CN104762266A - 杂交瘤细胞bpa-4c7及其产生的双酚a单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杂交瘤细胞株4C7、其分泌产生的抗双酚A单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株4C7可以用于制备高效价双酚A抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.12×10⁶；该抗双酚A单克隆抗体灵敏度高，对双酚A的50％抑制浓度即IC50为0.28μg/L，其用于测定双酚A含量，实际应用价值大。

Description

杂交瘤细胞BPA-4C7及其产生的双酚A单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株BPA-4C7及其产生的双酚A单克隆抗体。 

背景技术

双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种具有雌激素活性的物质，会扰乱人体内的代谢过程。双酚A能引起生殖器官异常、使雄性雌性化，还可能诱发某些癌症。从2011年3月1日起已被欧盟禁止在生产婴儿奶瓶的塑料中使用，中国从2011年6月1日起禁止生产含双酚A的婴幼儿奶瓶。双酚A是重要的化工原料，是制造聚碳酸酯、环氧树脂、聚树脂等的前体物质，广泛用于食品包装材料、容器内壁涂料等日常生活中经常接触的材料，可通过包装容器和塑料薄膜渗入食品或饮料进行体内。即使很低的剂量BPA也能使动物产生雌性早熟、精子数下降、前列腺增长等。BPA还具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。

目前，食品包装材料及食品中双酚A以痕量水平存在，因此其检测技术主要采用精密仪器分析法进行。检测方法主要采用液相色谱法、气相色谱－质谱法以及液相色谱－串联质谱法。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高。酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法具有检测范围宽、灵敏度高、特异性好、成本低、对操作人员要求也低。但要研究建立针对双酚A（BPA）的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗双酚A（BPA）的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株BPA-4C7及其产生的双酚A（BPA）的单克隆抗体。

本发明提供了杂交瘤细株BPA‐4C7，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10201分类命名为S/P20杂交瘤细胞。

抗双酚A单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10201的杂交瘤细胞株BPA‐4C7分泌产生。该BPA单克隆抗体可以识别双酚A，对双酚A的50％抑制浓度IC50为0.28μg/L。

抗双酚A单克隆抗体在双酚A测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株BPA-4C7单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是：以BPA在4-溴丁酸乙酯作用下生成BPA羧酸酯，再水解生成BPA羧酸，在EDC和NHS存在的条件下和BSA偶联生成BPA-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的BPA-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗双酚A而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用BPA作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞BPA-4C7。

本发明提供的双酚A单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株BPA-4C7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗双酚A的单克隆抗体。

上述纯化方法的具体操作为：腹水于4℃，3000r/min 离心 5min 以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合 30min，4℃静置 2h以上，使其充分沉淀。然后 4℃，12000r/min离心 30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入 1/10 滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用 2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至 7.4，4 ℃预冷1小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4℃静置 2h以上，然后 4℃ 12000r/min离心 30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液 ：0.29g 醋酸钠加入 0.141mL 醋酸，纯水定容至 100mL ；

0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 ： 0.8g 氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g 氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至 100mL。

0.01mol/L 磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释10倍。

本发明的有益效果在于：

1 本发明提供的杂交瘤细胞BPA-4C7可以用于制备高效价的抗双酚A单克隆抗体，将双酚A小鼠腹水抗体酶联免疫吸附方法测定的效价达到3.12×10⁶，即腹水稀释至3.12×10⁶时溶液测定结果仍为阳性。

2 本发明提供的双酚A单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对双酚A的半抑制浓度IC50为0.28 μg/L，与双酚酸的交叉反应率103%，与双酚C的交叉反应率9.9%，与己烯雌酚的交叉反应率<1%。

3 本发明提供的抗双酚A的单克隆抗体可用于测定双酚A的含量。

附图说明

     图1 BPA-4C7单克隆抗体对BPA的检测标准曲线。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株BPA-4C7的筛选

1.     抗原的合成及动物的免疫

BPA通过活化得到BPA羧酸酯，水解得到BPA羧酸，再在EDC和NHS存在的条件下与载体蛋白发生偶联反应，得到相应的人工抗原。

BPA羧酸的合成 

将1.14g BPA溶于30mL丙酮，加入276mg碳酸钾。将143μL 4-溴丁酸乙酯溶于1mL丙酮，然后将该溶液滴加到沸腾的BPA 溶液中，得到化合物A。将18mg化合物A溶于2mL乙醇，然后将1M氢氧化钠溶液（0.5ml）加入其中。反应液在油浴中加热回流1小时。压蒸馏得到产物的钠盐。用水（2ml）将粗品溶解，用2M 盐酸调至pH=2，然后用乙酸乙酯萃取（2mLx4），乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，吹干得到BPA的羧酸（白色晶体12mg）。

人工抗原的合成

取将12mg干燥的BPAB溶于1.2ml的DMF中配制成10mg/ml 溶液备用。将EDC(85mg)和NHS(27mg)溶于DMF(0.6ml)中，取配置好的BPAP溶液（0.6ml）滴加到EDC的溶液中，室温震荡24个小时得到活化的BPAP溶液。在3ml的棕色试剂瓶中加入0.282ml的硼酸-硼砂缓冲液（0.2M, pH=7.4)和0.718ml的BSA液（50mg/ml), 然后将活化好的BPAP溶液（0.4ml）滴加到BSA溶液中，室温搅拌20个小时。反应完成后，用2L PBS透析3次，每次一天。最后将透析袋中的液体收集，-20℃保存。

人工抗原的鉴定

通过紫外光谱扫描法及质谱鉴定表明制备得到了双酚A的完全抗原BPA-BSA。

购买 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠 6 只，免疫自行合成的双酚A的完全抗原BPA-BSA。第一次免疫将完全抗原BPA-BSA与等量弗氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积完全抗原BPA-BSA 乳化，免疫剂量与方法与首免相同。第三次免疫与第二次免疫间隔时间3周，免疫剂量和方法与第二次相同。第四次免疫于第三次免疫 3 周后进行，免疫方式及免疫剂量与第三次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠 30μg。前 3 次每次免疫后一周，眼周采血，分离血清，采用间接 ELISA 法监测小鼠血清抗体效价。第 4 次免疫后3天，尾静脉采血，分离血清，采用间接 ELISA 法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争 ELISA 法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的 2 倍。

2.     细胞融合

最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分比）的聚乙二醇（PEG，分子量1460）作融合剂，按常规方法进行细胞融合。具体步骤如下：

将BALB/c小鼠脱颈处死，浸泡于75%酒精中。约3 min后放入超净台。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用手术剪剪一个小口(注意勿剪破腹膜)，然后用镊子向头、尾两个方向撕开皮肤，充分暴露腹膜。换用干净剪刀剪开腹膜，取出脾脏，放入已盛有10mL不完全培养液的平皿中清洗一次，并剥去结缔组织。将脾脏转入另一盛有5 mL不完全培养液的平皿中，取一铜网，将脾脏置于铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内的不完全培养液冲洗铜网，使脾细胞全部通过网孔进入溶液中。将脾细胞溶液转入50 ml离心管中，加不完全培养液至30 mL，混匀。1000 rpm离心5 min，弃上清。沉淀细胞再用不完全培养液离心一次，然后将细胞悬于10 ml完全培养液中，混匀。细胞计数，备用。

将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合，在50 mL离心管中用DMEM培养基洗1次，1200 rpm离心8 min；弃上清，用吸管吸净残留液体。用50%PEG融合，用含20%牛血清、1% HAT DMEM培养基重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。DMEM培养基为含有2%（重量百分数）生长因子的DMEM基础培养基，DMEM基础培养基购于Hyclone公司，1%HAT（次黄嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶核苷购于Gibco公司。

3.     细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第 10天左右，细胞集落长到占孔底 1/2面积大小，即可进行抗体检测。采用 ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接 ELISA 法筛选出抗双酚A而不抗载体蛋白 BSA 的阳性孔 ；第二步采用间接竞争 ELISA 法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用双酚A作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为 0 的孔即阴性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为 50% 时的竞争原浓度亦即 IC 50 值较小），采用有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化，克隆后 10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆 2次后，获得杂交瘤细胞株BPA-4C7。

实施例2：抗体的制备、纯化及鉴定

将实施例1获得的将获得的杂交瘤细胞株BPA-4C7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗双酚A的单克隆抗体。

具体操作为：腹水于4℃ 3000r/min 离心 5min 以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合 30min，4℃静置 2h，使其充分沉淀。然后 4℃ 12000r/min离心 30min，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入 1/10 滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至 7.4，4 ℃预冷1小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4℃静置 2h，4℃ 12000r/min离心 30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液 ：0.29g 醋酸钠加入 0.141mL 醋酸，纯水定容至 100mL ；

0.1mol/L 磷酸盐缓冲液：0.8g 氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g 氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至 100mL。

0.01mol/L 磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释10倍。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得4C7的鼠腹水抗体的效价可达3.12×10⁶，即腹水稀释至3.12×10⁶时测定结果为阳性。用常规间接竞争 ELISA法鉴定其对双酚A的半抑制浓度IC50为0.28 μg/L，双酚酸的交叉反应率103%，与双酚C的交叉反应率9.9%，与己烯雌酚的交叉反应率<1%。

实施例3：抗体的应用

将杂交瘤细胞株BPA-4C7分泌的抗双酚A单克隆抗体用于双酚A单克隆ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）       包被：使用96孔聚苯乙烯酶标板，用0.05mol/L pH 9.6 的碳酸缓冲液将BPA-BSA稀释到1μg/mL，用多道可调式移液枪（简称排枪）往每孔中加入100μL，加完后将酶标板用保鲜膜盖住，置于4℃过夜。

（2）       洗板：第二天，将酶标板从4℃取出，使用PBST洗涤，每孔250μl，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。

（3）       封闭：用排枪往每孔中加入200μL 1% BSA的PBS，加完后将酶标板用盖盖住，置于37℃放置2h。使用PBST洗涤，每孔250μl，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。

（4）       用10%甲醇配制0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 μg/mL的双酚A标准溶液。将标准溶液及待检测样品提取液，分别加入已经封闭好的酶标板中，50mL/孔，每个样品3个重复孔，再加入稀释成1：8000双酚A单克隆抗体50mL/孔，加入稀释成1：4000酶标二抗50mL/孔，轻轻拍打酶标板后37℃恒温箱中反应40min。

（5）       洗板：操作同上。

（6）       显色：将显色液A和显色液B按1：1的体积比混合，用排枪加入混合好的显色液100mL/孔，置37℃恒温箱避光环境反应10min。

（7）       测定：使用排枪加入2mol/L H₂SO₄ 50mL/孔，轻轻振荡酶标板，使用酶标仪检测450/630nm波长处OD值。

（8）       添加回收率及样品前处理：称取4.5g 水样置于干净的50mL 玻璃三角瓶中，分别添加0.45、2、8μg BPA，加入0.5mL样品稀释液，盖上盖后振荡5min，作为ELISA样品提取液待测。采用直接竞争ELISA进行添加回收率实验，回收率分别为106.8、81.5、101.3%。

（9）       溶液的配置： 碳酸缓冲液：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加入纯水至990mL，调pH至9.6，再用纯水定容至1000mL，4℃贮存备用。 磷酸缓冲液（PBS）： 8.5g NaCl，2.2g Na₂HPO₄12H₂O，0.2g NaH₂PO₄2H₂O，溶于900mL纯水中，调pH至7.4，定容至1000mL。 PBST：取500mL PBS，加入0.25mL 吐温20，混匀备用。

显色液A：20mg TMB溶于10mL DMSO中，4℃保存，临用前取出恢复至室温，用纯水稀释至100mL。

显色液B：21g 一水合柠檬酸，71.1g Na₂HPO₄12H₂O，2g 过氧化氢尿素，加纯水定容至1000mL。

样品提取液：取4g NaCl，溶于30mL水中，再加入70mL甲醇，混匀待用。

酶标二抗购自于SoutherBiotech公司。

Claims (3)

1.杂交瘤细胞株BPA-4C7，其特征在于：已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 10201。

2.权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株BPA-4C7分泌的抗双酚A单克隆抗体，其特征在于：它由所述的杂交瘤细胞株BPA-4C7所分泌产生。

3.权利要求 2 所述的抗双酚A单克隆抗体的应用，其特征在于在双酚A分析检测中的应用，对双酚A 具有较好的亲和力和检测灵敏度，用于食品安全中双酚A 免疫检测。