CN102079789A - 一种检测马杜霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测马杜霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该酶联免疫试剂盒，包括马杜霉素单克隆抗体。该马杜霉素单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD分泌产生的。本发明的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物肌肉和肝脏中马杜霉素的含量。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的马杜霉素单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

Description

一种检测马杜霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测马杜霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

马杜霉素(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。纯白色单斜棱晶体，无味。溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。

由于马杜霉素的分子式中含氮量为66％左右，而蛋白质的平均含氮量为16％左右，因此，常被一些不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此马杜霉素被俗称为“蛋白精”。虽然，目前广泛认为马杜霉素毒性比较低微，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重，但长期摄入仍不容忽视，会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入马杜霉素可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。因此，需要灵敏、准确、快速的检测方法。

目前检测马杜霉素含量的化学方法有高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可用作马杜霉素半抗原的化合物。

本发明所提供的马杜霉素半抗原化合物，其结构式如式I所示：

所述的马杜霉素半抗原是马杜霉素和对氨基苯甲酸通过混合酸酐法反应得到的化合物。

上述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物也属于本发明的保护范围。其中，所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。

所述马杜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物是指马杜霉素半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物。

上述任一所述马杜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物具体可是具有如下结构式的偶联物：

其中，偶联比率为(1∶1)-(1∶30)。

上述式I所示化合物和/或上述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物在制备马杜霉素单克隆抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种马杜霉素单克隆抗体。

本发明所提供的马杜霉素单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD分泌产生的。。

保藏编号为CGMCC No.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD也属于本发明的保护范围。

上述式I所示化合物、上述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物和/或上述马杜霉素单克隆抗体在制备检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述酶联免疫试剂盒：

1)酶联免疫试剂盒中包括上述任一所述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物、上述马杜霉素单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)酶联免疫试剂盒中包括上述式I所示化合物的酶标记物、上述马杜霉素单克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)酶联免疫试剂盒中包括上述式I所示化合物的酶标记物、上述马杜霉素单克隆抗体；其中，所述马杜霉素单克隆抗体作为包被原；

4)酶联免疫试剂盒中包括上述任一所述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物、上述马杜霉素单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

上述4种试剂盒的检测原理如下：

当在酶标板微孔条上预包被马杜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入马杜霉素单克隆抗体溶液，样本中残留的马杜霉素或马杜霉素标准品与酶标板上包被的马杜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物竞争马杜霉素单克隆抗体，加入酶标记二抗进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中马杜霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中马杜霉素的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度马杜霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中马杜霉素含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被二抗时，加入马杜霉素单克隆抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记马杜霉素半抗原溶液，样本中的马杜霉素或马杜霉素标准品与酶标记马杜霉素半抗原竞争马杜霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中马杜霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中马杜霉素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度马杜霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中马杜霉素含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被马杜霉素单克隆抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记马杜霉素半抗原溶液，样本中残留的马杜霉素或马杜霉素标准品与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的马杜霉素单克隆抗体，用显色液显色，样本吸光值与马杜霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中马杜霉素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度的马杜霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中马杜霉素含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被马杜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记马杜霉素单克隆抗体溶液，样本中的马杜霉素或马杜霉素标准品与酶标板上包被的马杜霉素抗原竞争马杜霉素单克隆抗体，用显色液显色，样本吸光值与样本中马杜霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中马杜霉素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度马杜霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中马杜霉素含量的浓度范围。

上述任一所述试剂盒中还可包括马杜霉素标准品溶液、显色液、洗涤液和/或样品稀释液。

上述任一所述试剂盒中，所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

上述任一所述试剂盒中，所述马杜霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、2μg/L、8μg/L、32μg/L和128μg/L。

上述任一所述试剂盒中，所述底物显色液由A液和B液组成，A液为终浓度为1.5％-2.5％的过氧化脲的水溶液，所述终浓度为过氧化脲在所述A液中的浓度；B液为终浓度为0.5％-1.5％的四甲基联苯胺的水溶液，所述终浓度为四甲基联苯胺在所述B液中的浓度；

上述任一所述试剂盒中，所述洗涤液由终浓度为0.8％～1.2％的吐温20、终浓度为0.5％叠氮化钠的组成，溶剂为0.01M磷酸盐缓冲液；所述终浓度为各物质在洗涤液中的浓度；所述洗涤液的pH值为7.4。

上述任一所述本发明所提供的试剂盒中还可包括样品浓缩液；所述样品浓缩液为(0.03mol/L-0.05mol/L)的磷酸盐缓冲液，样品浓缩液需要进行稀释，成为样品稀释液后使用。

其中，所述样品浓缩液优选为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液，优选稀释倍数为20倍。

本发明的另一个目的是提供一种检测样品中马杜霉素的方法。

本发明所提供的检测样品中马杜霉素的方法，为如下1)或2)所述：

1)将待测样品用提取剂进行提取，得到提取溶液，即为待测样本溶液；

2)用上述任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述提取剂为甲醇与氯化钠水溶液的混合溶液，其中甲醇和氯化钠水溶液的体积比为(65-90)∶(35-10)；所述氯化钠水溶液的浓度为7-9％；

所述待测样品为动物肝脏或动物肌肉。

所述提取的方法具体可包括如下步骤：将每1.5-2.5g所述待测样品加入9-10ml所述提取剂中，混合均匀，20-25℃、3000-4000r/min离心9-11min，取上清液。

本发明提供的试剂盒检测方法为：

当包被原为马杜霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标二抗，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；

当包被原为马杜霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；

当包被原为马杜霉素特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记马杜霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；

当包被原为二抗时，向酶标板微孔中加入马杜霉素抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标马杜霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。

本发明提供的检测结果分析过程为：

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以马杜霉素标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中马杜霉素的含量。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5h内即可以完成。

本发明的最后一个目的是提供一种制备上述式I所示化合物的方法和一种制备上述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物的方法。

本发明所提供的制备上述式I所示化合物的方法，包括如下步骤：将每100mg马杜霉素胺，溶解于1mL二噁烷中；然后加入70μL无水三正丁胺，4℃冷却，并搅拌15min；加入15μL重蒸的氯甲酸异丁酯，4℃搅拌30min，得到溶液I；称取30mg对氨基苯甲酸溶于水中，调pH至9.0，得到溶液II；将溶液I逐滴加入到溶液II中，并于4℃搅拌4小时，得到所述化合物。

本发明所提供的制备上述式I所示化合物与载体蛋白的偶联物的方法，包括如下步骤：将100mg马杜霉素胺，溶解于1mL二噁烷中；然后加入70μL无水三正丁胺，4℃冷却，并搅拌15min；加入15μL重蒸的氯甲酸异丁酯，4℃搅拌30min，得到溶液I；称取30mg对氨基苯甲酸溶于水中，调pH至9.0，得到溶液II；将溶液I逐滴加入到溶液II中，得到溶液III；

称取50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和25mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺加入到所述溶液III中，搅拌混匀，25℃反应12小时，得到溶液IV；称取载体蛋白50mg溶解于3mL碳酸溶液中，逐滴加入到溶液IV中，25℃继续搅拌4h；透析，所述化合物与载体蛋白的偶联物。

本发明中将马杜霉素类似物进行结构改造，加入间隔臂，突出马杜霉素特征基团，并通过活性酯法合成了半抗原与载体蛋白的偶联物，将其作为免疫原、包被原，方法简便、易行，免疫效果良好，抗体特异性高。本发明的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物肝脏或肌肉中马杜霉素的含量。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的马杜霉素单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。且本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于现场大批量样品的筛选。本发明的试剂盒将在马杜霉素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为马杜霉素标准曲线。

图2为马杜霉素抗原紫外吸收光谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、马杜霉素半抗原、马杜霉素抗原及马杜霉素单克隆抗体的制备

一、马杜霉素半抗原及其制备

马杜霉素胺购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为34069-100MG；

将100mg马杜霉素胺，溶于1mL二噁烷中，搅拌使其完全溶解；然后加入70μL无水三正丁胺，将此混合物置于4℃冰浴中冷却，并搅拌15min。加入15μL重蒸的氯甲酸异丁酯，4℃左右搅拌30min，得到溶液I；称取30mg对氨基苯甲酸溶于水中，搅拌使其溶解，用0.1mol/L的NaOH调pH至9.0，得到溶液II；将溶液I逐滴加入到溶液II中，并于4℃轻微搅拌4小时，得到溶液III，其中含有式I所示的马杜霉素半抗原化合物。

二、马杜霉素抗原及其制备

1、马杜霉素免疫原的合成与鉴定

马杜霉素是只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将马杜霉素类和对氨基苯甲酸通过混合酸酐法合成马杜霉素半抗原，接出一个间隔臂后更突出分子结构中的特征基团，使制备的马杜霉素抗体对马杜霉素的特异性很高。

称取50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和25mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入到实验一得到的溶液III中，搅拌混匀，置25℃反应12小时，得到溶液IV；称取BSA 50mg溶解于3mL碳酸溶液中(载体蛋白与式I所示化合物的摩尔数比为为7∶1)，在磁力搅拌下，逐滴加入到溶液IV中，25℃继续搅拌4h；待反应完毕，将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析72h，换水6次，即得到目的产物马杜霉素抗原；分装于安瓿瓶中，-20℃保存。目的产物马杜霉素抗原的产率为58.2％，产率的计算公式为：产率＝转化为产物所消耗掉的主反应物量/主反应物消耗总量×100％。

马杜霉素免疫原的结构式如式II所示：

马杜霉素半抗原与BSA的偶联比为1∶11。

马杜霉素免疫原的鉴定：

马杜霉素半抗原、BSA和马杜霉素免疫原(即马杜霉素半抗原和BSA的偶联物)，三者分别配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图(图2)。

根据公式K＝A/CL分别计算出MAD、BSA、MAD-BSA的摩尔消光系数。在载体蛋白和马杜霉素的最大波长处检测马杜霉素免疫原的光吸收值，按公式计算两种物质在马杜霉素免疫原中的摩尔浓度比，即偶联比。将偶联物稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：

蛋白质(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀

经测定：马杜霉素半抗原与BSA的偶联比为1∶11，偶联物的浓度为4.3mg/ml。

2、马杜霉素包被原及其制备

制备方法与实验1中制备方法相同，不同的是所用的载体蛋白是KLH。

马杜霉素半抗原与KLH偶联物的结构式如式III所示：

马杜霉素半抗原与KLH的偶联比为1∶11。

三、马杜霉素单克隆抗体的制备

以马杜霉素免疫原为免疫原。

a.动物免疫

将实验二得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为75μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到筛选得到稳定分泌马杜霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株名称为MAD，分类命名为马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3391。

c.细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞株马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD CGMCCNo.3391置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

上述单克隆抗体还可以采取以下方法制备：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4mL/只，7天后腹腔注射马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD 5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。

四、多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以p-ABTAAT-BSA为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

五、马杜霉素半抗原、马杜霉素抗原和马杜霉素单克隆抗体的用途和效果

单抗的效果检测

利用棋盘法进行单抗效价的测定，结果表明，马杜霉素单克隆抗体的效价为4.2×10⁶，最低检测限(LOD值)为0.5μg/L为和半数抑制量(IC₅₀)为1.2μg/L。

实施例2、检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其制备与应用

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

1、马杜霉素包被原；

2、酶标板；

3、马杜霉素单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC No.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD分泌产生的；

4、马杜霉素标准品：标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、2μg/L、8μg/L、32μg/L和128μg/L；马杜霉素标准品为马杜霉素胺(MADURAMICIN AMMONIUM)，购自Sigma-Aldrich公司；产品目录号为34069-100MG；用样品稀释液稀释成上述各浓度；

5、用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；

6、底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％过氧化脲的水溶液，B液为1％四甲基联苯胺的水溶液；

7、终止液：2mol/L硫酸的水溶液或2mol/L盐酸的水溶液；

8、洗涤液：含有0.8％～1.2％吐温20和0.5％叠氮化钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4；

9、样品稀释液：20×0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

二、试剂盒中各组分的制备

1、包被有偶联物的酶标板的制备

用包被缓冲液将马杜霉素包被原稀释成10.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液稀释20倍后洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6、0.01～0.1mol/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：磷酸盐缓冲液：含有0.5％马血清、1‰叠氮化钠、3％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。

2、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的制备

2.1、二抗的制备过程

羊抗鼠二抗：以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠二抗；

羊抗兔二抗：以山羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔二抗。

2.2、酶标记羊抗鼠二抗

将羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良的过碘酸钠法，方法如下：

a、8mg辣根过氧化物酶溶解于2mL蒸馏水中。

b、加入现配制的100mmol/L NaIO₄溶液0.4mL，室温搅拌反应20min。

c、用1mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原。

d、加入磷酸盐缓冲液(pH8.6、0.5mol/L)40μL和含有IgG 16mg的磷酸盐缓冲液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室温搅拌反应4小时。

e、加入现配制的NaBH₄水溶液(1mol/L)0.1mL，在4℃反应4小时，以还原Schiff碱。

f、纯化保存。

三、试剂盒的应用

(一)检测方法

1、样品前处理

对动物肌肉或肝脏样品进行检测。

用均质器均质动物肌肉或肝脏样品；称取2±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL 8％(v/v)甲醇-氯化钠溶液(8％甲醇∶氯化钠溶液＝70∶30，v/v)，充分振荡10min混合均匀，3000r/min以上，室温(20-25℃)离心10min；取上清液至10mL干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；加入1mL复溶工作液溶解干燥的残留物；取50μL分析。

2.用试剂盒检测

2.1标准曲线的制作

向实验1中所述包被有偶联物的酶标板微孔中加入马杜霉素标准品溶液50μL，再加入马杜霉素单克隆抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸的水溶液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以马杜霉素标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2.2样品中马杜霉素浓度的测定

向实验1中所述包被有偶联物的酶标板微孔中加入检测样本溶液50μL，再加入马杜霉素单克隆抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸的水溶液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液中的马杜霉素的残留量。

(二)酶联免疫试剂盒效果的检测

1、标准品精密度试验

按照实验(一)中所述方法制备试剂盒，从3个不同批次的试剂盒中各抽取10个试剂盒(即10个酶标板)进行实验，每个酶标板抽出20个微孔，测定20μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数，结果见表1。

变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

表1标准品精密度试验结果(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在5.5％～13.2％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

2、样本精密度试验

向不含马杜霉素的样品(鸡肉和鸡肝)中添加马杜霉素，使马杜霉素在样品中的终浓度分别为2μg/kg；将添加后的样品分别按照(一)中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表2、3。

板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2鸡肉的精密度试验结果(添加浓度2.0μg/kg)

表3鸡肝样品精密度试验(添加浓度2.0μg/kg)

结果表明，本试剂盒对以上5种添加样品，板内变异系数小于10％，批内变异系数小于15％，批间变异系数小于20％，满足试剂盒精密度的规定。

3、样本回收率试验

向不含马杜霉素的样品(鸡肉和鸡肝)中分别添加不同浓度的马杜霉素标准品，使马杜霉素在样品中的浓度各为2μg/kg、4μg/kg；将添加后的样品分别按照(二)中所述方法进行前处理，得到样本溶液，再进行检测。每个浓度做5个平行，分别计算回收率(回收率＝实测值/添加值)。

结果见表4。

表4试剂盒的样本回收率测定(1)

从表中可看出，鸡肉样品的添加回收率在85.6％～105.1％之间；鸡肝样品的添加回收率为81.0％～97.2％，符合准确度的测定标准。

4、交叉反应率试验：

选择与马杜霉素类似结构的化合物和临床使用的代表兽药，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。

结果如表5所示。

表5试剂盒的特异性

名称	交叉反应率(％)
		马杜霉素	100.0
盐霉素	＜0.1
		甲基盐霉素	＜0.1
红霉素	＜1.0
		泰乐菌素	＜1.0
莫能菌素	＜0.1

实验表明，本发明试剂盒对马杜霉素的特异性好，即本发明试剂盒可以检测马杜霉素。

5、试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、马杜霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

Claims (10)

1.一种马杜霉素单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD分泌产生的。

2.保藏编号为CGMCC No.3391的马杜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株MAD。

3.一种化合物，其结构式如式I所示：

4.权利要求3所示化合物与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。

5.权利要求3所述化合物和/或权利要求4所述化合物与载体蛋白的偶联物在制备马杜霉素单克隆抗体中的应用。

6.权利要求3中所述化合物、权利要求4中所述偶联物和/或权利要求1中所述马杜霉素单克隆抗体在制备检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒中的应用。

7.一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述酶联免疫试剂盒：

1)酶联免疫试剂盒中包括权利要求4中所述偶联物、权利要求1中所述马杜霉素单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)酶联免疫试剂盒中包括权利要求3中所述化合物的酶标记物、权利要求1中所述马杜霉素单克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)酶联免疫试剂盒中包括权利要求3中所述化合物的酶标记物、权利要求1中所述马杜霉素单克隆抗体；其中，所述马杜霉素单克隆抗体作为包被原；

4)酶联免疫试剂盒中包括权利要求4中所述偶联物、权利要求1中所述马杜霉素单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

8.一种检测样品中马杜霉素的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品用提取剂进行提取，得到提取溶液，即为待测样本溶液；

2)用权利要求7所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述提取剂为甲醇与氯化钠的混合溶液；

所述待测样品为动物肝脏或动物肌肉。

9.一种制备权利要求3中所述化合物的方法，包括如下步骤：将每100mg马杜霉素胺，溶解于1mL二噁烷中；然后加入70μL无水三正丁胺，4℃冷却，并搅拌15min；加入15μL重蒸的氯甲酸异丁酯，4℃搅拌30min，得到溶液I；称取30mg对氨基苯甲酸溶于水中，调pH至9.0，得到溶液II；将溶液I逐滴加入到溶液II中，并于4℃搅拌4小时，得到权利要求3中所述化合物。

10.一种制备权利要求4中所述化合物与载体蛋白的偶联物的方法，包括如下步骤：将100mg马杜霉素胺，溶解于1mL二噁烷中；然后加入70μL无水三正丁胺，4℃冷却，并搅拌15min；加入15μL重蒸的氯甲酸异丁酯，4℃搅拌30min，得到溶液I；称取30mg对氨基苯甲酸溶于水中，调pH至9.0，得到溶液II；将溶液I逐滴加入到溶液II中，得到溶液III；

称取50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和25mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺加入到所述溶液III中，搅拌混匀，25℃反应12小时，得到溶液IV；称取载体蛋白50mg溶解于3mL碳酸溶液中，逐滴加入到溶液IV中，25℃继续搅拌4h；透析，得到权利要求4中所述化合物与载体蛋白的偶联物。

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