CN101863981A

CN101863981A - 一种抗双酚a单克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN101863981A
Application number: CN 201010157470
Authority: CN
Inventors: 赵肃清; 黄洪; 张磊; 张焜; 李明月; 郑杰; 方岩雄; 黄宝华
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2010-10-20

Abstract

本发明公开了一种抗双酚A单克隆抗体的制备方法，为了制备它的单克隆抗体，首先将双酚A与大分子载体蛋白结合制备人工免疫抗原和包被抗原；将双酚A人工免疫抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，经杂交瘤技术检测和多次亚克隆后得到能稳定分泌双酚A抗体的阳性杂交瘤细胞，分泌抗体属IgG1亚类；利用抗体效价高的细胞株分泌的单克隆抗体，建立双酚A间接竞争ELISA试验，最低检测限可达0.324ng/mL，该抗体与苯、苯酚、叔丁基苯酚、对羟基苯酚以及邻羟基苯甲酸等还有苯环结构的化合物没有交叉反应，特异性强，可用于双酚A的免疫检测。

Description

一种抗双酚A单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明是一种针对环境激素双酚A的单克隆抗体的制备方法，属于检测技术领域。

背景技术

双酚A(Biphenol A)，简称BPA，为2，2-双(4-羟基苯基)丙烷，结晶或白色鳞片，微有酚的气味。溶于碱溶液、乙醇、丙酮、乙酸、乙醚和苯，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。双酚A是由苯酚、丙酮在酸性介质中合成的，被广泛应用于饮料容器、餐具、婴儿奶瓶、奶嘴的生产以及作为牙齿密封剂、牙科填充剂的原料之一，是制造染料、机械仪表及医疗器械、罐头内包装、食品包装材料等的重要化工原料，在工业生产和人们的日常生活中用途广泛，应用非常普遍。

双酚A属于环境雌激素物质，在体内通过与雌激素受体结合或影响细胞信号传导途径等其它方式模仿或干扰内源雌激素作用，发挥雌激素样效应，对人的皮肤、呼吸道、消化道和角膜有刺激性。当体内的双酚A达到一定量时就会破坏肝细胞和肾细胞，造成慢性中毒，使人出现不同程度的头昏、头痛、皮疹、精神不安、腹泻等症状。

近年来由于大量含双酚A的产品进入人们的日常生活，特别是食用碳酸酯包装材料和广泛用于食品罐头金属容器和瓶盖环氧树脂涂层中的双酚A会溶入水中，直接进入人体，危害人类健康。国内外对市场产品的检测情况报道发现，聚碳酸酯水杯、奶瓶、奶嘴、桶装水(瓶)都含有双酚A。美国康涅狄格州和芝加哥市已经批准双酚A禁令：从2011年10月1日起，任何人不得在康涅狄格州生产、销售或分销以下产品：储存在含双酚A的塑料容器、瓶或罐中的婴幼儿配方乳或婴幼儿食品。欧盟、美国和日本都对双酚A建立了相关检测标准，其中，欧盟和美国的限量要求为0.6mg/kg，日本则规定双酚A的总溶出量不超过2.5μg/mL。目前，我国国家质量监督检验检疫总局已经开展对规定时间段内全国进出口聚碳酸酯类和环氧树脂类及其他相关的食品接触产品实施抽样检测实验室双酚A迁移量及游离酚等的专项普查活动。签于此，及时监测双酚A在水体中的溶出量显得尤为必要，同时，对双酚A检测方法的精度和效率也提出了很高的要求。

对于微量的双酚A的检测方法国内外有很多报道，主要包括紫外分光光度法、双波长分光光度法、气相色谱(GC)法、气相色谱-质谱(GC/MS)法、高效液相色谱(HPLC)法、高效液相色谱-紫外法(HPLC/UV)、液相色谱-质谱(LC/MS)法、反相液相色谱法、示波极谱法及荧光测定方法，这些方法虽然能对双酚A进行准确检测，但需要大型仪器设备、繁琐的样品前处理和特殊的条件，不适应现场测定。因此，出于常见生活制品可能含有双酚A的潜在危害性，建立快速适应现场并方便广大消费者可使用的检测方法是解决双酚A不安全事件的关键。

免疫学检测方法因其灵敏度高、特异性强、快速、经济等优点，非常适合双酚A残留的筛选检测。1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA测定灵敏、特异、操作简单、易于自动化、无放射性污染，且易与其他相关技术偶联，因此使其成为目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术。

目前，国内外有关于双酚A免疫检测研究的报道，而国内仅有的报道是用抗血清制成的双酚A多克隆抗体，没有双酚A单克隆抗体制备成功的报道。由于多克隆抗体特异性差，存在交叉反应，难以满足对双酚A微量进行监控分析的需要，因此如果能筛选到分泌双酚A抗体的单克隆细胞株，大量制备出双酚A的单克隆抗体，建立双酚A的免疫分析方法，则可以更有效的对双酚A进行监控，实现双酚A的快速、特异、灵敏的现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种双酚A单克隆抗体的制备方法，以双酚A为研究对象，通过合成双酚A人工抗原制备双酚A的单克隆抗体，建立检测双酚A的酶联免疫试验，用于双酚A的快速检测。

技术方案：

双酚A(Biphenol A)的相对分子量为228，属于环境激素，单独作用时不能刺激机体产生抗体，不具有免疫原性，只有与大分子载体结合成完全抗原才能刺激机体产生其特异性的抗体。本专利申请发明人已经成功进行了双酚A与牛血清白蛋白(BSA)以及双酚A与鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联。双酚A与牛血清白蛋白偶联物(BPA-BSA)作为免疫抗原免疫小鼠，使其产生抗体；双酚A与鸡卵清白蛋白偶联物(BPA-OVA)作为包被抗原固定于酶标板，用于检测抗体。免疫抗原和包被抗原都用紫外光谱和红外光谱法进行鉴定。免疫抗原注射入小鼠体内后，待检测血清效价达到要求后，制备脾细胞悬液，在50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以HAT培养基选择性培养融合细胞，经多次筛选和克隆后得到稳定分泌双酚A抗体的阳性杂交瘤细胞，所分泌抗体经检测属于IgG1亚类。间接ELISA检测发现阳性杂交瘤细胞的培养上清与载体蛋白OVA、BSA反应呈阴性，与合成的包被抗原(BPA-OVA)反应呈阳性，间接竞争ELISA检测发现双酚A能与细胞上清液内的抗体进行特异性结合，表明该单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗双酚A的。用扩增培养后的细胞株诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了双酚A单克隆抗体，聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度。以棋盘滴定法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，建立双酚A的间接竞争ELISA试验，结果显示试验IC50值为1.847μg/mL，线性检测范围为2.817ng/mL～1.212×10⁶ng/mL，最低检测限为0.324ng/mL；采用间接竞争ELISA法，选择苯、苯酚、叔丁基苯酚、对羟基苯酚和邻羟基苯甲酸5种含有苯环结构的化合物进行交叉反应试验，特异性研究表明获得的单克隆抗体与苯、苯酚、叔丁基苯酚、对羟基苯酚和邻羟基苯甲酸没有交叉反应。

制备方法：

首先合成出双酚A半抗原，再将双酚A半抗原分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白欧联，得到人工免疫抗原和人工包被抗原；将双酚A人工免疫抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，经杂交瘤技术检测和多次亚克隆后得到能稳定分泌双酚A抗体的阳性杂交瘤细胞。

具体的制备步骤如下：

a)双酚A人工免疫抗原和包被抗原的合成与鉴定：首先对双酚A进行结构修饰，引入羧基基团，采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合法将结构修饰了的双酚A分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备双酚A人工免疫抗原和包被抗原。紫外光谱、红外光谱法验证合成的人工免疫抗原和包被抗原。

b)双酚A单克隆抗体细胞株的制备及筛选：用合成的双酚A人工免疫抗原免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在质量浓度50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基(HAT)选择性培养融合细胞，间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验检测出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌双酚A抗体。

c)双酚A单克隆抗体的制备纯化：用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了双酚A单克隆抗体，聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度。

d)双酚A单克隆抗体的鉴定：阳性杂交瘤细胞分泌的双酚A单克隆抗体，经鼠单克隆抗体亚类试纸检测结果表明属于IgG1亚类，其轻链为Kappa。间接ELISA和间接竞争ELISA证实该类抗体只与双酚A有特异性结合，而不与载体蛋白反应，表明单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗双酚A的。

双酚A半抗原的结构式如下所示：

双酚A人工免疫抗原的结构式如下：

双酚A人工包被抗原的结构式如下：

本发明的有益效果：

本发明的优点是制备了双酚A的单克隆抗体，利用该抗体建立的酶联免疫试验，可用于双酚A的快速检测。这种抗双酚A的单克隆抗体可以弥补现有的多克隆抗体特异性差，存在交叉反应的问题，因此以抗双酚A的单克隆抗体建立双酚A的免疫分析方法，可以更有效的对双酚A进行监控，实现双酚A的快速、特异、灵敏的现场监测。

附图说明

图1是间接竞争ELISA法检测双酚A竞争抑制曲线。

图2其他含苯环结构的类似物对抗体抑制结果。

具体实施方式

I)双酚A人工免疫抗原和包被抗原的合成与鉴定：

首先对双酚A进行结构修饰，引入羧基基团，采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合法将结构修饰了的双酚A分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备双酚A人工免疫抗原和包被抗原。经紫外光谱、红外光谱对人工抗原进行鉴定，结果表明：合成的人工抗原紫外光谱图中具有蛋白质和双酚A的特征吸收峰，人工抗原红外光谱图中呈现双酚A和蛋白质的红外特征吸收峰，鉴定结果表明双酚A人工抗原合成成功。

II)双酚A单克隆抗体细胞株的制备及筛选：

用合成的双酚A人工免疫抗原按常规免疫方案免疫Balb/c小鼠，经间接ELISA检测小鼠效价达到要求后，选择血清效价最高的小鼠用于细胞融合。在质量浓度50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基(HAT)选择性培养融合细胞，间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验检测出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到能稳定分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

小鼠血清效价检测显示被免疫小鼠均产生了抗双酚A的抗体，其中产生的抗体效价最高达到了1∶10000以上。融合细胞经多次筛选和克隆后得到了阳性杂交瘤细胞，间接ELISA检测发现阳性杂交瘤细胞的培养上清与载体蛋白OVA、BSA反应呈阴性，与合成的包被抗原(BPA-OVA)反应呈阳性，间接竞争ELISA检测发现双酚A能与细胞上清液内的抗体进行特异性结合，表明该单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗双酚A的。小鼠单抗亚类检测试纸检测表明细胞所分泌抗体属于IgG1亚类。

III)双酚A单克隆抗体的制备纯化及双酚A免疫检测方法的建立：

用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了双酚A单克隆抗体，聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度。以棋盘滴定法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，初步建立了双酚A的间接竞争ELISA试验，并选择苯酚、对苯二酚、水杨酸和叔丁基苯二酚4种含有苯环结构的化合物进行交叉反应试验以研究该双酚A单克隆抗体的特异性。高效价细胞株成功诱导Balb/c小鼠产生腹水，其效价达到1∶64000以上。分别以2μg/mL包被抗原和1μg/mL单克隆抗体的工作浓度，初步建立了双酚A的间接竞争ELISA试验，结果显示试验IC50值为1.847μg/mL，线性检测范围为2.817ng/mL～1.212×10⁶ng/mL，最低检测限为0.324ng/mL。特异性研究表明获得的单克隆抗体与苯酚、对苯二酚、水杨酸、叔丁基苯二酚没有交叉反应。

双酚A作为一种小分子量环境激素，本身没有免疫原性，因此首先对双酚A进行结构修饰，引入羧基基团，进一步采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合法将结构修饰了的双酚A分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备双酚A人工免疫抗原和包被抗原，经鉴定人工包被抗原和免疫抗原成功合成后免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在质量浓度50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基(HAT)选择性培养融合细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到能稳定分泌双酚A抗体的阳性杂交瘤细胞，经检测其分泌的抗体属于IgG1亚类。间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验鉴定表明该细胞分泌的抗体是特异性抗双酚A的。用扩增培养后的高效价阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了双酚A单克隆抗体，聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度。以棋盘滴定法确定包被抗原和单克隆抗体的工作浓度后，建立双酚A的间接竞争ELISA试验，同时选择苯酚、对苯二酚、水杨酸和叔丁基苯二酚4种含有苯环结构的化合物进行交叉反应试验，特异性研究表明该双酚A单克隆抗体与苯酚、对苯二酚、水杨酸和叔丁基苯二酚没有交叉反应。

具体实施如下：

I)双酚A人工免疫抗原和包被抗原的合成与鉴定：

a)双酚A半抗原的合成

将1.37g双酚A和0.67g无水氯化铝投入到三口烧瓶中，称取0.47g氯乙酸溶于8ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢滴入三口烧瓶，低温下搅拌至反应趋于缓和，逐渐升高温度，反应至不再生成气体为止。溶液即含有半抗原物质。

b)人工免疫抗原的合成

将a中得到的半抗原溶液冷却，过滤，称取0.0575g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.0958g碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于2ml DMF中，与滤液混合搅拌反应2h。再称取0.1g BSA溶于3ml pH 7.0磷酸缓冲溶液中，并将上述反应液缓慢滴加到其中，4℃下反应2h，离心分离10min，上清液转移到透析袋，用pH 7.0磷酸缓冲溶液和蒸馏水各透析36h，每12h换一次透析液，最后将透析液冷冻干燥得到双酚A人工免疫抗原。冻存于-20℃冰箱中，供免疫用。

c)人工包被原的合成

将a中得到的半抗原溶液冷却，过滤，称取0.0575g NHS和0.0958g EDC·HCl溶于2ml DMF中，与滤液混合搅拌反应2h。再称取0.1g OVA溶于3ml pH 7.0磷酸缓冲溶液中，并将上述反应液缓慢滴加到其中，4℃下反应2h，离心分离10min，上清液转移到透析袋，用pH 7.0磷酸缓冲溶液和蒸馏水各透析36h，每12h换一次透析液，最后将透析液冷冻干燥得到双酚A人工包被抗原。冻存于-20℃冰箱中，供包被用。

d)紫外光谱鉴定：

分别取等量的牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白和合成的免疫抗原、包被抗原溶于PBS缓冲液中，均配制成0.5mg/mL的溶液，然后对其进行190～400nm的紫外扫描。结果表明，BSA在278nm处有蛋自质的特征吸收峰；双酚A的吸收峰分别出现在226nm和276nm处；双酚A人工免疫抗原和包被抗原均保留了双酚A在226nm处的特短吸收峰，在278nm处也出现了特征吸收峰，这说明合成的双酚A人工抗原兼具了载体蛋白质和双酚A的特征，表明了偶联成功。

e)红外光谱鉴定：

BSA的红外光谱呈现出蛋白质类共有的吸收，如3305.6cm^-1的胺基N-H伸缩振动吸收峰、1657.4cm^-1的酰胺谱带(C＝O伸缩振动)和1536.2cm^-1的酰胺谱带(N-H弯曲振动)等。双酚A人工免疫抗原和包被抗原均在3425.7cm^-1处左右出现O-H伸缩振动吸收峰，1641.2cm^-1和1376.5cm^-1左右出现了C＝O和C-N特征吸收峰，说明生成了酰胺；1000～1200cm^-1出现的宽且强的酚的C-O伸缩振动吸收峰，而BSA的IR中并无此吸收峰，说明人工免疫抗原和包被抗原均同时具备了蛋白质和双酚A的特征，据此可以确定双酚A人工免疫抗原和包被抗原制备成功。

II)双酚A单克隆抗体细胞株的制备及筛选

a)小鼠免疫：

选用健康SPF级6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，常规免疫方案分批免疫：将人工免疫抗原用PBS缓冲液配制成1mg/mL的溶液。第一次免疫，将免疫抗原PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，抽取混匀的乳液进行腹腔注射，每只小鼠的注射量为200μL，含免疫抗原100μg；两周后进行第二次免疫，注射方法、注射体积及抗原剂量不变，但改用弗氏不完全佐剂；以后按照第二次免疫方案以两周为间隔进行免疫；第三次免疫一周后，从小鼠尾部取100～200μL血，通过间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价：待效价达到至少1∶10000后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐剂对小鼠进行腹腔注射以强化免疫。

b)杂交瘤细胞的制备：

细胞融合前一天取小鼠腹腔细胞做饲养细胞，数量适中为宜。细胞融合当天取免疫小鼠摘除眼球放血处死，收集血清作为阳性血清对照，制备免疫脾细胞悬液，RPMI-1640培养基调整脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的数量比侧为10∶1。加入1mL 37℃预热的50％聚乙二醇，1min内加完。加完后用RPMI-1640培养基终止聚乙二醇的作用并静置5min。1000rpm离心5min收集细胞，用HAT选择培养基悬浮细胞，分装96孔细胞培养板，每孔加入100μL。融合后每3～4天半换液一次。7～8天后饲养细胞和骨髓瘤细胞明显退化死亡，用HT培养基取代HAT培养基，每3～4天半换液一次。约一周左右出现杂交瘤细胞克隆，细胞大、圆且透亮，在培养板的盖板上记录下克隆生长的标记。如果克隆生长的细胞孔数太多，则记录下没有克隆生长的孔。待杂交瘤细胞克隆扩增至孔底1/5以上时，取上清液用间接ELISA法检测相应的特异性抗体。

c)双酚A单克隆抗体细胞株的筛选及鉴定：

融合细胞后细胞共分装到5块96孔细胞培养板里培养，经观察共有475孔里有杂交瘤细胞生长。取杂交瘤细胞培养上清液进行间接ELISA检测，结果表明，有21孔呈阳性。因此，融合率达到了98.96％，阳性率达到了4.42％。

对筛选出的21孔阳性孔细胞进行竞争抑制试验，挑选出其中阳性吸光值较高、抑制效果较明显的细胞进行有限稀释法克隆或亚克隆，每次均进行间接ELISA和竞争ELISA试验筛选阳性克隆，最终得到能稳定分泌双酚A抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

间接ELISA检测得到的单克隆杂交瘤细胞结果表明：分别以包被抗原、载体蛋白BSA和OVA包被酶标板，细胞株的培养上清与载体蛋白BSA和OVA反应均为阴性，故上清液中不含有抗载体蛋白BSA和OVA的抗体；上清液与包被抗原反应呈阳性，表明上清液中可能含有抗双酚A的抗体。间接竞争ELISA检测中，双酚A溶液与细胞的培养上清均能发生发生免疫反应。以双酚A浓度为横坐标(10为底的对数值表示)，抑制率为纵坐标作图，其中抑制率＝(对照孔的吸光度值-不同双酚A浓度孔吸光度值)/(对照孔的吸光度值-空白孔的吸光度值)×100％，可算得双酚A对细胞株培养上清的半数抑制浓度IC50为1847.86ng/mL，由此说明上清液中含有可与双酚A竞争结合的抗体，表明该细胞株就是预期的特异性单克隆抗体分泌细胞株。

用鼠单克隆抗体亚类试纸检测细胞株培养上清，鉴定结果表明双酚A单克隆抗体细胞株所分泌的抗体为IgG1亚类，轻链为Kappa。

III)双酚A单克隆抗体的制备纯化及双酚A免疫检测方法的建立

a)双酚A单克隆抗体的制备及纯化

取10周龄、雌性Balb/c小鼠2只，每只腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂。一周后取经扩增培养并处于对数生长期的高效价阳性杂交瘤细胞株，10mLPBS悬浮后计数细胞，每只小鼠腹腔注射1.0×10⁶个细胞。接种后10天左右，小鼠腹部明显膨大，产生腹水，此时用一次性注射器无菌采集腹水，2000rpm离心10min后腹水分为三层，用吸管小心收集中层，0.45μm微孔滤膜过滤后分装，-20℃冻存备用。

采用辛酸-硫酸铵沉淀法(caprylic acid-ammonium sulphate precipitation，CAASP)纯化抗体。取上述已经预处理过的腹水1mL注于小烧饼内，加入3mL60mmoL/L乙酸缓冲液(pH4.0)稀释混匀，磁力搅拌下在30min内缓慢滴加33μL正辛酸，浓氨水调pH值至4.5～4.8，继续搅拌30min后，10000g离心30min，弃沉渣，收集上清液经0.45μm微孔滤膜过滤并定量体积后，加入1/10的20mmoL/L PBS缓冲液(pH7.4)，浓氨水调pH值至7.4。磁力搅拌下缓慢滴加饱和硫酸铵溶液至饱和度为45％，用浓氨水调液体pH值至7.4，冰浴下磁力搅拌1～2h，随后4℃、10000g离心30min，弃上清液，沉淀用1mL20mmoL/L PBS缓冲液(pH7.4)溶解，4℃、15000g离心30min，除去不溶性沉渣，上清即为纯化提取的双酚A单克隆抗体，分装后-20℃冻存备用。纯化小鼠腹水得到的单克隆抗体经聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度。

b)基于双酚A单克隆抗体的双酚A免疫检测方法的建立

①双酚A的间接竞争ELISA试验

用棋盘滴定法对间接竞争ELISA法的抗原、抗体的工作浓度进行筛选，包被抗原和单克隆抗体的最适工作浓度分别为2μg/mL和1μg/mL。

用确定工作浓度的包被抗原包被酶标板，作系列梯度浓度的双酚A溶液(1×10⁵μg·L^-1、1×10⁴μg·L^-1、1000μg·L^-1、100μg·L^-1、10μg·L^-1、1μg·L^-1)的间接竞争ELISA，根据抑制率与双酚A浓度之间的关系作标准曲线，其中横坐标为双酚A溶液并以10为底的对数值表示，纵坐标为相应浓度下双酚A对单克隆抗体的抑制率。抑制率与双酚A浓度呈负相关，图形为典型的S型曲线，其头、尾部趋于平坦，抑制率在20％～80％之间的中央部分较陡呈直线型，回归方程y＝0.1065Lg(x)+0.1521，(R²＝0.9736)，由回归方程得出双酚A对该抗体的半数抑制浓度IC50为1.847μg/mL，线性检测范围为2.817ng/mL～1.212×10⁶ng/mL，最低检测限(抑制率为10％时的浓度值)为0.324ng/mL，低于常规气相色谱法对双酚A的仪器检出限，比多克隆抗体的最低检出限低了1～2个数量级。(图1)

②双酚A单克隆抗体对其他苯环结构化合物的交叉反应

以纯化后的单克隆抗体作研究对象，以不同浓度的苯酚、对苯二酚、水杨酸和叔丁基苯二酚等含有苯环结构的化合物代替双酚A，然后以化合物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作标准曲线，分别求出各种农药对单克隆抗体的半数抑制浓度IC50，并求出交叉反应率：交叉反应率＝(双酚A对单克隆抗体的IC50/其他化合物的IC50)×100％，苯酚、对苯二酚、水杨酸和叔丁基苯二酚标准溶液的最大试验浓度均为1.0×10⁷ng/mL，试验中发现苯酚、对苯二酚和叔丁基苯二酚最大试验浓度的吸光度值和其他系列浓度的吸光度值没有太大变化，相比没有加这些化合物的对照孔也没有变化，说明这三种化合物对双酚A单克隆抗体没有抑制作用，IC50大于1.0×10⁷ng/mL，以双酚A对纯化后单克隆抗体的交叉反应率为100％，计算这三种化合物与双酚A的交叉反应率均小于0.01％。试验中发现水杨酸对双酚A单克隆抗体的IC50为6309.57μg/mL，以双酚A对纯化后单克隆抗体的交叉反应率为100％，计算出苯酚与双酚A的交叉反应率为0.03％。(图2)

Claims

1.一种抗双酚A单克隆抗体的制备方法，其特征在于首先合成出双酚A半抗原，再将双酚A半抗原分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白欧联，得到人工免疫抗原和人工包被抗原；将双酚A人工免疫抗原免疫小鼠制备脾细胞悬液，在聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，经杂交瘤技术检测和多次亚克隆后得到能稳定分泌双酚A抗体的阳性杂交瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的双酚A单克隆抗体的制备方法，其特征在于具体的制备步骤如下：

1)双酚A人工免疫抗原和包被抗原的合成：首先对双酚A进行结构修饰，引入羧基基团，采用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合法将结构修饰了的双酚A分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白偶联制备双酚A人工免疫抗原和包被抗原；

2)双酚A单克隆抗体细胞株的制备及筛选：用合成的双酚A人工免疫抗原免疫小鼠，制备脾细胞悬液，在质量浓度50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷培养基选择性培养融合细胞，间接酶联免疫吸附试验检测和间接竞争酶联免疫吸附试验检测出阳性杂交瘤细胞，再经过多次有限稀释克隆后得到的阳性杂交瘤细胞能稳定分泌双酚A抗体；

3)双酚A单克隆抗体的制备纯化：用扩增培养后的阳性杂交瘤细胞诱导Balb/c小鼠产生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了双酚A单克隆抗体，聚丙烯酰氨凝胶电泳检测纯化后抗体的纯度；

4)双酚A单克隆抗体的鉴定：阳性杂交瘤细胞分泌的双酚A单克隆抗体，经鼠单克隆抗体亚类试纸检测结果表明属于IgG1亚类，其轻链为Kappa；间接ELISA和间接竞争ELISA证实该类抗体只与双酚A有特异性结合，而不与载体蛋白反应，表明单克隆细胞分泌的抗体是特异性抗双酚A的。