CN102735842A - 一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法 - Google Patents

一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法 Download PDF

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杜海平
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Abstract

本发明提供了一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，主要包括以下步骤：(1)包被，即以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，取与待检小分子物质相应的小分子物质合成抗原，将其偶联在金磁微粒的表面；(2)封闭，即用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清；(3)与待测物反应，即将待检标本、抗待检小分子物质的单抗、能与单抗发生特异性结合的酶标二抗加入结合有小分子物质合成抗原的金磁微粒中反应，形成特异性抗原-抗体-酶标二抗复合物；(4)清洗；(5)检测。本发明的方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，操作安全，方法简便快速。

Description

一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法
技术领域
本发明涉及一种化学发光免疫学检测小分子物质的方法。
背景技术
目前市场上对小分子物质如某些激素、毒品、药物等检测通用的免疫学检测方法主要包括胶体金免疫层析试纸条检测法(ImmunochromatographicAssay)、酶联免疫分析法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)、放射免疫分析法(Radioimmunoass ay，RIA)等。放射免疫分析法是最早建立的经典的免疫分析方法，检测的准确度较高，最低检测限可达10-3～10-6ug/ml，样品用量少，且不需要作预处理。但由于放射免疫分析法投资成本较高，耗材成本低，操作较为简单，但对操作人员有较大危害，对环境有污染，因此难以推广应用。胶体金法是临床检测产品的主要检测方法，可以实现床边快速检测，方法操作简便，不需要专业人员即可完成。但由于该法只能定性或半定量，不能全定量检测，所以只能用于急诊检测和初步筛查。酶联免疫法可用于定量检测，但是灵敏度较低，而且受人为因素影响大，操作复杂，需要专业人员并配合仪器操作。
磁性复合微粒，又称磁性微球或磁珠，是20世纪70年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的超顺磁性纳微米复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(包括磁性金属如Fe，Co，Ni或其金属氧化物等)构成的胶态复合物。在外加磁场作用下，磁性粒子的超顺磁性可保证既能被快速分离，本身又不会被永久磁化。纳微米级磁性复合微粒具有较高的比表面积，表现出较强的吸附能力。通过物理吸附，或利用修饰在磁性复合微粒表面的活性基团可将酶、抗体、寡核昔酸及核酸等生物活性物质偶联在其表面。
金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，由胶体金颗粒与磁性粒子复合形成的，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及胶体金对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。结合磁性纳米粒子的超顺磁性和金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人研制了Fe304/Au磁性复合微粒，并将其实现了商业化。
化学发光免疫分析技术诞生于1977年。Halmann等根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。该技术包含两个系统，即免疫分析系统和化学发光分析系统。因此，它兼具免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体的特点。免疫分析系统是应用抗原、抗体间反应的原理，通过将化学发光物或酶标记于抗原或抗体上，经过免疫反应，形成抗原-抗体复合物。化学发光分析系统则是在免疫反应结束后，加入酶的化学发光底物，化学发光物质在氧化剂作用下形成激发态的中间体，不稳定的中间体在回到稳定的基态时，将发射出光子，此时可通过化学发光检测器对化学发光强度进行检测。该方法能够进行定性分析和定量分析，是一种综合性技术。
基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。然而，传统的磁性微粒大多是通过表面功能化修饰后带有的的羧基(-COOH)、羟基(-OH)、氨基(-NH2)、醛基(-CHO)等活性基团与抗原或抗体的共价作用将这些抗原抗体偶联在磁珠表面的，偶联过程复杂，而且在偶联时容易导致抗原或抗体失活，不仅偶联效率低，而且浪费成本，由于这些原因，使得基于磁性微粒的化学发光的普及应用受到一定的限制。
发明内容
本发明提供了一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，以解决背景技术检测小分子物质存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。
为实现上述发明目的，本发明给出以下基本解决方案：
一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，包括以下步骤：
(1)包被
以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，取与待检小分子物质相应的小分子物质合成抗原，将其偶联在金磁微粒的表面；
(2)封闭
用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物反应
将待检标本、抗待检小分子物质的单抗、能与单抗发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合有小分子物质合成抗原的金磁微粒中反应，包被在金磁微粒表面的抗原与待检标本共同竞争有限的抗体位点，形成特异性抗原-抗体-酶标二抗复合物；
(4)清洗
用清洗缓冲液清洗抗原-抗体-酶标二抗复合物，磁性分离，弃上清；
(5)检测
向经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-酶标二抗复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的3～50分钟内测量各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成反比关系。
为实现更好的检测效果，步骤(1)具体可以包括以下步骤：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3遍；
(1.2)偶联：将小分子物质合成抗原与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
(1.3)清洗：用清洗缓冲液清洗2～5次，磁性分离，弃上清；
步骤(2)中用封闭液进行封闭的过程具体是：在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；
步骤(3)反应的条件为：将待检标本、抗小分子物质的单抗、酶标二抗加入金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应0.5～1小时。
步骤(1.2)偶联缓冲液的较佳选择为以下缓冲液中的任一种：
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的磷酸盐(PBS)缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的碳酸盐(CBS)缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液；
相应地，步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液可以采用浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或摩尔浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
上述步骤(1)中采用的小分子物质合成抗原的载体蛋白一般可采用BSA、OVA、或HSA中的一种；
为了有更好的封闭、清洗效果，步骤(2)中采用的封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、明胶、赖氨酸或动物血清之中的任一种或其中2～3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1～10％；所述动物血清为小牛血清或山羊血清；步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.02～0.2％吐温的该种缓冲液：
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)；
相应的，步骤(2)中采用的保存缓冲液可以选自以下缓冲液中的任一种：
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液；
步骤(3)中采用的酶标二抗是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔；
步骤(4)中采用的清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液；
步骤(5)中采用的化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。其中，1，2-二氧乙烷类衍生物具体可以是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
上述步骤(2)清洗缓冲液采用还含吐温0.05％的缓冲液，则效果最佳。
本发明具有以下优点：
(1)本发明采用的金磁微粒，兼有磁性纳米粒子的超顺磁性及胶体金表面高效偶联生物/药物分子的性能。由于金磁微粒可以借助表面的静电作用、疏水作用及Au-SH作用等非共价键作用，物理性的吸附抗原或抗体等蛋白物质，偶联率高，偶联效果稳定、而且在偶联过程中能够保证抗原或抗体的活性不受影响，大大节约了包被时间，并简化了包被步骤。
(2)本发明以金磁微粒为载体，结合化学发光检测系统，建立了基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，由于金磁微粒对蛋白质等大分子物质具有的高吸附能力，加之其兼备酶联免疫分析的高特异性、无污染的特点，还保留了化学发光法的高灵敏度，弥补了它在特异性上的不足。该方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，操作安全，方法简便快速。尤其在检测灵敏度、特异性、准确度及精密度方面均比显色法酶免检测有显著提高。
附图说明
图1是本发明所用的固相载体-金磁微粒的结构示意图；
图2是本发明的方法中用金磁微粒包被小分子物质合成抗原的操作示意图；
图3是本发明的基于金磁微粒化学发光竞争法原理示意图；
图4是基于金磁微粒的化学发光检测吗啡的剂量-反应曲线；
图5是基于金磁微粒的化学发光检测睾酮的剂量-反应曲线。
具体实施方式
以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限；本领域技术人员应当能够基于本发明的原理在合理的范围内确定实验条件和设定参数，仍可实现本发明的发明目的。
实施例1：基于金磁微粒的化学发光免疫学定量检测人血液或尿液中吗啡的方法
(1)包被
(1.1)预处理：取5mg/mL的金磁微粒200u L，用pH＝7.4，浓度为0.02MTris-HCl偶联缓冲液200u L清洗2次，平衡磁粒的pH。
(1.2)偶联：将吗啡合成抗原溶解于200u L pH＝7.4，浓度为0.02MTris-HCl偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37℃，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
(1.3)清洗：加入400u L浓度为0.02M Tris-HCl清洗缓冲液，磁性分离，弃上清。
(2)封闭：向金磁微粒中加入1mL含5％脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液中，于37℃，180rpm，摇床中反应1小时，磁性分离，弃上清。用1mL pH＝7.4，浓度为0.02M Tris-HCl缓冲液清洗4次，磁粒悬于1mL pH＝7.4，浓度为1×PBS的保存缓冲液中，4℃备用。
(3)与待测物结合：取出包被后的金磁微粒，于室温下平衡10分钟，依次加入包被有吗啡抗原的金磁微粒30uL、待测样本或标准品(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)各50uL、抗吗啡单抗50uL和HRP标记羊抗鼠50uL，置摇床中反应1h，形成特异性抗原-抗体-酶标二抗复合物；
(4)清洗：取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用添加0.05％吐温20，pH＝7.4，浓度为1×PBS的清洗缓冲液清洗5次，磁性分离，弃上清；
(5)检测：将经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-酶标二抗复合物的金磁微粒转入96孔板，并向其加入发光底物鲁米诺溶液100uL，于加入后的3～50min内检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系如图四所示，在5ng/ml～1000ng/ml范围内线性较好，最低检出限可达
实施例2基于金磁微粒的化学发光免疫学定量检测人血清中睾酮的方法
除了以睾酮合成抗原包被金磁微粒、抗睾酮多克隆抗体检测，碱性磷酸酶标记羊抗兔抗体，化学发光系统采用的是1，2-二氧乙烷类衍生物如3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷(AMPPD)，以及建立标准曲线时采用的睾酮标准品浓度不同外，其他具体步骤同实施例1。
结论：图4是基于金磁微粒的化学发光检测吗啡的剂量-反应曲线，在5ng/ml～1000ng/ml线性良好，IC50为59.8ng/ml，最低检测线达0.46ng/ml。
图5是基于金磁微粒的化学发光检测睾酮的剂量-反应曲线，在0.1ng/ml～20ng/ml的范围内线性良好，最低检出限达0.05ng/ml。

Claims (6)

1.一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，包括以下步骤：
(1)包被
以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，取与待检小分子物质相应的小分子物质合成抗原，将其偶联在金磁微粒的表面；
(2)封闭
用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物反应
将待检标本、抗待检小分子物质的单抗、能与单抗发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合有小分子物质合成抗原的金磁微粒中反应，包被在金磁微粒表面的抗原与待检标本共同竞争有限的抗体位点，形成特异性抗原-抗体-酶标二抗复合物；
(4)清洗
用清洗缓冲液清洗抗原-抗体-酶标二抗复合物，磁性分离，弃上清；
(5)检测
向经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-酶标二抗复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的3～50分钟内测量各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成反比关系。
2.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，其特征在于：
步骤(1)具体包括以下步骤：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3遍；
(1.2)偶联：将小分子物质合成抗原与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
(1.3)清洗：用清洗缓冲液清洗2～5次，磁性分离，弃上清；
步骤(2)中用封闭液进行封闭的过程具体是：在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；
步骤(3)反应的条件为：将待检标本、抗小分子物质的单抗、酶标二抗加入金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应0.5～1小时。
3.根据权利要求2所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，其特征在于：
步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种：
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的磷酸盐(PBS)缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的碳酸盐(CBS)缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液；
步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或摩尔浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
4.根据权利要求2或3所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，其特征在于：
步骤(1)中采用的小分子物质合成抗原的载体蛋白为BSA、OVA、或HSA中的一种；
步骤(2)中采用的封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、明胶、赖氨酸或动物血清之中的任一种或其中2～3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1～10％；所述动物血清为小牛血清或山羊血清；
步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.02～0.2％吐温的该种缓冲液：
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)；
步骤(2)中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种：
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、
pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、
pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、
pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液、
pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、
pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液；
步骤(3)中采用的酶标二抗是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔；
步骤(4)中采用的清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液；
步骤(5)中采用的化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。
5.根据权利要求4所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，其特征在于：所述步骤(2)清洗缓冲液中含吐温0.05％。
6.根据权利要求4所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法，其特征在于：所述1，2-二氧乙烷类衍生物是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
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