CN102086229B - 一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该酶联免疫试剂盒，包括三聚氰胺单克隆抗体和三聚氰胺半抗原。三聚氰胺单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。本发明的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物或人食用的产品(特别是牛奶、奶粉等乳品及蛋、饲料等)中三聚氰胺的含量。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的三聚氰胺单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

Description

一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。纯白色单斜棱晶体，无味。溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。

由于三聚氰胺的分子式中含氮量为66％左右，而蛋白质的平均含氮量为16％左右，因此，常被一些不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺被俗称为“蛋白精”。虽然，目前广泛认为三聚氰胺毒性比较低微，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重，但长期摄入仍不容忽视，会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。因此，需要灵敏、准确、快速的检测方法。

目前检测三聚氰胺含量的化学方法有高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种三聚氰胺单克隆抗体。

本发明所提供的三聚氰胺单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。

保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL也属于本发明的保护范围。

所述三聚氰胺单克隆抗体在制备检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述酶联免疫试剂盒：

1)酶联免疫试剂盒中三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、所述三聚氰胺单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、所述三聚氰胺单克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、所述三聚氰胺单克隆抗体；其中，所述三聚氰胺单克隆抗体作为包被原；

4)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、所述三聚氰胺单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原；

所述三聚氰胺半抗原的结构式如式I所示：

(式I)。

所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、兔血清蛋白或血蓝蛋白。

所述酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺标准品溶液、底物显色液、洗涤液和样品稀释液；

其中，所述三聚氰胺标准品溶液为浓度分别为0μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、500μg/L和2500μg/L的三聚氰胺标准品溶液；

其中，所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为浓度为1.5％-2.5％的过氧化脲的水溶液，B液为浓度为0.5％-1.5％的四甲基联苯胺的水溶液；

所述A液优选为浓度为2％的过氧化脲的水溶液，B液优选为浓度为1％的四甲基联苯胺的水溶液。

其中，所述洗涤液为浓度为0.8％～1.2％的吐温20和浓度为0.3％-0.7％的叠氮化钠的0.005M-0.015M磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液优选为浓度为1％的吐温20和浓度为0.5％的叠氮化钠的0.01M磷酸盐缓冲液。

本发明所提供的试剂盒中还可包括样品浓缩液；所述样品浓缩液为(0.03mol/L-0.05mol/L)的磷酸盐缓冲液，样品浓缩液需要进行稀释，成为样品稀释液后使用。

其中，所述样品浓缩液优选为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液，优选稀释倍数为20倍。

其中，所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

所述酶标记中的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与二抗进行偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与二抗进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的浓度比率，节省了原材料。

所述三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物是指三聚氰胺半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物。

上述任一所述三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物具体可是具有如下结构式的偶联物：

其中，n为偶联比率，为1-30中的任一自然整数。

试剂盒的检测原理如下：

当在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入三聚氰胺单克隆抗体溶液，样本中残留的三聚氰胺或三聚氰胺标准品与酶标板上包被的三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物竞争三聚氰胺单克隆抗体，加入酶标记二抗进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三聚氰胺的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度三聚氰胺标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三聚氰胺含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被二抗时，加入三聚氰胺单克隆抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记三聚氰胺半抗原溶液，样本中的三聚氰胺或三聚氰胺标准品与酶标记三聚氰胺半抗原竞争三聚氰胺特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三聚氰胺的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度三聚氰胺标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三聚氰胺含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺单克隆抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记三聚氰胺半抗原溶液，样本中残留的三聚氰胺或三聚氰胺标准品与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的三聚氰胺单克隆抗体，用显色液显色，样本吸光值与三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三聚氰胺的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度的三聚氰胺标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三聚氰胺含量的浓度范围。

当在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记三聚氰胺单克隆抗体溶液，样本中的三聚氰胺或三聚氰胺标准品与酶标板上包被的三聚氰胺抗原竞争三聚氰胺单克隆抗体，用显色液显色，样本吸光值与样本中三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三聚氰胺的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度三聚氰胺标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三聚氰胺含量的浓度范围。

本发明的最后一个目的是提供一种检测样品中三聚氰胺的方法。

本发明所提供的检测样品中三聚氰胺的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述酶联免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)、d)、e)和f)中的任一：

a)所述待测样品为奶粉；每取0.8g-1.2g所述奶粉溶于8ml-12ml所述样品稀释液中，混合均匀，离心，取上清液，即为待测样本溶液；

b)所述待测样品为牛奶；将所述牛奶与所述样品稀释液按照1∶(9-11)的体积比混匀，得到的溶液即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为蛋；将每0.8g-1.2g蛋用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

d)所述待测样品为宠物食品；将每1.8g-2.2g宠物食品用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

e)所述待测样品为饲料；将每0.8g-1.2g饲料用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

f)所述待测样品为小麦面筋；将每0.1g-0.3g小麦面筋用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

所述提取剂的组成为：由Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl、Tween20和水组成，所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述提取剂中的浓度为2.9g/L，所述NaH₂PO₄·2H₂O在所述提取剂中的浓度为0.2g/L，所述NaCl在所述提取剂中的浓度为0.9g/L，所述Tween20在所述提取剂中的浓度为0.05g/L。

上述方法中，所述提取的方法可包括如下步骤：将所述蛋、宠物食品、小麦面筋或饲料溶于所述提取溶液中，混匀，超声萃取0.8min-1.2min，漩涡混合0.8min-1.2min，静置4.5min-5.5min，3000rpm-5000rpm离心5min-10min，取上清液。其中，在所述小麦面筋的提取过程中，在进行上述超声萃取、涡旋、离心后，还可包括再次离心提取的步骤；所述再次离心提取的方法包括如下步骤：将上述超声萃取、涡旋、离心后得到的上清液进行稀释，然后在10000-12000r/min离心9-11min，取上清液。

上述方法中，在步骤(1)后、步骤(2)前还可包括对待测样本溶液进行稀释的步骤，一般稀释10-20倍。

本发明的检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以三聚氰胺标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中三聚氰胺的含量。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5小时内即可以完成。

本发明的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物或人食用的产品(特别是牛奶、奶粉等乳品及蛋、饲料等)中三聚氰胺的含量。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的三聚氰胺单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。且本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于现场大批量样品的筛选。本发明的试剂盒将在三聚氰胺的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为三聚氰胺半抗原质谱图。

图2为三聚氰胺抗原的紫外光谱图。

图3为三聚氰胺标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺抗原及三聚氰胺单克隆抗体及其制备

一、三聚氰胺半抗原的合成与鉴定

1、三聚氰胺半抗原的合成

称取2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(CAAT)0.430g(3mmol)悬浮于经Na₂SO4处理的10mL无水乙醇提中，加入0.5g(3mmol)的对氨基苯丁酸(2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与对氨基苯丁酸的投料摩尔比为1∶1)，加入KOH，使KOH的终浓度为85％。温度为75℃条件下水浴回流24小时，分别在16小时和19小时的时候，加入0.37g对氨基苯丁酸(2.0mmol)和85％KOH(180mg，2.7mmol)。产物过滤，减压蒸馏，获得油状物质。产物溶解于30mL 5％的碳酸钠溶液，10mL二氯甲烷洗涤两次，水相用浓盐酸调pH至1，收集沉淀，干燥获得产品。实验设3次重复，结果取平均数。获得目的产物(半抗原)195mg，产率为68％，命名为p-ABTAAT，化学名称为氨基苯丁酸代二胺-s-三嗪，分子量为288。产率的计算公式为：产率＝实际得到的产物的量/理论上得到的产物的量×100％。

2、三聚氰胺半抗原的鉴定

取上述产物经ESI质谱测定其结构，发现其分子离子峰为289(M+1)(见图1)。

半抗原化合物的元素分析结果(％)：C，54.16；H，5.59；N，29.15；O，11.10。由上可知，化合物的分子量为288，分子中含有2个O，13个C。说明三聚氰胺半抗原合成成功。三聚氰胺半抗原的分子结构式如式I所示：

(式I)。

二、三聚氰胺抗原的合成与鉴定

(一)三聚氰胺免疫原的合成

将三聚氰胺半抗原与载体蛋白采用活性酯法进行偶联得到免疫原。

三聚氰胺是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将三聚氰胺类似物(2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪)和对氨基苯丁酸合成三聚氰胺半抗原，接出一个间隔臂来突出分子结构中的特征基团，使制备的三聚氰胺抗体对三聚氰胺的特异性很高。

1、合成

p-ABTAAT溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分别加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(p-ABTAAT、DMF、DCC和NHS的投料物质的量比为1∶1∶1∶1)，25℃下搅拌反应12小时，离心，除去沉淀，得到溶液I；向溶液I中加入溶有100mg牛血清蛋白(BSA)的水溶液5mL(p-ABTAAT与牛血清蛋白的投料物质的量比为7∶1)，25℃下搅拌反应12小时。将溶液装入透析袋，用蒸馏水透析5天，离心分离出上清液，即得到三聚氰胺免疫原p-ABTAAT-BSA。计算产率。产率的计算公式为：产率＝实际得到的产物的量/理论得到的产物的量×100％。实验设3次重复，结果取平均数。结果目的产物的产率为57.2％。

2、三聚氰胺抗原的鉴定

按合成三聚氰胺抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。

由图2紫外光谱图可知，产物的紫外光谱图与牛血清蛋白(BSA)相比发生了明显变化，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得三聚氰胺人工抗原。经计算，三聚氰胺半抗原与BSA的结合比为17∶1。

(式II)

(二)三聚氰胺包被原及其制备

10mg p-ABTAAT溶解于5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分别加入10mg N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，25℃下搅拌反应12小时，离心，除去沉淀，得到溶液I；向溶液I中加入溶有100mg卵清白蛋白(OVA)的水溶液5mL，25℃下搅拌反应12小时。将溶液装入透析袋，用蒸馏水透析5天，离心分离出上清液，即得到偶联物p-ABTAAT-OVA。计算产率。产率的计算公式为：产率＝实际得到的产物的量/理论得到的产物的量×100％。实验设3次重复，结果取平均数。结果目的产物的产率为62.3％。偶联物的结构式如式III所示。

(式III)

三、三聚氰胺单克隆抗体的制备

以实验二中得到的抗原为免疫原。

a.动物免疫

将实验二得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为75μg/只，使其产生抗血清。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到筛选得到稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株名称为MAL，分类命名为三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3394。

c.细胞冻存和复苏

将三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL No.3394置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。

上述单克隆抗体还可以采取以下方法制备：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4mL/只，7天后腹腔注射三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL 5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。

四、多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以p-ABTAAT-BSA为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

五、三聚氰胺单克隆抗体的效果

利用棋盘法进行单抗效价的测定，结果表明，三聚氰胺单克隆抗体的效价为2.5×10⁶，最低检测限(LOD值)为5μg/L为和半数抑制量(IC₅₀)为12μg/L。

实施例2、检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒及其制备

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

1、三聚氰胺包被原；如实施例1中所述。

2、酶标板；

3、三聚氰胺单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的；

4、三聚氰胺标准品：标准品溶液浓度分别为0μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、500μg/L和2500μg/L；三聚氰胺标准品购自Sigma Aldrich公司；CAS号：108-78-1；用样品稀释液稀释成上述各浓度；

5、用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；

6、底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％过氧化脲的水溶液，B液为1％四甲基联苯胺的水溶液；

7、终止液：2mol/L硫酸的水溶液或2mol/L盐酸的水溶液；

8、洗涤液：含有0.8％～1.2％吐温20和0.5％叠氮化钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4；

9、样品稀释液：20×0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

二、试剂盒中各组分的制备

1、包被有偶联物的酶标板的制备

用包被缓冲液将步骤1制得的三聚氰胺与载体蛋白的偶联物稀释成10.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液稀释20倍后洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6、0.01～0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液；

封闭液：磷酸盐缓冲液：含有0.5％马血清、1‰叠氮化钠、3％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。

2、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的制备

2.1、二抗的制备过程

羊抗鼠二抗：以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠二抗；

羊抗兔二抗：以山羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔二抗。

2.2、酶标记羊抗鼠二抗

将羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良的过碘酸钠法，方法如下：

a、8mg辣根过氧化物酶溶解于2mL蒸馏水中。

b、加入现配制的100mmol/L NaIO₄溶液0.4mL，室温搅拌反应20min。

c、用1mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原。

d、加入磷酸盐缓冲液(pH8.6、0.5mol/L)40μL和含有IgG 16mg的磷酸盐缓冲液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室温搅拌反应4小时。

e、加入现配制的NaBH₄水溶液(1mol/L)0.1mL，在4℃反应4小时，以还原Schiff碱。

f、纯化保存。

三、用酶联免疫试剂盒检测样品中的三聚氰胺

(一)检测方法

1、样品前处理

(1)以三聚氰胺为食品添加剂的乳制品样本(牛奶、奶粉)的处理步骤：

奶粉检测样本溶液的获得：取1g奶粉溶于10mL样品液稀释中，混合均匀，4℃、4000r/min离心10min，取50μL用于检测。

牛奶检测样本溶液的获得：新鲜牛奶直接用样品液稀释后进行检测，比例按照1∶10，取50μL用于检测。

(2)以三聚氰胺为食品添加剂的食品样本(蛋类、宠物食品、饲料、面筋)的处理步骤：

蛋检测样本溶液的获得：取1g样品加入10mL提取溶液中，并剧烈振荡。超声萃取1min，漩涡混合1min，然后静置5min，使样品分层冷却后，5000r/min离心10min，取上清液，并将上清液收集于一干净试管中，用样品稀释液将上清液稀释10倍，取50μL分析。

宠物食品检测样本溶液的获得：取2g均质样品加入10mL提取溶液中，并剧烈振荡。超声萃取1min，漩涡混合1min，然后静置5min，使样品分层冷却后，3000r/min室温离心5min后，取上清液，并将上清液收集于一干净试管中，用样品稀释液将上清液稀释20倍，取50μL分析。

小麦面筋检测样本溶液的获得：取0.2g均质好的样品加入10mL提取溶液中，并剧烈振荡。超声萃取1min，漩涡混合1min，然后静置5min，使样品分层冷却后，3000r/min室温离心5min后，取上清液记作上清液I；用样品稀释液按照1∶10体积比稀释上清液I后，10000r/min离心10min，取上清液记作上清液II；并将上清液II收集于一干净试管中，用样品稀释液将上清液II稀释20倍，取50μL分析。

饲料检测样本溶液的获得：取1g样品加入10mL提取溶液中，并剧烈振荡。超声萃取1min，漩涡混合1min，然后静置5min，使样品分层冷却后，3000r/min室温离心5min后，取上清液，并将上清液收集于一干净试管中，用样品稀释液将上清液稀释20倍，取50μL分析。

提取溶液为PBST缓冲液，其组成为：1L溶液中含Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g，NaCl 0.9g，Tween20 0.05％。

2.用试剂盒检测

2.1标准曲线的制作

向实施例1中所述包被有偶联物的酶标板微孔中加入三聚氰胺标准品溶液50μL，再加入三聚氰胺单克隆抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸的水溶液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以三聚氰胺标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图3所示。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2.2样品中三聚氰胺浓度的测定

向实施例1中所述包被有偶联物的酶标板微孔中加入检测样本溶液50μL，再加入三聚氰胺单克隆抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液硫酸的水溶液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液中的三聚氰胺的残留量。

(二)酶联免疫试剂盒效果的检测

1、标准品精密度试验

按照实施例1中所述方法制备试剂盒，从3个不同批次的试剂盒中各抽取10个试剂盒(即10个酶标板)进行实验，每个酶标板抽出20个微孔，测定20μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数，结果见表1。

变异系数的计算方法：

变异系数(CV)＝标准差(SD)/平均值(x)×100％

表1、标准品精密度试验结果(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在2.8％～6.7％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

2、样本精密度试验

向不含三聚氰胺的样品(牛奶、奶粉、猫粮、鸡蛋和饲料)中添加三聚氰胺，使三聚氰胺在样品中的终浓度分别为0.16mg/L、2.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg、50.0mg/kg；将添加后的样品分别按照(二)中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表2-表6。

板内变异系数的计算方法：

板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：

批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：

批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2、牛奶的精密度试验结果

表3、奶粉样品精密度试验(添加浓度2.0mg/kg)

表4猫粮样品精密度试验(添加浓度10.0mg/kg)

表5鸡蛋样品精密度试验(添加浓度20.0mg/kg)

表6饲料样品精密度试验(添加浓度50.0mg/kg)

结果表明，本试剂盒对以上5种添加样品，板内变异系数小于10％，批内变异系数小于15％，批间变异系数小于20％，满足试剂盒精密度的规定。

3、样本回收率试验

向不含三聚氰胺的样品(牛奶、奶粉、猫粮、鸡蛋和饲料)中分别添加不同浓度的三聚氰胺标准品，按照(二)中所述方法进行前处理，得到样本溶液，再进行检测。每个浓度做5个平行，分别计算回收率(回收率(％)＝实测值/添加值×100％)。

结果见表7、表8。

表7试剂盒的样本回收率测定(1)

表8试剂盒的样本回收率测定(2)

从表中可看出，牛奶样品的添加回收率在72.1％～94.1％之间；奶粉和猫粮样品的添加回收率在73.2％～99.8％之间；鸡蛋和饲料样品的添加回收率为76.1％～108.0％，符合准确度的测定标准。

4、交叉反应率试验：

选择与三聚氰胺类似结构的化合物和临床使用的代表兽药，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。

结果如表9所示。

表9试剂盒的特异性

名称	交叉反应率(％)
		三聚氰胺	100.0
三聚氰酸	＜10
		三聚氰酸一酰胺	＜0.1
三聚氰酸二酰胺	＜0.1
		其他三嗪类类似物	＜0.1
四环素	＜0.1
		庆大霉素	＜0.1
氨苄青霉素	＜0.1

实验表明，本发明试剂盒对三聚氰胺的特异性好，即本发明试剂盒可以检测三聚氰胺。

5、试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

Claims (7)

1.一种三聚氰胺单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。

2.权利要求1所述三聚氰胺单克隆抗体在制备检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒中的应用。

3.一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述酶联免疫试剂盒：

1)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1中所述三聚氰胺单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、权利要求1中所述三聚氰胺单克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、权利要求1中所述三聚氰胺单克隆抗体；其中，所述三聚氰胺单克隆抗体作为包被原；

4)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1中所述三聚氰胺单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原；

所述三聚氰胺半抗原的结构式如式I所示：

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为卵清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白或血蓝蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺标准品溶液、底物显色液、洗涤液和样品稀释液；

所述三聚氰胺标准品溶液为浓度分别为0μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、500μg/L和2500μg/L的三聚氰胺标准品溶液；

所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为浓度为1.5％-2.5％的过氧化脲的水溶液，B液为浓度为0.5％-1.5％的四甲基联苯胺的水溶液；

所述洗涤液为浓度为0.8％～1.2％的吐温20和浓度为0.3％-0.7％的叠氮化钠的0.005M-0.015M磷酸盐缓冲液；

所述样品稀释液为20×(0.03mol/L-0.05mol/L)的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

7.一种检测样品中三聚氰胺的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求3-6中任一所述酶联免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)、d)、e)和f)中的任一：

a)所述待测样品为奶粉；每取0.8g-1.2g所述奶粉溶于8ml-12ml权利要求5中所述样品稀释液中，混合均匀，离心，取上清液，即为待测样本溶液；

b)所述待测样品为牛奶；将所述牛奶与权利要求5中所述样品稀释液按照1∶(9-11)的体积比混匀，得到的溶液即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为蛋；将每0.8g-1.2g蛋用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

d)所述待测样品为宠物食品；将每1.8g-2.2g宠物食品用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

e)所述待测样品为饲料；将每0.8g-1.2g饲料用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

f)所述待测样品为小麦面筋；将每0.1g-0.3g小麦面筋用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液即为待测样本溶液；

所述提取剂的组成为：由Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl、Tween20和水组成，所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述提取剂中的浓度为2.9g/L，所述NaH₂PO₄·2H₂O在所述提取剂中的浓度为0.2g/L，所述NaCl在所述提取剂中的浓度为0.9g/L，所述Tween20在所述提取剂中的浓度为0.05g/L。

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