CN101451999A - 一种检测隐性孔雀石绿直接竞争elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测隐性孔雀石绿直接竞争ELISA试剂盒。本发明所提供的检测隐性孔雀石绿的酶联免疫试剂盒包括隐性孔雀石绿多克隆抗体、隐性孔雀石绿半抗原及完全抗原和酶标抗原。本发明的检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测水产品中残留的隐性孔雀石绿。

Description

一种检测隐性孔雀石绿直接竞争ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全领域中涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种适用于检测水产品中隐性孔雀石绿残留的ELISA试剂盒。

技术背景

孔雀石绿(Malachite green)分子式为：C₂₃H₂₅ClN₂，是一种工业用三苯甲烷triphenylmehtane类染料，由于具有抗菌及抗格兰氏阳性菌的功效，且价格便宜，所以被广泛运于养殖渔业之预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。当养殖水含有孔雀石绿时，鱼体、虾等会快速吸收孔雀石绿进而代谢成为隐性孔雀石绿(Leμcomalachite green，LMG)，即N，N-二甲基苯胺，分子式：C₂₃H₂₆N₂，隐色孔雀石绿不溶于水，残留毒性比孔雀石绿更强，可囤积在肌肉中长达数月。近年来有关此类染料的毒理研究发现：孔雀石绿及其主要代谢物隐性孔雀石绿具有多重毒性，包括致癌性、致基因突变、引起染色体断裂、致畸胎及呼吸道毒性。鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。

因为水产品(鱼肉、虾等)具有营养齐全、平衡的特点，越来越受到人们的青睐。到1996年，我国水产品产量已超过2000万吨，占全国肉类食物生产总量的1/3，跃居世界第一位。随着人民生活水平的提高，对水产品的数量和质量有了更新的要求。然而，我国渔业发展面临着一系列新的挑战，其中食品安全问题在一定程度上严重制约了我国渔业的产业化发展，而违法添加孔雀石绿是目前最突出的问题。

农业部新闻办公室发布了2007年第一次水产品质量安全的监测结果。今年上旬，农业部组织有关质检机构对我国22个城市水产品中孔雀石绿污染情况进行了本年度第一次例行监测，10个城市均有样品检出了孔雀石绿。由于巨大利益的驱动，很难真正有效的控制杜绝孔雀石绿，这也就意味着对孔雀石绿检测需求是长期的。

目前国际上对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的检测技术路线主要有两条：一条是以色(质)谱技术为核心的化学检测技术，另一条是快速生物检测技术。高效液相色谱法成本高，操作时间长，步骤多且复杂，因此无法实现真正意义上的现场检测。而ELISA检测法灵敏度高、快速特异性强、稳定性好、操作简便、分析结果准确等优点，容易被基层掌握并大面积推广，适合于大批量样品的现场快速检测，适合我国当前社会经济技术水平，因此是未来孔雀石绿检测的主要发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用ELISA直接竞争法快速检测隐性孔雀石绿残留的试剂盒。

本发明提供了一种快速检测隐性孔雀石绿残留的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的隐性孔雀石绿。所述的隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体为隐性孔雀石绿半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔、鼠)制得。所述的隐性孔雀石绿半抗原是采用化学方法使其含有活性基团，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的隐性孔雀石绿-载体蛋白偶联物采用混合酸酐法、活泼酯法或碳二亚胺法偶联得到。所述标记隐性孔雀石绿的酶可以用商品化的辣根过氧化物酶，通过混合酸酐法、活泼酯法或碳二亚胺法将辣根过氧化物酶与隐性孔雀石绿偶联制得。

用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。

为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括：真空包装可拆96孔酶标板、系列标准液、酶标抗原、显色液A和B、20×浓缩洗涤液、样品稀释液和终止液。

所述的20×浓缩洗涤液为含1.0％吐温-20的0.2mol/L磷酸缓冲液，显色液由显色液A和显色液B组成，显色液A为加入过氧化氢或过氧化脲的溶液，显色液B为加入四甲基联苯胺(TMB)的溶液，样品稀释液为0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸缓冲液，标准液为精确称量10mg，先用二甲基甲酰胺0.1mL溶解，然后用1×PBS缓冲液稀释到10mL，用1×PBS缓冲液配制系列浓度为0，0.1，0.3，1.0，3.0，9.0ng/mL的隐性孔雀石绿标准液。

另一方面，本发明还提供了一种检测水产品中隐性孔雀石绿残留量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理取5g样品(鱼肉/虾)绞碎置入50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯均质，以4000g离心5分钟，取5mL上清液置入玻璃管中，于60℃下以氮气吹干，于此玻璃管中加入1mL正己烷和1mL蒸馏水，振荡混匀2分钟，室温4000g离心10分钟，取100μL下层液，经样品稀释液稀释5倍，待测。

(2)用权利要求1所述的试剂盒进行检测向包被有隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体的微孔酶标板中加入标准品或(1)中所得的样品待测液50μL/孔，再加入辣根过氧化物酶标记的隐色孔雀石绿溶液50μL/孔；轻微震荡30秒后于37℃下孵育30分钟；加入洗液300μL/孔，洗涤5次后拍干；将显色液A和B以1∶1混合，轻轻震荡混匀，每孔加入混合后的显色液100μL，室温下避光显色15分钟；每孔加入终止液50μL，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔的OD值。

(3)检测结果分析  计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中隐性孔雀石绿的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中隐性孔雀石绿的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样品中隐性孔雀石绿的浓度范围。

有益效果

本发明的检测隐性孔雀石绿的试剂盒，采用直接竞争酶联免疫测定法、定量检测样品中隐性孔雀石绿残留量；对样品的前处理要求低、处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

本发明中试剂盒采用隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体包被的微孔酶标板，主要试剂以工作液形式提供，试剂盒的操作步骤简单，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在水产品检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为隐性孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒结构图

图2为BSA-半抗原的偶联物(免疫原)的紫外扫描图

图3为隐性孔雀石绿(单抗)标准抑制曲线

图4为隐性孔雀石绿(多抗)标准抑制曲线

具体实施  提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

实施例1 半抗原及完全抗原(免疫原)合成

1.1 试剂与仪器

隐性孔雀石绿(北京化学试剂有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)、钥孔铜兰蛋白(KLH)等(购自北京鼎国生物技术有限公司)，所用试剂均为化学纯或分析纯。

Yanco显微熔点仪(温度计未校正)；Bruker AMX-300核磁共振仪(IMS为内标，CDCl₃为溶剂)。双光束紫外可见分光光度仪(TM-1909，北京普析通用仪器有限公司)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm，最大离心力12100rcf，2mL×12)，ZS-2自动板式酶标仪(北京新风机电技术公司)，隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)，电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司)，0.5-10μL、5-50μL、20-200μL、100-1000μL单通道连续可调移液枪(上海仪器有限公司)。

1.2 半抗原的合成

1.2.1 实验步骤

1.2.2 对隐性孔雀石绿乙酮的制备

在100mL三颈瓶中加入20mL二氯甲烷，18g(0.135mol)无水三氯化铝。冰盐浴冷却至-10℃，滴加7.1g(0.07mol)醋酐和21.61g(0.065mol)隐性孔雀石绿的混合液，控制内温不超过-5℃。滴加完毕后，继续搅拌15h，溶液从黄色变成暗红色。将反应液倾入50mL浓盐酸和50g碎冰的混合物中，然后用分液漏斗分出水层，并用二氯甲烷萃取两次。合并有机相，用水洗至中性，无水硫酸钠干燥。蒸馏除去溶剂得黄色油状物9.8g。粗品可直接用于溴仿反应。

1.2.3 对隐性孔雀石绿甲酸的制备

氢氧化钠6.3g溶于54mL水中，冷却至-5℃。滴加溴6.4g(0.04mol)，控制内温不超过0℃。然后将对隐性孔雀石绿乙酮粗品5.04g滴加至反应液中，控制内温不超过10℃。滴加完毕，保温1h，然后于室温搅拌2h。静置分层，分去生成的溴仿。水层用浓盐酸调至pH1～2，析出白色固体。抽滤，水洗至中性。将固体溶于20mL氢氧化钠溶液(5％)中，过滤，浅黄色澄清液体用浓盐酸调至pH1～2，析出白色晶体。抽滤，水洗至中性，烘干，得白色晶体1.7g，收率81％(按隐性孔雀石绿计)。m.p.117～120℃。HNMR(300MHz，CDCl₃)，δ：1.28(d，6H，J＝6.9Hz)；2.99(m，1H，J＝6.9Hz)；7.33(d，2H，J＝8.3Hz)；8.05(d，2H，J＝8.3Hz)。

1.3 免疫原的合成

活泼酯法制备免疫原是这样实现的：取等摩尔量的隐性孔雀石绿半抗原和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，环二己基碳二亚胺(DCC)，用二甲基甲酰胺(DFM)将混合物溶解，室温下避光反应过夜，离心去处沉淀后，取上清液干燥，取其225μL加入含250mgBSA的8mL碳酸盐缓冲液(Ph9.6含5％甲醇)中，混合物在4℃下磁力搅拌2小时，在4℃条件下透析过夜4次(pH7.4的磷酸盐缓冲液)，经紫外扫描仪进行全波长扫描鉴定偶联结果。

图2为采用活泼酯法制备的BSA-半抗原的偶联物(免疫原)的紫外扫描图，图中三种物质由上到下分别是载体蛋白BSA、载体蛋白BSA-半抗原的偶联物、半抗原的紫外吸收图谱，从图中可看出载体蛋白BSA特征吸收峰在278nm处，半抗原特征吸收峰在260nm处，载体蛋白BSA-半抗原的偶联物特征吸收峰在255nm处，偶联物特征峰发生漂移。

实施例2 抗体的制备及效价检测

2.1 抗体的制备

多抗制备选取3只体重2～2.5kg健康雄性新西兰大白兔，以BSA-半抗原为免疫原与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按1mg/kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1mL，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4℃过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析得隐性孔雀石绿多克隆抗体。

单抗制备  以BSA-半抗原为免疫原，免疫4只BALB/C小鼠，每只小鼠取100μg免疫原，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化均匀，沿腹股沟注入腹腔膜内。4个周后，加强免疫，剂量不变，佐剂改为弗氏不完全佐剂。加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后在无菌条件下取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10：1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1200r/min离心10min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL 50％ PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min。沿管壁缓慢加入无血清培养基终止融合过程。前30秒缓慢匀速加入1mL后30秒加入2mL，然后快速加入27mL无血清培养基，1200r/min离心10min，弃上清。融合后的细胞先在HAT选择性培养液中筛选，5天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用ELISA对细胞培养上清液进行复孔检测，次日重复检测已确定结果。将强阳性孔内的细胞用有限稀释法进行克隆培养，并跟踪记录，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞经过扩大培养，选4只经产BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵-10⁶/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经核酸蛋白紫外扫描仪蛋白分析初步判断得到的蛋白为IgG蛋白。

2.2 检测抗体效价

以1μg/mL浓度按每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤5次，拍干，按每孔200μL封闭液4℃下封闭12h，洗涤3次，拍干。按每孔100μL加入抗血清稀释倍数为2000、10000、250000、50000、250000、1250000，阴性血清及空白(不加抗血清，只加其稀释液)室温作用30min，洗涤五次，拍干。加入每孔100μL酶标羊抗兔(鼠)抗体，室温作用30min，洗涤五次，拍干。加入每孔100μL显色液，37℃避光作用15min。加入每孔50μL终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。以两倍于阴性血清OD值血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。检测结果见表1：

表1-1 多克隆抗体效价检测结果

 

稀释倍数	2000	10000	25000	50000	250000	1250000	阴性血清	空白
									OD1值	1.25	0.972	0.772	0.543	0.317	0.362	0.173	0.026
OD2值	1.227	0.958	0.758	0.439	0.382	0.354	0.217	0.021
									OD3值	1.136	1.043	0.843	0.624	0.418	0.351	0.213	0.030

从表1-1的数据可以推断本发明制备的多克隆抗体的效价达50000。

表1-2 单克隆抗体效价检测结果

 

稀释倍数	2000	10000	15000	30000	50000	250000	阴性血清	空白
									OD1值	0.988	0.692	0.415	0.324	0.317	0.362	0.172	0.024
OD2值	0.975	0.673	0.442	0.398	0.365	0.354	0.207	0.020
									OD3值	1.136	0.943	0.754	0.503	0.387	0.351	0.193	0.032
OD4值	0.982	0.669	0.411	0.376	0.344	0.351	0.223	0.030

从表1-2的数据可以推断本发明制备的单克隆抗体的效价达15000。

实施例3  酶标抗原的制备

活泼酯法制备酶标抗原是这样实现的：取10mol的隐性孔雀石绿半抗原、10μmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10μmol环二己基碳二亚胺(DCC)，用1mL二甲基甲酰胺(DFM)将混合物溶解，室温下避光反应过夜，离心去处沉淀后，取上清液干燥，将其加入含200mg辣根过氧化物酶(HRP)的10mL硼酸盐缓冲液(Ph9.0)中，混合物在4℃下磁力搅拌6小时，在4℃条件下透析过夜4次(pH7.4的磷酸盐缓冲液)，通过紫外扫描仪进行全波长扫描结果推断成功偶联。

实施例4  本发明试剂盒的建立

4.1 本发明试剂盒检测原理

采用直接竞争法，将隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体包被于微孔酶标板，然后将酶标板封闭，加入待测样本或标准品及酶标记隐色孔雀石绿半抗原。样本中的隐色孔雀石绿或标准品与酶标隐色孔雀石绿半抗原竞争性的与包被在酶标板的抗体反应，加入显色剂后形成肉眼可见的颜色，颜色的深浅与样本中隐性孔雀石绿的含量成反比，再通过标准曲线即可定量的读出样本中隐性孔雀石绿的含量。

4.2 本发明试剂盒组成

4.2.1 酶标板的最佳制备方法

用Ph9.6的0.2M碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将隐性孔雀石绿多克隆抗体稀释2000×或单克隆抗体稀释5000×，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按200μL/孔加入含1％明胶，pH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干，至室温干燥后装入包装袋中抽真空保存。

4.2.2 工作试剂的配制

20×浓缩洗液含1.0％吐温-20的0.2mol/L磷酸缓冲液(NaCl 160.0g，KH₂PO₄ 4g，Na₂HPO₄·12H₂O 58g，KCl4g用纯水定容至1000mL，pH7.4，再加10mL吐温-20)；样品稀释液含0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(NaCl 8g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12 H₂O 2.9gKCl 0.2g用纯水定容至1000mL，pH7.4，再加0.5mL吐温-20)；显色液A(TMB 20mg，无水乙醇10mL，加双蒸水至100mL)；显色液B含Na₂HPO₄ 1.46g，柠檬酸0.933g，0.75％过氧化氢尿素0.64mL，加纯水至100mL，调至pH5.0-5.4(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液，pH5.0-5.4)，显色液A和B按1:1混合即成TMB-过氧化氢尿素溶液；终止液为2mol/L硫酸(取浓硫酸4mL加入32mL纯净水中混匀)；隐性孔雀石绿标准溶液为精确称量LMG 10mg，先用二甲基甲酰胺0.1mL溶解，然后用1×PBS缓冲液稀释到10mL，用1×PBS缓冲液配制系列浓度为0，0.1，0.3，1.0，3.0，9.0ng/mL的隐性孔雀石绿标准液。

4.2.3 检测孔雀石绿的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测隐性孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(直观图可见图1)：

(1)试剂盒盒体

(2)包被有隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体的酶标板

(3)隐性孔雀石绿标准品溶液6瓶

浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、1.0ng/mL、3.0ng/mL、9.0ng/mL

(4)20×浓缩洗涤液含1.0％吐温-20的0.2mol/L磷酸缓冲液

(5)HRP标记的隐性孔雀石绿抗原

(6)样品稀释液含0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸缓冲液

(7)显色液A含过氧化脲或过氧化氢

(8)显色液B含四甲基联苯胺

(9)终止液为2mol/L的硫酸溶液

(10)说明书

(11)封板膜

(12)试剂盒支架

实施例5  样品中隐性孔雀石绿残留的检测

(1)样品前处理  取5g样品(鱼肉/虾)绞碎置入50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯均质，以4000g离心5分钟，取5mL上清液置入玻璃管中，于60℃下以氮气吹干，于此玻璃管中加入1mL正己烷和1mL蒸馏水，振荡混匀2分钟，室温4000g离心10分钟，取100μL下层液，经样品稀释液稀释5倍，待测。

(2)用权利要求1所述的试剂盒进行检测向包被有隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体的微孔酶标板中加入标准品或(1)中所得的样品待测液50μL/孔，再加入辣根过氧化物酶标记的隐色孔雀石绿溶液50μL/孔；轻微震荡30秒后于37℃下孵育30分钟；加入洗液300μL/孔，洗涤5次后拍干；将显色液A和B以1：1混合，轻轻震荡混匀，每孔加入混合后的显色液100μL，室温下避光显色15分钟；每孔加入终止液50μL，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔的OD值。

(3)检测结果分析  计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中隐性孔雀石绿的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中隐性孔雀石绿的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样本中隐性孔雀石绿的浓度范围。

实施例6  试剂盒精密度试验

按照本试剂盒的操作说明测定标准溶液，每个标准溶液重复5孔，以浓度的抑制率计算变异系数，结果见表2：

表2-1 本发明采用单克隆抗体的试剂盒精密度  表2-2  本发明采用多克隆抗体的试剂盒精密度

结果表明，本发明试剂盒的板内变异系数<5％，板内测定结果稳定，精密度高。

实施例7  本发明试剂盒的特异性试验

以交叉反应率为指标判定试剂盒的特异性，将隐性孔雀石绿与孔雀石绿、隐性结晶紫、结晶紫、克伦特罗、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、呋喃唑酮等配成不同的浓度，用试剂盒分别测定IC₅₀值，每个药物重复3孔，计算其交叉反应率。见表3：

交叉反应率(％)＝50％抑制浓度(LMG)/50％抑制浓度(其他药物)×100％

表3-1 本发明采用单克隆抗体的试剂盒特异性  表3-2 本发明采用多克隆抗体的试剂盒特异性

实施例8  试剂盒的准确度试验

将配制好的隐性孔雀石绿母液(1mg/mL)稀释成100ng/mL，分别添加到5g鱼肉和虾肉中使其终浓度为0.5ng/g、1.5ng/g、4.5ng/g，随机选5个批次，每个批次3个浓度，每个浓度重复3次，按照试剂盒的测定程序，测定鱼肉中隐性孔雀石绿浓度，并计算回收率和变异系数。见表1：

回收率(％)＝实测浓度/添加浓度×100％

表4-1  本发明试剂盒采用单克隆抗体的准确度和重复性

标4-2  本发明试剂盒采用多克隆抗体的准确度和重复性

回收率均在90％-120％，批间变异系数<15％，表明本发明试剂盒测定结果准确、可靠，重复性好。

实施例9  试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制浓度、隐性孔雀石绿添加实际样品测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行加速稳定性实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存12个月以上。

Claims (7)

1.一种检测隐性孔雀石绿的酶联免疫试剂盒，其中包括：隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体包被的微孔酶标板、隐性孔雀石绿系列标准液、酶标抗原、显色液A和B、20×浓缩洗涤液、样品稀释液和终止液。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：隐性孔雀石绿半抗原及完全抗原(免疫原)的合成。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的隐性孔雀石绿多克隆抗体为隐性孔雀石绿完全抗原(免疫原)免疫新西兰大白兔的纯化抗血清，所述的隐性孔雀石绿单克隆抗体为隐性孔雀石绿完全抗原(免疫原)免疫BALB/C鼠纯化的腹水。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标抗原为辣根过氧化物酶(HRP)标记隐性孔雀石绿半抗原。

5.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体包被的酶标板的最佳制备方法：用pH9.6的0.02M碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将隐性孔雀石绿多克隆抗体2000×或单克隆抗体稀释5000×，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按200μL/孔加入含1％明胶，pH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干，至室温干燥后装入包装袋中抽真空保存。

6.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的20×浓缩洗涤液为含1.0％吐温-20的0.2mol/L磷酸缓冲液，显色液由显色液A和显色液B组成，显色液A为加入过氧化氢或过氧化脲的溶液，显色液B为加入四甲基联苯胺(TMB)的溶液，样品稀释液为0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸缓冲液，标准液为精确称量10mg，先用二甲基甲酰胺0.1mL溶解，然后用1×PBS缓冲液稀释到10mL，用1×PBS缓冲液配制系列浓度为0，0.1，0.3，1.0，3.0，9.0ng/mL的隐性孔雀石绿标准液。

7.一种检测样品中隐性孔雀石绿含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理取5g样品(鱼肉/虾)绞碎置入50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯均质，以4000g离心5分钟，取5mL上清液置入玻璃管中，于60℃下以氮气吹干，于此玻璃管中加入1mL正己烷和1mL蒸馏水，振荡混匀2分钟，室温4000g离心10分钟，取100μL下层液，经样品稀释液稀释5倍，待测。

(2)用权利要求1所述的试剂盒进行检测向包被有隐性孔雀石绿多克隆抗体或单克隆抗体的微孔酶标板中加入标准品或(1)中所得的样品待测液50μL/孔，再加入辣根过氧化物酶标记的隐色孔雀石绿溶液50μL/孔；轻微震荡30秒后于37℃下孵育30分钟；加入洗液300μL/孔，洗涤5次后拍干；将显色液A和B以1：1混合，轻轻震荡混匀，每孔加入混合后的显色液100μL，室温下避光显色15分钟；每孔加入终止液50μL，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔的OD值。

(3)检测结果分析计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中隐性孔雀石绿的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中隐性孔雀石绿的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样品中隐性孔雀石绿的浓度范围。

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