)的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用辣椒素作为竞争，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。
本发明提供的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心30min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上；4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，冰浴条件下缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，将抗体冻干粉置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
上述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体在辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量测定中的应用，该抗体可用于辣椒果实及食品中三种辣椒素总量的测定。
其应用方法为：将样品提取液加入预先固定有辣椒素类物质通用人工完全抗原的ELISA板中，同时加入上述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的稀释液，此时样品提取液中的辣椒素类物质将会与固定在ELISA板上的完全抗原竞争结合单克隆抗体，37℃孵育一段时间后，洗板，加入经辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗及显色液进行显色，反应一段时间后终止显色，并在450nm处测定OD值，其中与样品中辣椒素类物质结合的抗体已在洗板过程中被洗掉，与固定在ELISA板上的抗原结合的抗体将会继续与二抗结合，进而显色，样品中辣椒素类物质越多，则显色越深，OD值越大，最终根据OD值的变化即可快速检测辣椒果实及食品样品中辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素三种辣椒素的总含量。
按上述方案，所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
Pr载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的杂交瘤细胞株YQQD8可以用于制备抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达2.56×106。本发明提供的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体可以较好地识别辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％；对辣椒素类物质的半抑制浓度IC50值为5.8ng/mL，可应用于定量测定辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量。
附图说明
图1为本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。
图2本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。
具体实施方式
实施例1辣椒素类物质通用人工免疫抗原的制备
辣椒素类物质通用人工半抗原的制备：
称取香兰素胺盐酸盐0.28g溶于6ml四氢呋喃，搅拌滴加0.15g三乙胺，室温搅拌30min。准确称取丁二酸酐0.15g(0.0015mol)加入上述反应液中，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL乙酸乙酯室温搅拌2min，过滤后所得沉淀即为半抗原为4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄胺基]-4-羰基羧酸(4-[(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4-oxobutanoic acid)，分子式为C12H15NO5。
经核磁鉴定结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.17(s,1H),8.87(s,1H),8.31(d,J＝6.0Hz,1H),4.21(d,J＝5.8Hz,2H),3.80(s,3H),2.52(t,J＝6.9Hz,2H),2.42(t,J＝6.7Hz,2H)。与其结果的理论值一致，表明该半抗原化合物成功合成。
辣椒素类物质通用人工完全抗原-免疫抗原的制备
称取上述辣椒素类物质通用人工半抗原20.3mg(约0.08mmol)和11.6mg(约0.1mmol)NHS于反应瓶中，加入400ulDMF溶解于反应瓶中，室温搅拌30min，称取20.6mg(约0.1mmol)DCC溶于100ulDMF中，将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶，室温搅拌4h，4℃静置过夜。8000rpm/5min，取上清活泼酯液。
将上清活泼酯液，逐滴滴加到6ml 7mg/ml的BSA溶液中反应，反应缓冲液为0.2MpH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01MpH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-免疫抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图1，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的制备
称上述辣椒素类物质通用人工半抗原4.55mg溶于200μL无水DMF中,然后按顺序加入4.27μL三正丁胺、2.34μL氯甲酸异丁酯,室温下搅拌避光反应1h，得活化的辣椒素类物质半抗原溶液。
将活化的辣椒素类物质半抗原溶液逐滴滴加到10ml 4.5mg/ml的OVA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01M pH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-包被抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图2，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
实施例2：动物免疫及杂交瘤细胞株YQQD8的制备
1.动物免疫
购买7周龄BALB/c小鼠5只，免疫上述辣椒素类物质人工抗原-免疫抗原。第一次免疫将免疫抗原与等体积快免佐剂QuickAntibody-Mouse5W(购自北京博奥龙生物技术有限公司)迅速混匀后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫小鼠。第21天、42天分别按同样方式加强免疫。3次免疫所用免疫抗原的剂量相同，均为每鼠12.5μg。每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第3次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，加强免疫时，采用小鼠腹腔注射峰方式，免疫抗原的用量为之前的2倍，不需要用佐剂混合。
2.细胞融合
于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1500)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以约5-10︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，用72mLRPMI-1640完全培养液将小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞重悬，将重悬细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640完全培养液含有20％(体积百分数)胎牛血清，10％(体积百分数)
Figure BDA0000922506730000062
培养基和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体RPMI-1640完全培养基是指，在RPMI-1640完全培养液中加入1％(质量百分数)的甲基纤维素。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；
Figure BDA0000922506730000061
培养基购于北京博奥龙免疫技术有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
待96孔板上的细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗辣椒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用辣椒素作为竞争原，与固定在ELISA板上的抗原竞争性的结合上清中的抗体，其中与辣椒素结合的抗体将会在之后的步骤被洗掉，与包被抗原结合的抗体则被固定在ELISA板上，加入HRP标记的羊抗鼠抗体及显色液后则会显色。竞争原辣椒素浓度越高，显色越浅，450nm处的吸光度值越低。选择未加竞争原时吸光值较高和灵敏度均较高的孔(此处吸光值较高指，竞争原为0的孔所测得吸光值，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度IC50值较小)。采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。
实施例3：抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8抗体可变区序列测定
(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系YQQD8的总RNA；
(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；
(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5，-GAV GTG AWG STG GTG GAG TC-3，(20mer)和5，-GAG GAG ACG GTG ACT GAGGT-3，(20mer)其中S、R和W为简并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5，-RTT KTG ATG ACC CAR AC-3，(17mer)和5，-ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG-3，(20mer)。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长313bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由104个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长299bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由99个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。
实施例4：抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例2获得的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，用2mol/L的盐酸溶液调节该混合液的pH值至4.7，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的亚型为IgG1。
用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达2.56×106，即鼠腹水抗体稀释2.56×106倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％。
实施例5：辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体YQQD8的应用。
将杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体用于辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量的添加回收试验，具体包括以下步骤：
(1)以1μg/mL辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜，0.01mol/L pH 7.4PBST洗涤扣干；
(2)5％脱脂奶粉封闭，每孔200μL，37℃2h，洗涤扣干；
(3)配制0，0.03125，0.3125，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200ng/mL的辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量标准溶液(辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素比例为1:1:1)，第一排每孔依次加入待测辣椒素类物质标准溶液50μL，其它孔作为检测孔，每个样品三个重复，每孔抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体(稀释1000000倍)50μL，37℃孵育2h，洗涤扣干；
(4)每孔加1：2000羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃2h，洗涤扣干；
(5)底物显色反应：每孔加底物显色液100μL(所述底物显色液的配制：1mg/mL四甲基联苯胺1.0mL，底物缓冲液10mL，1％H2O225μL，现配现用)，37℃避光反应15min，每孔50μL2mol/L H2SO4终止反应，5min后以空白对照孔调零，450nm测吸光值；
(6)绘制标准曲线，并计算辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量在50％时的抑制浓度(IC50)为5.8ng/mL。
(7)添加回收试验：分别称取无辣椒素食品黄豆酱样品25g粉碎样品置于三角瓶中，加入25mL 80％的甲醇水溶液混合均匀，超声波处理10min。静置30min，使其完全分层，吸取上清，将上清用双层滤纸进行过滤。将滤液用PBS溶液稀释五倍后，向其中分别准确添加3ng/mL、10ng/mL和40ng/mL辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量标准品，采用间接竞争ELISA方法进行添加回收试验，并测定黄豆酱样品的添加回收率，依次为88％，95％，90％。
ELISA所需溶液配制：
磷酸盐缓冲液(pH7.4PBS):Na2HPO4.12H2O 8.7g；NaCl 24g；KCl 0.6g，KH2PO40.6g，加纯水定容至3000mL。
包被缓冲液(PH9.6碳酸盐缓冲液)：1.59g Na2CO3；2.93g NaHCO3；加纯水定容至1000mL。
1％吐温20的PBS溶液(PBST溶液)：Na2HPO4.12H2O 8.7g；NaCl 24g；KCl 0.6g，KH2PO40.6g，Tween201.5mL，定容至3000mL。
封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mLPBST。
底物缓冲液：Na2HPO4.12H2O 1.843g，柠檬酸0.933g，纯水100mL。
Figure IDA0000922506830000011
Figure IDA0000922506830000021
Figure IDA0000922506830000031

Claims (5)

1.杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。
2.抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，它由权利要求1所述的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
3.权利要求2所述的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
4.权利要求2所述的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体在辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量测定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：应用方法为：将样品提取液加入预先固定有辣椒素类物质通用人工完全抗原的ELISA板中，同时加入所述 抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的稀释液，此时样品提取液中的辣椒素类物质将会与固定在ELISA板上的完全抗原竞争结合单克隆抗体，37℃孵育一段时间后，洗板，加入经辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗及显色液进行显色，反应一段时间后终止显色，并在450nm处测定OD值，其中与样品中辣椒素类物质结合的抗体已在洗板过程中被洗掉，与固定在ELISA板上的抗原结合的抗体将会继续与二抗结合，进而显色，样品中辣椒素类物质越多，则显色越深，OD值越大，最终根据OD值的变化即可快速检测辣椒果实及食品样品中辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素三种辣椒素的总含量，所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：Pr载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。
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