CN103353530A

CN103353530A - 马杜霉素快速检测试纸条和试纸卡

Info

Publication number: CN103353530A
Application number: CN201210532069XA
Authority: CN
Inventors: 赵东; 柴书军; 邢广旭; 张小辉; 张改平; 职爱民
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明涉及一种快速检测微量马杜霉素的胶体金试纸条。它含有底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为测试端吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联马杜霉素的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的直线式对照印迹。马杜霉素金标抗体为胶体金标记的马杜霉素单克隆抗体或多克隆抗体，偶联马杜霉素的载体蛋白溶液为马杜霉素与载体蛋白偶联的复合溶液。偶联马杜霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白OVA，或为血蓝蛋白KLH。本发明的试纸条具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。

Description

马杜霉素快速检测试纸条和试纸卡

一、技术领域：本发明涉及一种快速检测马杜霉素的器具，特别是涉及一种快速分析马杜霉素的快速检测试纸条和试纸卡。

二、技术背景：马杜霉素（Maduramicin ammonium，MD)又名马度米星、马度米星铵，是聚醚类离子载体抗生素的一种。早在1983年由liu和labeda在微生物Actinomadura yumaensis的发酵产物中分离而得。MD为多环醚结构有机酸，具有线性骨架，溶液中可由氢链连接形成特殊构型。MD呈酸性pH值为6~8，市场上销售MD纯品为白色或类白色结晶状粉末，有特殊臭味,其分子式为C₄₇H₈₃NO₁₇，相对分子质量为934.16，熔点是305~310℃，它在甲醇、乙醇或氯仿中易溶，在丙酮中略溶，但不溶于水。MD在人体内经肝脏、肾脏等组织器官代谢并排除体外，但没有代谢的在体内累积对人有慢性毒性，他会干扰体内细胞的离子平衡和能量代谢从而产生细胞毒性作用，细胞出现变性或坏死。人们食入残留MD的食物会引起腿脚发软、四肢无力、行走困难，严重时可引发人的血管舒张，尤其是诱发心脏冠状动脉的扩张和血流量的增加，但是对于正常人群倒没有明显的不良反应症状，当患有冠状动脉疾病的人群，食入含有MD残留的食物过多后，诱发的心脏冠状动脉扩张，使心脏局部缺氧加重，使病情严重恶化。因此很多国家和地区都建立了MD在肉鸡组织中最大残留限量（maximum residue Limits，MRLs）：肌肉中为100~240μg/Kg；脂肪中为380~480μg/Kg；肝脏中为720~800μg/Kg；肾脏中为1000μg/Kg。

目前，国内外测定饲料和食品中MD的方法，主要是采用理化分析方法，包括高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱/质谱联用分析法（Liquid chromatography/PBSs spectrometry，LC/MS）、气相色谱/质谱联用分析法（Gas chromatograph/PBSs spectrometry，GC/MS），微生物学检测方法，紫外分光光度法等等。这些检测方法，待检样品需经一系列复杂的处理净化，从样品处理到得出检测结果需要两天以上时间，繁琐费时；同时这些检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法进行现场检测，难以推广。由于这些方法的局限性和严重的滞后性，使监控MD的非法使用变得异常困难，无法保证食品安全监控的有效性。因此发明一种具有快速、简便、高灵敏度、高特异性的检测食品中MD残留的方法是十分必要的。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题：提供一种特异强、灵敏度高，能快速、简便地检测MD试纸条和试纸卡。

本发明的技术方案是：

一种MD快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，所述金标结合垫为吸附MD金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用MD偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

所述MD金标抗体为胶体金标记的MD单克隆抗体或多克隆抗体，所述MD偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。

所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。

一种MD快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附MD金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用MD偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

所述MD金标抗体为胶体金标记的MD单克隆抗体或多克隆抗体，MD偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

本发明的检测试纸条和试纸卡具有下列优点：

特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出MD最低限量可达到10ppb。

简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条（卡）加入被检样品液后，在10分钟内即可判定检测结果。

结果显示形象、直观、准确。检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线“︱”和“︱︱”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线“︱”时，表示在被检样品中含有MD，显示两条棕红色线“︱︱”时，表示在被检样品中不含MD。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括实验室检验、口岸检验、集贸市场卫生监督、加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

四、附图说明：图1、MD快速检测试纸条俯视结构示意图。

图2、MD快速检测试纸条剖面结构示意图。

图中，1：衬板，2：样品垫，3：金标结合垫，4：包被膜，5：检测线，6：对照线，7：吸水垫，8-1：样品浸入端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：标识线，

五、具体实施方式：

要制成快速检测MD试纸条（卡），首先要制备偶联MD载体蛋白和MD金标抗体，从而制备检测线和金标抗体纤维。其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG）抗体，用于制备对照线。

（1）MD与载体蛋白偶联

采用混合酸酐法，将MD与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。

混合酸酐法反应偶联，取5mg MD溶于0.4mL N,N二甲基甲酰胺（DMF）溶液中；然后逐步加入30μL三乙胺和20μL氯甲酸异丁酯，常温下搅拌反应1h；然后加入到8mL 5mg/mL的BSA（OVA）的PBS溶液中，4℃搅拌反应过夜；将反应混合液装入透析袋，用PBS溶液透析3d，8h/次；-20℃保存备用。

（2）抗MD单克隆抗体或多克隆抗体的制备

单抗制备：以50μg～100μg/只的MD载体蛋白偶联物免疫6～8周龄BALB/c小鼠3～4次，每次免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3～4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将1×10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7~1.0mL的50%PEG4000作用1min，然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5~10 min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔（100μL～200μL/孔），置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。培养10~14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与MD反应，亲和力常数达到10⁹~10¹⁰，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，针对MD特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

多抗制备：用MD载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μg～500μg /次，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌PBS溶解MD载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解MD载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测定其效价达到10⁵以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS（pH7.2）混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS（pH7.2）透析48～72h，中间换液数次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗MD多克隆抗体，－20℃冻存，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

（3）MD金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的200ML 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8mL，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃调pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存备用。以1：2000的标记比将待标记的MD单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S－400柱层析进行分离纯化，获得MD胶体金标记抗体。将1：100～1：500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备MD金标抗体玻璃纤维棉。

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备

羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体的制备

以饱和硫酸铵提取MD阴性小鼠血清IgG（或阴性兔血清IgG），即取1份小鼠血清（或兔血清）加2份PBS（pH7.2）混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS（pH7.2）透析48h，中间换液3次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50μg～100μg/kg体重的小鼠血清（或兔血清）IgG经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1：2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体（方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述），用于MD快速检测试纸条对照线的制备。

（5）MD快速检测试纸反应原理

当MD快速检测试纸测试端加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测MD及金标抗体玻璃纤维棉中的金标抗体一起向包被膜扩散，并最终渗入手柄端吸水垫。在扩散过程中，待测MD可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上MD的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联MD载体蛋白的检测线结合，不显示检测线，而羊或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照线“︱”，即显示一条棕红色线“︱”为阳性表示。反之样品溶液中无MD则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联MD载体蛋白的检测线结合，显示棕红色检测线“︱”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照线“︱”，形成两条棕红色线“‖”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。

实施例一：MD快速检测试纸条，参见图1和图2。图中衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用玻璃纤维棉制成；金标结合垫3采用具体实施方式“5”中所述的方法制备，采用有胶体金标记的抗MD单克隆抗体玻璃纤维棉；包被膜4采用硝酸纤维素膜；隐形检测线5用MD-载体蛋白偶联物在包被膜4上印制，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA；隐形对照线6用兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜4上印制，两条线平行排列组合为“︱︱”；手柄端的吸水垫7用吸水滤纸制成。将样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、手柄端的吸水垫7从右至左依次粘贴固定在塑胶条1上，彼此之间交界处纤维互相搭接。样品端白色保护膜8－1覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，黄色保护膜8－2覆盖在手柄端吸水垫7上，测试样品标示线9位于样品垫2与金标结合垫3交界处，即位于对应的白色保护膜8－1上且偏向样品垫2一侧约0.5cm处，在标示线9右侧保护膜上印有箭头及MAX字样，以方便使用。

检测样品制备：

① 饲料样将样品磨细，以生理盐水进行1：2～1：5稀释，静置沉淀后取上清液，用于检测分析。

② 奶样取奶样2ml在15℃条件下3000r/ min离心5min,除去上层脂肪，取下层液用生理盐水作1：2～1：5稀释，静置沉淀或5000r/min离心5min，取上清液，用于检测分析。

检测方法：将MD检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，10分钟内观察检测结果。

结果判定：

阳性如果在包被膜上显示有一条棕红色线“︱”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有MD；

阴性如果在包被膜上显示有两条棕红色线“︱︱”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含MD；

失效如果在包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。

实施例二：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：以抗MD多克隆抗体替代抗MD单克隆抗体，制备MD金标抗体和金标结合垫；偶联MD的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照印迹。隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为“＋”，或者隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为“··”。

其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。

实施例三：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用尼龙膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MD载体蛋白为鸡卵清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。

实施例四：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚偏二氟乙烯膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MD载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。

实施例五：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚酯膜制成；以抗MD多克隆抗体替代抗MD单克隆抗体，制备MD金标抗体和金标结合垫；包被膜4采用羧化纤维素膜；MD载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6用羊抗兔IgG抗体溶液在包被膜上印制。

另外，本发明试纸卡的试纸芯中衬板1、样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、隐形检测线5、隐形对照线6和吸水垫7，可为实施例一~五的任意一种，试纸卡壳体除塑料外，还可用不吸水的木质或金属等材料制作，以及与本发明构思相同的其他类似变换均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种马杜霉素快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，其特征是：所述金标结合垫为吸附马杜霉素金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用马杜霉素偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述马杜霉素金标抗体为胶体金标记的马杜霉素单克隆抗体或多克隆抗体，所述马杜霉素偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试纸条，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。

6.一种马杜霉素快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附马杜霉素金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用马杜霉素偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

7.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述马杜霉素金标抗体为胶体金标记的马杜霉素单克隆抗体或多克隆抗体，所述马杜霉素偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

8.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

9.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

10.根据权利要求6-9任一项所述的试纸卡，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。