JPH07151759A

JPH07151759A - 反応物を捕捉するための試薬およびその中間体並びに捕捉方法

Info

Publication number: JPH07151759A
Application number: JP6218685A
Authority: JP
Inventors: Shin-Yih Chen; チェンシン−イー
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1995-06-16
Also published as: EP0643305A3; CA2131605A1; AU5935794A; KR950009253A; AU687033B2; EP0643305A2

Abstract

(57)【要約】【目的】反応物を捕捉するのに使用する中間体におい
て、非特異的結合を最小限にし、表面の結合活性をコン
トロールできるものにする。【構成】小さな孔76を含む外面74にはシラン層78が設
けられている。不活性物質80がこのシラン層78と共有結
合して塗膜を形成している。この塗膜に結合パートナー
94が固着されている。不活性物質80が小さな孔76を塞ぎ
シラン層78の全面に亘り設けられているので、結合パー
トナーを浪費することがなく、非特異的結合を最小限に
することができる。さらに結合パートナー94の量を調節
することにより結合活性がコントロールできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試験検定に使用する試薬
物質に関し、より詳しくは、分析検定に使用する不溶性
の固相表面に不活性塗膜が施された中間体に関するもの
である。少なくとも１つの分析物に結合する少なくとも
１つの結合パートナーがこの不活性塗膜に結合して試薬
を形成する。

【０００２】

【従来の技術】生物学の分野において、定質分析および
／または定量分析では、特定の化学種が別の化学種に特
異的に結合し、このような結合が、酵素と基質との相互
作用、抗体と抗原またはハプテンとの特異的結合、相補
的塩基配列の結合またはアニーリング（annealing ）等
の形態を取るという原理がしばしば利用されている。免
疫学の分野においては、そのような分析は通常、液体試
料中の反応物（分析物）に対する結合パートナー（bind
ing partner ）がこの液体試料に対して不溶性である固
相に結合し、この分析物が結合パートナーと複合体を形
成して、反応物の存在および／または濃度を測定する免
疫学的検定の形態をとっている。

【０００３】結合パートナーがそのような検定において
一般的に結合する固相材料および／または表面の例とし
ては、ガラスビーズまたは高分子ビーズ、スライド、タ
イタ板（titre plate ）、試験管の壁、光学導波管、金
属粒子等が挙げられる。結合パートナーを表面に結合さ
せる様々な方法が知られている。最も一般的な方法の１
つによると、グルタルアルデヒド結合を介して結合パー
トナーをシラン被覆表面に共有結合させる。

【０００４】固相表面上に結合パートナーを結合あるい
は充填（load）する現在利用できる技術には欠点があ
る。例えば、グルタルアルデヒドを介して被覆のない固
相表面に結合したタンパク質結合パートナーはアミノ酸
が関与する過剰数の共有結合により結合されることが多
く、その結果タンパク質が部分的または全体的に変性し
てしまって、試験検定において結合パートナーとしての
有効性が損なわれてしまう可能性がある。一方、表面の
反応性を調節するために、結合パートナーで表面の一部
のみを被覆し、大部分の表面を被覆しない状態に維持す
ることが好ましい場合が多い。非被覆表面区域は分析物
が表面に非特異的に結合するのを促進する化学特性を有
することが多く、その場合は必然的に検定を不正確なも
のにしてしまう。非被覆表面区域を被覆し、それによっ
て非特異的結合を少なくするかもしくはなくすために、
そのような表面に安価で免疫学的に不活性な「ブロッキ
ング剤（blocking agent）」を施すこともできる。しか
しながら、そのようなブロッキング剤は時間がたつと表
面から分離し、検定を不正確なものにするだけでなく検
定を一貫性のないものにしてしまうことがある。ブロッ
キング剤はまた結合パートナーを実際に被覆して、結合
パートナーの重量当たりの結合能力を低下させることが
あるので、結合パートナーが高価なものであったり、結
合パートナーを調製するのに時間がかかる場合にはブロ
ッキング剤による被覆は重要な検討事項となる。

【０００５】固相として磁気粒子を用いる検定において
は、そのような複雑な事情を考慮しなければならない。
磁気粒子は、磁界を用いて溶液から都合よく分離できる
表面積の大きい固相材料として機能する。そのような磁
気粒子は一般的に、数多くの孔を含む非常に不規則な表
面区域を有する。そのような孔と不規則性が著しいほど
磁気粒子の表面積が好ましく増大する。しかしながら、
そのような孔が小さいほど以下に記載するような複雑な
状態となる。大量の結合パートナーを磁気粒子の表面に
充填する場合、一般的に小さな孔を満たすのに多くの結
合材料が使われてしまう。非特異的結合を減少させるた
めには、全ての小さな孔を満たし、結合パートナーの層
がばらつきなく表面上を被覆し、実質的に表面が全面に
亘って被覆されるように、過剰の結合パートナーを固相
上に充填する必要がある。しかし、この方法はいくつか
の理由により好ましくない。第１に、上述したように、
結合パートナーは一般的に貴重であるので、その方法は
不経済的である。第２に、充填の最大度よりも少ない特
定の程度まで固相を充填する、すなわち、特定の分析の
ために充填の度合いを調節することが望ましい場合が多
く、これは上記方法のために適していない。第３に、上
記方法はしばしば、特定のバッチの特定の表面特性にあ
る程度依存するので、固相物質のバッチ間で充填がばら
ついてしまう。

【０００６】ハプテンのようなリガンド（ligand）を表
面に充填することが分析に必要とされる場合、リガンド
は一般的に、結合パートナー（すなわち、リガンド）に
より捕捉されるべき反応物（分析物）に対して大部分は
現われなくなってしまうので、不規則過ぎる表面区域は
特に好ましくない。したがって、リガンドを表面に充填
する前に、リガンドを担体分子または接合体に結合させ
ることが普通であるが、この追加の工程により、上記方
法は変化しやすく、得られる結果はばらつきのあるもの
となってしまう。さらに、捕捉されるべき反応物との特
異的反応、または複合体形成（complexation）のために
リガンドを利用できるように、リガンドと担体との接合
体全てが、リガンドの結合部位が特定方向に面するよう
に方向付けられた表面に結合するわけではないので、こ
の方法ではリガンドは浪費されてしまう。

【０００７】米国特許第4,478,946 号は、担体ボディを
覆う架橋フイルムに結合した免疫反応物（immuno-react
ant ）について記載している。記載された架橋フイルム
は、例えば、抗原および抗体のように、それ自身免疫反
応物の部分からなる。好ましい担体ボディは、固体で、
シラン化されていない非多孔性ガラスビーズからなる。
このフイルムは表面に共有結合されていないが、ボディ
の非多孔性表面を覆うように架橋されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、この技術
分野において、非特異的結合が最小限であり、結合パー
トナー物質が浪費されず、特定表面の結合活性をコント
ロールすることができ、充填される表面にバッチ間での
再現性があり、非常に不規則な表面に経済的に、都合よ
く、再現性をもってリガンドを充填できる結合パートナ
ーの表面充填技術が求められている。

【０００９】したがって、本発明の全般的な目的は、都
合良く得られる、不活性の固相上に塗膜層を施した中間
体を提供することにある。この層は表面の小さな孔を封
じている。これらの小さな孔は、結合パートナーを消耗
するには小さ過ぎる寸法で、特定の結合におけるような
複合体形成には利用できない。不活性塗膜層は検定にお
ける非特異的結合を生じ得る区域を覆っており、検定の
結合パートナーはその区域に好ましく結合し得る。

【００１０】（専門語）本発明をより明確に理解するた
めに以下の定義を用いる。

【００１１】「結合パートナーと反応物との対」とは、
抗体と抗原、抗体とハプテン、酵素と基質、酵素と害
剤、酵素と補因子、結合タンパク質と基質、担体タンパ
ク質と基質、レクチンと炭水化物、受容体とホルモン、
受容体と効果器、核酸の相補的な鎖、抑制体と誘発因子
等のような、相互親和性（mutual affinity ）、複合体
形成（complexation）能力または結合能力を示す分子の
対、一般的に特異的結合対または相互作用（複合体形
成：complex-forming ）対またはアニーリング対を意味
する。

【００１２】「結合パートナー」とは、固相に結合され
ている結合パートナーと反応物との対の一部を意味す
る。

【００１３】「反応物」とは、存在および／または濃度
について測定すべき、または望ましくは回収すべき、そ
して分散された媒質から結合パートナーにより捕捉すべ
き結合パートナーと反応物との対の一部を意味する。試
験媒質中の分析物は、回収すべき特異的結合の工業試薬
である、模範的な反応物である。

【００１４】「試験検定」とは一般的に、試験試料中の
結合パートナーと反応物との対の一部が様々な検定様式
により媒質中で検出および／または定量されるいかなる
方法も意味する。例えば、診断方法；分析方法；微量分
析方法；法医学分析（forensic analysis ）；薬物動物
学研究；細胞選別方法；アフィニティークロマトグラ
ム；トキシン、触媒、または開始材料もしくは製品のよ
うな１つ以上の化学種の工業的または研究所の回収また
は分析等を示すのに「試験検定」という用語を用いても
よい。各々が異なる結合パートナーを含む複数の試薬を
用いてそれらの試薬に対応する複数の反応物を捕捉する
方法を示すのに試験検定という用語を用いてもよい。典
型的な試験検定としては免疫学的検定が挙げられる。

【００１５】「複合体」とは、２つ以上の化学種の特異
的結合または相互作用もしくは対合（association ）を
意味する。

【００１６】「捕捉」とは、例えば、試験検定におけ
る、複合体形成による媒質中の反応物の分析、回収、検
出または他の定質もしくは定量測定を意味する。サンド
イッチ免疫学的検定における実施例のように、表面に結
合した結合パートナーは、反応物が別の（一般的に標識
付けられた）結合パートナーまたは別の反応物と複合体
を形成する前また後に、その反応物と複合体を形成す
る。競合検定においては、標識付けられた反応物および
標識付けられていない反応物が、表面に結合した結合パ
ートナーと複合体を形成するために競合する。

【００１７】「不活性」とは、結合パートナーと反応物
とが相互作用する試験検定において、結合パートナーと
ある物質とが相互作用しない化学状態または生物学状態
を意味する。不活性はまた、結合パートナーと反応物と
が相互作用する様式において、結合パートナーまたは反
応物のいずれともある物質が相互作用しない化学状態ま
たは生物学状態を意味するものとしてもよい。

【００１８】「固相」とは、特定の試験検定において捕
獲すべき反応物を含有する媒質に対して不溶性である物
質を意味する。広義の意味においては、固相は、媒質内
に実質的に分散でき、固定化、濾過、分配（partitioni
ng）、遠心分離により媒質から除去または分離できるど
のような実体（entity）、もしくは媒質をその中に分配
できるどのような実体をも意味する。

【００１９】「小さな孔」とは、結合パートナーが小さ
な孔に入ってその中で表面に結合して反応物と複合体を
形成しないほど十分に小さな寸法の固相表面の孔または
他の不規則な箇所を意味する。

【００２０】「塗膜」とは、固相に結合した不活性物質
の層を意味する。

【００２１】「中間体（intermediate）」とは、少なく
とも１つの不活性物質の塗膜層と結合した固相を意味す
る。

【００２２】「試薬」とは一般的に、試験検定のような
複合体形成反応に関与するように修飾した加工物質を意
味し、より詳しくは結合パートナーが結合している中間
体を意味する。

【００２３】「非特異的結合」（ＮＳＢ）とは、結合パ
ートナーと反応物とからなる複合体の形成以外の試験検
定において、存在する試薬と他の化学種との間の望まし
くない相互作用を意味する。

【００２４】「リガンド」とは、結合パートナーと反応
物との対の一員または成分である、ハプテンのような小
さな分子を含む物質または物質の群を意味する。

【００２５】「標識」とは、結合反応を検出するための
信号を発生できる原子または分子部分を意味する。標識
の例としては、制限するものではないが、放射性同位元
素、酵素、発光剤、沈殿剤、および染料等が挙げられ
る。

【００２６】「試料」は、試験検定において捕捉すべき
反応物を含有するいかなる媒質をも意味する。

【００２７】

【課題を解決するための手段】本発明の上述した目的お
よび他の目的並びに利点は、外面を有する固相からなる
中間体を用意し、不活性物質をこの外面に共有結合させ
て前記固相上に塗膜を形成し、反応物を捕捉するための
結合パートナーに結合できるようにこの塗膜を選択する
ことにより達成できる。

【００２８】本発明の別の目的は、外面を有する固相か
らなる中間体を提供することにあり、ここでその外面が
実質的に非架橋の不活性物質に結合してこの外面上に塗
膜を形成し、反応物を捕捉するための結合パートナーを
固着できるようにこの塗膜を選択する。

【００２９】本発明の別の目的は、外面を有するシラン
化された固相からなる中間体を提供することにあり、こ
こで外面が不活性物質に結合してその外面上に塗膜を形
成し、反応物を捕捉するための結合パートナーを固着で
きるように選択する。

【００３０】本発明の別の目的は、反応物の結合パート
ナーを使用することにより少なくとも一種類の反応物を
捕捉する試薬であって、外面を有する固相、その外面に
共有結合して塗膜をその外側表面上に形成する不活性物
質、およびその不活性物質に結合した少なくとも一種類
の結合パートナーからなる試薬を提供することにある。

【００３１】本発明の別の目的は、反応物の結合パート
ナーを使用することにより少なくとも一種類の反応物を
捕捉する試薬であって、外面を有する固相、その固相に
結合させてその固相上に塗膜を形成する実質的に非架橋
の不活性物質、およびその不活性物質に結合した少なく
とも一種類の結合パートナーからなる試薬を提供するこ
とにある。

【００３２】本発明の別の目的は、反応物の結合パート
ナーを使用することにより少なくとも１種類の反応物を
結合させる試薬であって、外面を有するシラン化された
固相、その固相に結合させてこの固相上に塗膜を形成す
る不活性物質、およびその不活性物質に結合した少なく
とも一種類の結合パートナーからなる試薬を提供するこ
とにある。

【００３３】本発明の別の目的は、外面を有する固相、
およびその外面に共有結合させてその外面上に塗膜を形
成する不活性物質からなる、反応物を捕捉するキットで
あって、ここで、反応物を捕捉するための結合パートナ
ーを固着するように塗膜を選択したキットを提供するこ
とにある。

【００３４】本発明の別の目的は、外面を有する固相、
およびその外面に結合させてその外面上に塗膜を形成す
る実質的に非架橋の不活性物質からなる、反応物を捕捉
するキットであって、ここで、反応物を捕捉するための
結合パートナーを固着するように塗膜を選択したキット
を提供することにある。

【００３５】本発明の別の目的は、外面を有するシラン
化した固相、およびその外面に結合してその外面上に塗
膜を形成する不活性物質からなる、反応物を捕捉するキ
ットであって、ここで反応物を捕捉するための結合パー
トナーを固着するように塗膜を選択したキットを提供す
ることにある。

【００３６】本発明の別の目的は、中間体を製造する方
法であって、外面を有する固相を用意し、不活性物質を
その外側表面に共有結合させてその外面上に塗膜を形成
させる各工程からなり、ここでその不活性物質を、反応
物を捕捉するための結合パートナーを固着するのに適す
るように選択したことを特徴とする方法を提供すること
にある。

【００３７】本発明の別の目的は、外面を有する固相
と、その外面と共有結合してその外面上に塗膜を形成す
る不活性物質と、その不活性物質に結合した、反応物と
複合体を形成できる少なくとも一種類の結合パートナー
とを含む試薬を用意し、その試薬と反応物を含有する試
料との混合物を形成する各工程からなる、少なくとも一
種類の反応物を捕捉する方法を提供することにある。

【００３８】本発明の別の目的は、外面を有する固相
と、その外面と結合してその外面上に塗膜を形成する実
質的に非架橋の不活性物質と、その不活性物質に結合し
た、反応物と複合体を形成できる少なくとも一種類の結
合パートナーとを含む試薬を用意し、その試薬と反応物
を含有する試料との混合物を形成する各工程からなる、
少なくとも１つの反応物を捕捉する方法を提供すること
にある。

【００３９】本発明のさらなる別の目的は、シラン化さ
れた外面を有する固相と、その外面と結合してその外面
上に塗膜を形成する不活性物質と、その不活性物質に結
合した、反応物と複合体を形成できる少なくとも一種類
の結合パートナーとを含む試薬を用意し、その試薬と反
応物を含有する試料との混合物を形成する各工程からな
る、少なくとも１つの反応物を捕捉する方法を提供する
ことにある。

【００４０】当業者にはこれらと他の目的が明確なよう
に、本発明は、明細書に記載し、請求の範囲に含まれる
要素の組合せにある。

【００４１】

【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。

【００４２】ここで図１を参照する。従来技術による免
疫学的検定の試薬として使用するために調製した磁気粒
子の部分断面図を概して10で示す。この図はシラン層16
により被覆された非常に不規則で多孔性である表面14を
有する金属コア12を示している。結合パートナー18はグ
ルタルアルデヒド20を介してシラン化された表面に共有
結合しており、このグルタルアルデヒド20はシラン層16
を完全に被覆している。図１は、シラン層とグルタルア
ルデヒドとの間の反応が化学反応であるように、グルタ
ルアルデヒドと結合パートナーとの間の反応が化学反応
であることを説明することを目的としたものである。

【００４３】金属コア12は一般的に非常に不規則な表面
区域を有する。表面と質量の比率が大きいことが望まし
いので、このような金属コア12は多くの場合に好まし
い。実際、図１は、大きな不規則性または孔の内部を含
む磁気粒子の表面のあらゆる区域を示している。

【００４４】しかしながら、金属コア12は一般的に小さ
な孔22も有し、結合パートナー18のいくつかが充填中に
その小さな孔22中に入ってしまう。他の結合パートナー
は小さな孔22の開口部24を塞ぎ、小さな孔内の結合パー
トナーのいくつかを、従来技術の試薬10がさらされてい
る反応物27を含有する試料溶液26から隔離してしまうこ
とがある。

【００４５】図１に示した従来技術の粒子試薬により、
結合パートナー18は最大限には充填されないことが分か
る。すなわち、粒子表面を完全に被覆するのに必要な量
よりも少ない量の結合パートナーが実際に充填され、そ
の結果、粒子表面の複数の非被覆部分30が試料溶液26中
の反応物27にさらされてしまう。従来技術により調製し
た固相表面の非被覆部分30と反応物との相互作用は一般
的に非特異的結合となってしまう。

【００４６】図１に説明した実施態様によると、結合パ
ートナー18はグルタルアルデヒド20に直接結合してい
る。固相に結合パートナーを結合させるグルタルアルデ
ヒドは、未知の化学特性を有し、結合パートナーを過剰
に共有結合させ、しばしば結合パートナーを変質させて
しまう。

【００４７】ここで図２を参照する。別の従来技術によ
る免疫学的検定の試薬として使用するために調製した磁
気粒子の部分断面図を概して40で示す。図２および続い
ての図面において、様々な図面に用いた共通の要素は、
各々に共通の数字を用いて参照するものとする。図２に
示した方法によると、粒子には結合パートナーが最大限
に充填されている。すなわち、粒子の表面が実質的に完
全に覆われている程度まで結合パートナーで充填されて
いる。粒子表面はこのように「塞がれ」、粒子表面区域
30として露出されている区域はわずかしか、もしくはま
ったくなく、したがって、非特異的結合を減少させるこ
とができる。しかしながら、小さな孔22を満たすためだ
けに大量の結合パートナー18が消費されるので、浪費と
なってしまう。さらに、このような方法で表面を塞ぐた
めには、表面を充填する度合いをコントロールすること
は不可能である。

【００４８】図３は、ブロッキング剤を用いて非特異的
結合を減少させ、一方で結合パートナーの充填を最大よ
り少なくした理想化した粒子状の従来技術の免疫学的検
定試薬50の部分断面図である。試薬50は、小さな孔がま
ったく存在しない点で理想化され、わずかに不規則な表
面54のみを有する金属コア52を含む。シラン層16はコア
52の表面54を実質的に完全に被覆し、結合パートナー18
が共有結合するグルタルアルデヒド層20により活性化さ
れている。ある量の結合パートナー18が、粒子状の従来
技術の試薬50の表面を完全に覆うのに必要な量より少な
い量でグルタルアルデヒド層20上に充填されている。上
述したように、この方法は免疫学的検定において好まし
いことが多いが、非特異的結合の一因となる、粒子の表
面の一部をさらした状態のままにしてしまう。したがっ
て、結合パートナー18をグルタルアルデヒド20に結合さ
せた後、一般的に安価な免疫学的に不活性なタンパク様
の物質からなるブロッキング剤56を試薬に吸着させる。
ブロッキング剤56が、従来技術の試薬50の結合パートナ
ー18により被覆されない表面を実質的に完全に覆うこと
が理想的である。

【００４９】磁気粒子は一般的に、図３に示したよう
に、その表面に小さな孔のないことがない。そのような
理想化された粒子が存在したとしても、図３に示したよ
うな理想化された従来技術の試薬50は、ことによると変
質する、グルタルアルデヒド20に共有結合した結合パー
トナー18を含み、いかなるブロッキング剤56も粒子の表
面から浸出するので、非特異的結合の一因となる表面区
域をさらしてしまう。

【００５０】図４に、ブロッキング剤を含む粒子状の従
来技術の試薬のより現実的な部分断面図を示す。図４に
おいて、結合パートナー18を最大充填量より少ない量で
充填した後にブロッキング剤56を塗布する工程を含む方
法にしたがって、従来技術の試薬60を調製した。この方
法によると、依然として小さな孔22を満たす結合パート
ナー18を浪費し、またグルタルアルデヒド20による直接
の結合のために結合パートナー18が変質し、ブロッキン
グ剤56が浸出する可能性もあり、粒子表面のある区域を
さらしてしまうこととなり、非特異的結合となってしま
う。さらに、ブロッキング剤56は、理想的な様式によっ
ても結合パートナー18のいくつかを覆い得るので、効果
的でなくなり結合パートナー18を浪費してしまう。

【００５１】図１−４に示した従来技術の実施態様の全
てにおいては、結合パートナーの充填量が一致せず再現
性のないこと、検定における非特異的結合、および結合
パートナーの浪費が重大な問題となっている。

【００５２】ここで図５は、本発明のある実施態様によ
り調製した試薬70を部分的断面図として示した図であ
る。試薬70は、不規則表面74を有し、実質的に完全に表
面74を覆い得る被覆層78を含む固相72からなる。

【００５３】固相72は、免疫学的検定または他の試験検
定技術に従来用いられるいかなる支持体であってもよ
く、その例としては、一般的に、粗くても粗くなくても
よいガラス板またはビーズ、ポリスチレンのような高分
子ビーズ、ケイ素ビーズ、磁気金属粒子のような磁気粒
子、磁気ポリアクリルアミド−アガロースビーズ、光学
導波管、試験管壁、タイタ板、セファデックスゲルのよ
うな分析物−溶液−不溶性ゲル、シリカ、ケイ灰石、乾
燥シリカゲル、ベントナイト、アルミナ、ヒドロキシリ
ン灰石（hydroxy apatite ）等が挙げられる。本発明の
好ましい実施態様によると、固相72は、米国特許第4,55
4,088 号に記載されここに参照文献として引用したよう
な、金属酸化物結晶の凝集塊のコアからなる。固相は、
強磁性金属酸化物結晶（すなわち、磁界にさらすと永久
に磁化される結晶）または超常磁性（superparamagneti
c ）金属酸化物結晶（すなわち、磁界にさらされても永
久に磁性とはならない結晶）からなるものであってもよ
く、超常磁性金属酸化物結晶が好ましい。好ましい超常
磁性金属酸化物結晶は、約0.03ミクロン未満の結晶サイ
ズを有し、その例としては、酸化鉄、酸化コバルト、酸
化マンガン、酸化マグネシウム、酸化ニッケル、酸化亜
鉛、酸化銅等のような、いかなるアルカリ土類金属酸化
物物質または遷移金属酸化物物質が挙げられる。凝集塊
からの結晶は、試験検定または他の用途に用いられる粒
子を分散させるのに十分な時間に亘り実質的な重力沈降
（gravitational settling）を避けるほど好ましくは十
分に小さい群集となる。それらの結晶は永久に磁化され
ず、したがって、磁気的に凝集しないので、好ましい粒
子は再度分散し得る。

【００５４】固相72の表面区域の一部、および好ましい
実施態様による表面区域全体を、金属酸化物のコアを封
じてさらなる粒子の修飾のために反応的な機能性を与え
るように、層78で被覆する。好ましくは、層78は、コア
72によく接着し、一種類以上の不活性物質が結合して塗
膜を形成する露出官能基を与える物質からなる。そのよ
うな結合は、吸収結合（absorptive coupling ）または
共有結合の形態をとってもよく、共有結合が好ましい。
共有結合を行なうために、層78は好ましくは、アミド、
エステル、エーテル、スルホンアミド、ジスルフィド、
アゾ、または他の適切な有機結合のような結合により、
塗膜層に共有結合する官能基を含む。

【００５５】好ましい実施態様によると、層78はシラン
塗膜からなる。ここに用いているように、シランという
用語は、米国特許第3,652,761 号、および第4,554,088
号に記載されているようないかなる二官能オルガノシラ
ンをも意味する。これらの特許をここに引用する。その
ようなシランは、有機機能性でありかつシリコン機能性
のシリコン（organo-functional and silicon-function
al silicon）からなる化学種として定義され、シリコン
部分は無機物質についての親和力を有し、一方有機部分
は有機物質に結合するように作られている点で特徴付け
られている。シリコン機能性が確実にコアに結合し、有
機官能性がタンパク質のような有機物質に結合するため
にさらされているので、シランは金属酸化物のコアを被
覆するのに特に適している。好ましくは、タンパク質の
ような有機物質が結合し得る本発明の層78としての使用
に適したシランの有機機能性は、限定するものではない
が、ジアゾ化、カルボジイミド結合、およびグルタルア
ルデヒド結合を含む結合化学的性質にかなう。好ましい
シランは、一般式Ｒ−Ｓｉ（ＯＸ）₃を有する。ここで
（ＯＸ）₃は、トリアルコキシ基、典型的なトリメトキ
シまたはトリエトキシを示し、Ｒは、アミノフェニル、
アミノ、ヒドロキシル、スルフィドリル、脂肪族、親水
性または混合機能（両親媒性）または塗膜層への結合、
好ましくは共有結合に適した他の有機基が末端となる、
アリール基、アルキル基またはアラルキル基を示す。適
したシランの非制限の模範的な例としては、ｐ−アミノ
フェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン、トリアミノ官能シランｎ
−ドデシルトリエトキシシラン、ｎ−ヘキシルメトキシ
シラン、およびＨ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ
₂−ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓｉ−（ＯＣＨ₃）₃
等が挙げられる。

【００５６】本発明の塗膜層78としての使用に特に適し
たものは、３−アミノプロピルトリメトキシシランであ
り、ここでトリメトキシシリル官能性は固相のコア72に
確実に結合し、有機種に結合するために塗膜78の表面で
さらされるアミノ基を含む。

【００５７】本発明の好ましい固相は、シラン層78で被
覆した磁気金属酸化物コア72を含み、シラン層78の表面
は本発明の好ましい固相外面を示している。好ましい実
施態様によると、試薬70の表面はシラン層78により部分
的にまたは完全に被覆され、試薬70の表面は不活性物質
80の塗膜層により完全に被覆されている。物質80は、固
相の支持表面を共有的または吸収的に好ましく被覆し得
る物質からなる。さらに、物質80は不活性でなければな
らない。ここに用いているように、「不活性」物質は、
結合パートナーと化学的または生物学的に相互作用しな
い物質を示すことを意味し、好ましくは、結合パートナ
ーと複合反応物（complexing reactant）とが相互作用
するような様式では反応物とは相互作用しないものを意
味する。例えば、免疫学的検定において、物質80は検定
分析物の結合パートナーに対して免疫学的に不活性でな
ければならず、好ましくは同様に分析物に対しても不活
性でなければならない。当業者には明確なように、「不
活性」という用語は、本発明の中間体、試薬、キットま
たは方法を使用すべき特定の目的に関して定義しなけれ
ばならない。すなわち、ある実施態様によると、第１の
物質は不活性物質80として機能し得るが、第２の物質は
試験検定における結合パートナーを定義し、一方第２の
実施態様においては、第２の物質は不活性物質80を定義
し得るが、第１の物質はその実施態様による結合パート
ナーを定義し得る。

【００５８】固相表面に共有結合するように不活性物質
80を選択する場合、そのような共有結合できる官能基を
含むように不活性物質80を選択する。好ましくは、その
ような官能基は共有結合を形成するように選択し、それ
ら官能基の例としてはアミド、エステル、エーテル、ス
ルホンアミド、ジスルフィド、アゾ等が挙げられる。し
たがって、物質80は好ましくは、−Ｓ−Ｓ、−ＮＲ₂、
−ＣＯＯＲ、−ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、および−ＯＣ
ＯＲからなる群より選択される少なくとも１種の官能基
を含む物質からなり、ここでＲは水素または炭化水素の
ような有機基である。ここに用いているように、「炭化
水素」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロ
アルキル、アリール、アルカリル（alkaryl ）、アラル
キル等を含む。炭化水素基は、例えば、メチル、プロペ
ニル、エチニル、シクロヘキシル、フェニルまたは誘導
体、トリル、およびベンジル基であってもよい。

【００５９】不活性物質80は、タンパク様の物質または
非タンパク様の物質であってもよく、好ましくは、小さ
な孔76のような表面の不規則性の充填を含む、比較的大
量の固相物質の表面を完全に被覆するのに十分な量で比
較的容易に得られるタンパク様物質である。さらに、不
活性物質80は好ましくは、中間体またはさらに加工され
たときに試薬を形成するように被覆された固相について
比較的長い棚寿命に亘り構造的完全さを保持するように
選択し得る。

【００６０】本発明による不活性物質80としての使用に
適した非制限の模範的な例としては、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、アポ
フェリチン、オバルブミン、アビジン、ストレプトアビ
ジン（streptavidin：ＳＡＶ）、ビオチン、ペプチド、
ポリアミノ酸および合成ポリアミノ化合物のようなタン
パク様物質、並びに非タンパク様ポリアミノ酸および合
成ポリアミノ化合物等が挙げられる。

【００６１】様々な結合化学的性質を用いて不活性物質
80を固相表面に結合させてもよく、選択した特別な化学
的性質は、層78の表面でさらされる官能基および物質80
中に含まれ結合に利用できる官能基にいくぶん依存す
る。層78がシランからなり、結合に利用できる露出され
た−ＮＨ₂基を含む好ましい実施態様によると、物質80
はウシガンマグロブリンのような、結合に利用できるカ
ルボキシル基を含むタンパク様物質からなる。この実施
態様によると、カルボキシル基を活性化するように選択
した活性化剤を用いてもよく、そのような過剰の量の試
薬は結合が完了した後に好ましくは比較的容易に洗い流
される。そのような活性化剤の非制限の模範的な例とし
ては、ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシ−トリス（ジメ
チルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー
ト；ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ、Ｎ、Ｎ′、
Ｎ′−テトラメチルウロニウム（tetramethyluronium）
ヘキサフルオロホスフェート；ｏ−ベンゾトリアゾル
−１−イル−Ｎ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ′−テトラメチルウロニ
ウムテトラフルオロボレート；１、１′−カルボニル
ジイミダゾール；１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスル
ホネート；Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド；Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドペン
タクロロフェノール複合体；Ｎ、Ｎ′−ジイソプロピル
カルボジイミド；５、５′−ジメチル−１、３−シクロ
ヘキサンジオン；ジフェニルホスフィニルクロライ
ド；ジフェニルホスホリルアジド；ジフェニルホスホ
リルクロライド；２、２′−ジチオジピリジン；Ｎ−
エトキシカルボニル−２−エトキシ−１、２−ジヒドロ
キノリン；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド；１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドメチオジド；Ｎ−
エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３′−スル
ホネート；Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３
−ジカルボキシイミド；イソブチルクロロホルメー
ト；およびビス（２−オキソ−３−オキソアゾリジニ
ル）−ホスホニッククロライド等が挙げられる。特に好
ましい活性化剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（Ｅ
ＤＣ）である。この実施態様によると、不活性物質80は
固相の外面に直接共有結合する。

【００６２】同種二官能または異種二官能の結合剤を用
いて層78に不活性物質80を共有結合させる方法もまた本
発明の範囲内に含む。この実施態様を説明するために図
６を参照する。試薬90を部分的な断面図として示し、こ
の試薬90は、層78に共有結合した結合剤（coupling age
nt）92を含み、不活性物質80はその結合剤92に共有結合
している。結合剤92は、層78の露出表面上に存在し得る
上述した官能基と共有結合できる、不活性物質80への結
合に利用し得る上述した官能基と結合できる官能基を有
する様々な二官能剤からなるものであってもよい。その
結果、それぞれの結合化学的性質は、アミド、エステ
ル、エーテルスルホンアミド、ジスルフィド、アゾ、
または他の有機結合のような、層78と結合剤92との間、
および結合剤92と不活性物質80との間の共有結合とな
る。本発明における結合剤92としての使用に適した異種
二官能結合剤の非制限の模範的な例としては、スクシン
イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート、スルホスクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシ
ンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエー
ト、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドヒドロキシクロライ
ド、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド等が挙
げられる。本発明における結合剤92としての使用に適し
た同種二官能結合剤の非制限の模範的な例としては、エ
チレングリコルビス（スクシンイミジルスクシネー
ト）；エチレングリコルビス（スルホスクシンイミジ
ルスクシネート）；ジスクシンイミジルタータレー
ト；ジスルホスクシンイミジルタータレート；ビス
［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチ
ル］スルホン；ビス［２−（スルホスクシンイミドオキ
シカルボニルオキシ）エチル］スルホン；ジメチルア
ジポイミデート．２ＨＣｌ；ジメチルピメロイミデー
ト．２ＨＣｌ；ジメチルスベロイミデート．２ＨＣｌ；
ジメチル−３、３′−ジチオビスプロピオンイミデー
ト．２ＨＣｌ；ビスマレイミドヘキサン；１、５−ジフ
ルオロ−２、４−ジニトロベンゼン；４、４′−ジイソ
チオシアノ−２、２′ジスルホン酸スチルベン二ナトリ
ウム塩；ジスクシンイミジルスベレート；ビス（スルホ
スクシンイミジル）スベレート；ジチオビス（スクシン
イミジルプロピオネート）；および３、３′−ジチオビ
ス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）等が挙げ
られる。さらに、不活性物質80の塗膜を層78に結合させ
る結合剤92としてグルタルアルデヒドを用いてもよく、
グルタルアルデヒドの使用は、層78がシランコーティン
グからなり不活性物質80の塗膜がウシ血清アルブミンか
らなる場合に特に好ましい。

【００６３】上述したように、本発明のある実施態様に
よると、不活性物質80が固相の表面に吸収的に被覆され
ている。そのように固相を吸収的にコーティングするこ
とは、固相が特に不規則な表面を有する場合、または不
活性物質80と固相の表面との間のファンデルワールス相
互作用が最大となる状況において、特に効果的である。
そのような吸収的コーティングは、固相がシラン化され
ていないまたはシラン化されている磁気金属粒子、もし
くは粗いガラスビーズ、粗い高分子ビーズ、粗い板等の
ような粗面からなる場合に特に効果的である。不活性物
質80の固相表面への結合にそのような吸収的結合が利用
される場合には、不活性物質80は分子間架橋されていて
も、または実質的に架橋されていない状態のままであっ
てもよい。好ましい実施態様によると、不活性物質80
は、固相に吸収的に結合した場合には実質的に架橋され
ていない状態のままである。不活性物質80を固相に結合
させる際に吸収的結合を選択する場合には、免疫学的検
定のような捕捉工程において不活性物質80の塗膜層を含
む試薬の非特異的結合の度合いを測定することにより吸
収的相互作用の安定性を試験してもよい。

【００６４】これまで記載してきたように、本発明の不
活性物質80は免疫学的検定等のような試験検定において
用いるべき固相の表面に吸収的または共有的に結合して
おり、結合パートナーに対して、および好ましくは結合
パートナーとともに複合体を形成する分析物のような反
応物に対しても不活性となるように不活性物質80は選択
されている。小さな孔76を満たし、また表面を確実に覆
って検定における非特異的結合を最小限にするために固
相表面を比較的安価に完全に被覆することができるよう
に、不活性物質80を容易に得られるように選択すること
が好ましい。不活性物質80は好ましくは、小さな孔76が
満たされるかまたは塞がれて固相表面が実質的に完全に
覆われる程度まで固相表面を被覆するが、結合パートナ
ーが結合するのに利用できる表面区域が減少してしまう
程は固相表面に充填されない。これは、過剰の結合パー
トナーが結合後に表面から洗い流されるという実施例に
おいて以下に記載する工程により行なわれる。

【００６５】これまで記載した本発明は固相からなるも
のであり、固相の外面が不活性物質80により吸着的、ま
たは好ましくは共有的に覆われて塗膜が形成されてい
る。好ましい実施態様によると固相の外面は不活性物質
80により実質的に完全に覆われて塗膜が形成されてい
る。本発明の製造物は、以下に記載する本発明の第２の
特徴による試薬を製造する中間体生成物または前駆体と
して機能できる。この中間体を調製して貯蔵し、様々な
試験検定に使用する様々な試薬を製造する基としてこの
中間体を使用することができる。

【００６６】本発明の不活性物質を含むそのような中間
体を調製することに特有の利点は、それに続く試薬を調
製するために、これらの中間体を貯蔵できることであ
る。従来のシラン化磁気粒子を粒子が互いに近接するよ
うに貯蔵する場合、粒子間結合（例えば、シロキサンを
形成する架橋結合）により個々の粒子より著しく大きな
直径のシラン化粒子の凝集塊が生成されてしまうことが
ある。そのような凝集塊の表面積は単位重量当たり小さ
いので、結合パートナーと結合する能力は低くなってし
まう。そのような凝集塊の重力沈降時間（gravitationa
l settling time）は短すぎてその凝集塊を多くの用途
に用いることができない。本発明の被覆粒子を使用すれ
ば、この粒子間凝集塊の問題をある程度克服することか
できる。

【００６７】ここで図５および６を参照する。本発明の
第２の特徴によると、結合パートナー94は、好ましくは
反応物27を含む溶液26にさらされるように、不活性物質
80に結合して試験検定に使用するための試薬を形成す
る。結合パートナー94は、不活性物質80に吸収的または
共有的に結合していてもよく、好ましい実施態様におい
ては共有結合している。

【００６８】結合パートナー94は、ホルモン、薬物助剤
（pharmacologic agents）、ビタミン、補助因子、血液
物質、ウイルス抗原、核酸、ヌクレオチド、グリコシ
ド、糖、トキシン、リガンド、核酸鎖、標的分子等を含
む様々な反応物を捕捉するように選択することができ
る。したがって、診断方法；微量成分分析方法；法医分
析（forensic analysis ）；薬物動力学研究；細胞分類
システム；親和性クロマトグラフィー；トキシン、触媒
または開始材料もしくは生成物のような化学種の工業的
または研究所的な回収もしくは分析等に本発明の試薬、
キット、および／または方法を使用できるように結合パ
ートナー94を選択できる。本発明を適応できる細胞分類
システムが米国特許第3,970,518 号、第4,230,685 号、
および第4,267,234 号に記載されており、これらを引用
する。本発明を適応できる親和性クロマトグラフィー
は、Ｋ．モスバッハおよびＬ，アンダーセンらの論文で
あるNature、170 巻、259 −261 頁（1977）に記載され
ており、これを引用する。本発明の試薬を用いれば活用
できるさらなる相互作用であってこれを活用するように
結合パートナー94を選択できるさらなる相互作用が前出
の米国特許第4,554,088 号に記載されている。

【００６９】好ましくは、本発明の結合パートナーと反
応物との対の例としては、抗体と抗原、抗体とハプテ
ン、酵素と基体、酵素と阻害剤、酵素と補助因子、結合
タンパク質と基体、担体タンパク質と基体、レクチンと
炭化水素、受容体とホルモン、受容体と効果器、抑制体
と誘発因子等のような相互作用対が挙げられる。したが
って、結合パートナー94は、抗体、抗原、ハプテン、酵
素、酵素基体、核酸配列、阻害剤、補助因子、結合タン
パク質、結合タンパク質基体、担体タンパク質、担体タ
ンパク質基体、レクチン、炭化水素、ホルモン、ホルモ
ン受容体、ホルモン効果器、ホルモン抑制体、ホルモン
誘発因子等からなる群より選択することができる。特に
好ましい実施態様においては、結合パートナー94は抗体
または抗原である。

【００７０】上述した模範的な結合パートナーと反応物
との対の結合パートナーおよび反応物は、どのような化
学種を溶液から捕捉すべきで、またどの固相に結合すべ
きかにより定義する。溶液から捕捉すべきものを反応物
と称し、固相に結合すべきものを結合パートナーと称す
る。当業者には明確なことであるが、ある化学種はある
試験検定においては結合パートナーとして機能でき、別
の試験検定においては反応物として機能できる。

【００７１】結合パートナー94は好ましくは、不活性物
質80としての使用に適した好ましい物質に関して上述し
た官能基のような、不活性物質80に共有結合できる露出
された官能基を含む。不活性物質80の層78への共有結合
に関してここに定義した化学的性質によると、図５に示
したように直接的か、または図６に示したように結合剤
92を介してかのいずれかにより、不活性物質80の特定の
反応基が露出される、すなわち、反応物と複合体を形成
できるように方向付けられる。例えば、不活性物質80が
結合剤92としてのグルタルアルデヒドを介して層78に共
有結合する場合、不活性物質80の−ＮＨ₂基は実質的に
グルタルアルデヒドとの反応で消費され、多数のカルボ
キシル基が露出されたままとなる。したがって、結合パ
ートナー94の−ＮＨ₂基へさらに結合させるためには不
活性物質80上のカルボキシル基を活性化するＥＤＣのよ
うな活性化剤を用いることができる。例えば露出された
アルデヒド基を含む結合パートナー94を用いる場合、シ
アノホウ水酸化ナトリウムのような試薬を使用して還元
結合を行なう。あるいは、前述したような異種二官能結
合剤を用いてもよい。

【００７２】好ましくは、不活性物質80への結合パート
ナー94の結合の様式を、結合パートナー94に悪影響を及
ぼさないように選択すべきである。最適な結合剤を選択
するためには、変質に対する結合パートナーの感度およ
び活性化部位を考慮することが重要である。これは特に
抗体を使用する場合に当てはまる。例えば、抗体のチロ
シンまたはスルフィドリル基に結合させる場合のよう
に、抗体に対して非破壊的である結合剤を選択すべきで
ある。さらに、結合剤は、結合が結合パートナーまたは
固相支持表面のいずれをも破壊しない条件（例えば、温
度およびｐＨ）下で行なわれるようなものでなければな
らない。

【００７３】試験検定に使用する前に、試薬をさらにブ
ロッキングしてもよい。第２のコーティングとしての好
ましい物質を、不活性物質、特にＢＳＡまたはＢＧＧ上
に施けられる。図７を参照のこと（必要に応じてさらな
るブロッキングを行なう）。

【００７４】図７において、従来技術と本発明の模範的
な実施態様による、結合パートナーを固相に結合させる
模範的な化学反応路を示すフローチャートを示してい
る。

【００７５】反応Ｉに関して、露出されたアミノ基を有
するシラン化された表面がグルタルアルデヒドにより活
性化されると、露出されたアルデヒド基を含む網目がで
きる。従来技術によると、反応IIに関して、アミノ基を
有する結合パートナーをそのアルデヒド基の部分に結合
させている。しかしながら、本発明によると、反応III
に関して、塗膜を形成するための、アミン官能価とカル
ボキシル官能価の両方を有する不活性物質80をグルタル
アルデヒド官能価固相に結合して、「中間体Ａ」を得
る。

【００７６】あるいは、固相上に塗膜を形成する不活性
物質の直接的な共有結合、すなわち、グルタルアルデヒ
ドのような架橋剤を用いない共有結合を反応IVに関して
示す。反応によると、塗膜を形成する不活性物質であっ
て、カルボキシル官能価とアミン官能価とを含む不活性
物質を、ＥＤＣのような活性化剤により活性化し、シラ
ン層の露出されたアミノ基と反応させて「中間体Ａ」を
形成させている。

【００７７】続いて、結合パートナーを生成した中間体
に結合させる少なくとも２つの一般的な反応路がある。
一方には様々な化学反応路があり、他方には特異的結合
するものがある。化学反応路を先に記載する。反応Ｖに
よると、塗膜のカルボキシル官能価をＥＤＣのような活
性化剤で活性化し、続いて活性化されたカルボキシル基
と結合パートナーのアミノ基との反応が行なわれる。反
応VIによると、結合パートナーのカルボキシル基がＥＤ
Ｃにより活性化され、続いて塗膜上のアミノ基に結合さ
れる。反応VII によると、結合パートナーが有するアル
デヒド基が塗膜のアミン官能価に結合し、続いてＮａＣ
ＮＢＨ₃のような還元剤と還元反応を行なう。特異的結
合が関与する反応路によると、反応VIIIを参照して、結
合パートナーが中間体に間接的に固定化される。反応VI
IIに関して、塗膜の露出した官能基に共有結合する官能
基を有するビオチン誘導体（例えば、ビオチンＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド）を塗膜に共有結合させて「中間
体Ｂ」を形成し、続いてアビジンまたはストレプトアビ
ジン修飾結合パートナーを露出されている塗膜結合ビオ
チン（反応IX）に結合させる。あるいは、アビジンまた
はストレプトアビジン種を塗膜に共有結合させて、続い
てビオチンと結合した結合パートナーを導入してもよ
い。

【００７８】もちろん、図７のフローチャートは模範的
な反応路のみを示している。当業者には明確であるよう
に、不活性物質が固相に結合してなる不活性塗膜を含む
中間体を形成する様々な反応路、および結合パートナー
が塗膜に結合する様々な反応路が利用でき、このことが
本発明の範囲に含まれるのが分かる。本発明の概念は、
固相物質の外面上に結合パートナー物質が結合する不活
性物質の塗膜を提供することにあり、記載された結合段
階に利用される特定の化学反応路は、結合パートナー94
を著しく変質しない限り大幅に変更できることが理解さ
れよう。

【００７９】本発明によると、試薬の反応性を適切なも
のとするために結合パートナーを固相に充填して、所定
の量の試薬70または90を調製することができる。結合パ
ートナー94は溶液26中にある反応物27に近付きやすい試
薬70または90の露出部位に実質的に独占的に位置し、小
さな孔76の充填には消費されないので、反応性は加えら
れる結合パートナー94の量に基づいて比較的予測可能で
ある。加える結合パートナー94の量は好ましくは試薬70
または90の表面区域を完全に覆うのに必要な量よりも一
般的に少ない。本発明によると、結合パートナー94によ
り覆われていない本発明の試薬の部位96は、例えば、グ
ルタルアルデヒド層92またはシラン層78というよりもむ
しろ、不活性物質80のみからなるので、試験検定に非特
異的結合が関与することにはならない。さらに試験検定
において試薬を使用する前に、ブロッキング工程を必要
に応じて行なってもよい。

【００８０】また本発明は、媒質中の反応物を捕捉する
キット、または媒質から特定のトキシン、触媒、工業的
に重要であるかまたは高価な開始材料もしくは反応物を
回収するキットを提供する。本発明の好ましい実施態様
によると、キットは固相を含み、この固相の表面に不活
性物質が結合（好ましくは共有結合）して塗膜を形成し
ている。キットはまた不活性物質の塗膜層に付着した結
合パートナーを含んでもよい。

【００８１】本発明の実施態様によると、キットは好ま
しくは試薬を反応物と反応させる反応器（reactor ）
（および適切な場合には、今後のサンドイッチ検定にお
ける反応のための反応器）を含む。そのような反応器
は、例えば、単純な試験管、撹拌溶液または別の方法で
掻き混ぜた溶液、反応物を含有する液体が通過するカラ
ム等の様々な形状を取ってもよい。さらに、キットは好
ましくは試薬およびそれと複合体形成した全ての物質を
単離するアイソレータを含む。アイソレータは、永久磁
石、電磁石、または磁界を生成する他の従来の手段であ
ってもよい。あるいは、アイソレータは、遠心分離、シ
ーブ、または他の濾過手段のような単純な物理的な分離
手段であってもよい。

【００８２】さらに、キットは好ましくは、固相に結合
した標識の存在、または相対量を検出する検出器を含
む。そのような検出器は、例えば、放射能測定装置；顕
微鏡または肉眼のような視覚的手段；分光計または分光
光度計等の使用する特定の標識に適したものであれば従
来のいかなる検出器であってもよい。あるいは、検出器
は、固相と反応して、標識の存在および／または相対量
を信号変換（signalling）する化学試薬を含んでもよ
い。そのような化学検出手段は他の検出手段と協同で用
いてもよい。

【００８３】以下の実施例は本発明の利点を説明するこ
とを意図したものであり、本発明の範囲の全てを例示す
るものではない。例えば、磁気粒子を唯一例示したが、
ガラスビーズまたは高分子ビーズ、タイタ板、試験管、
セファデックス等を含む上述した様々な固相を用いても
よい。塗膜のグルタルアルデヒドおよびＥＤＣによる結
合を、固相の支持表面に塗膜を結合させるものとして唯
一例示するが、様々な別の化学的性質を用いてもよい。
さらに、細胞分類システム、親和性クロマトグラフィー
システム、特定の結合パートナーにより認識される細胞
または組織の診断位置確認のためのイン・ビボシステ
ム、表面に結合した治療剤を直接伝達するためのイン・
ビボシステムに使用する表面を含む様々な支持表面を本
発明の塗膜で修飾してもよい。

【００８４】本発明は結合パートナーが結合する固相表
面に塗膜層を導入することにあることが理解されよう。
上述した変更および他の変更並びにそれらと同等物なも
のも本発明の範囲に含まれることが理解されよう。

【００８５】（実施例１）塗膜層を磁気粒子に結合させて中間体を形成する二官能架橋剤のグルタルアルデヒドを介して塗膜層が磁
気粒子に結合して、後に加工して試薬を形成できる中間
体を形成する磁気粒子である固相について記載する。シ
ラン化した超常磁性粒子、特にＮ−２−アミノエチル−
３−アミノプロピルトリメトキシシランで被覆した酸化
鉄結晶の凝集塊をマサチューセッツ州、ケンブリッジの
アドバンストマグネティクス社から購入した。ウマア
ポフェリチンおよびグルタルアルデヒドをミズーリ州、
セントルイスのシグマケミカル社から購入した。

【００８６】150 ｍｇのシラン化粒子を、洗浄の間に磁
気分離を行ないながら５ｍｌのメタノールで３回洗浄
し、次いで５ｍｌの10ｍＭリン酸緩衝液、0.02％ＮａＮ
₃、ｐＨ7.4 （洗浄緩衝液）で３回洗浄した。磁気的に
分離した物質または湿ったケーキを３ｍｌの洗浄緩衝液
中に懸濁させて、2.5 ｍｌの洗浄緩衝液中の５％グルタ
ルアルデヒド溶液を加えた。室温で２時間に亘って振り
混ぜた後、グルタルアルデヒド活性化粒子を６ｍｌの洗
浄緩衝液で３回洗浄した。これらの粒子50ｍｇを1.5 ｍ
ｌの洗浄緩衝液中に懸濁させ、0.1 ｍｌの0.15ＭＮａ
Ｃｌ中の５ｍｇのウマアポフェリチン溶液を加え、懸
濁液を室温で２時間に亘り混合した。次いでアポフェリ
ン被覆粒子を２ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで
２ｍｌの洗浄緩衝液中に再懸濁させて、使用するまで４
℃で貯蔵した。ウマアポフェリチン塗膜を有するこれ
らの中間体磁気粒子をさらに加工して試験検定に使用す
るための試薬を形成することができる。

【００８７】（実施例２）抗ｈＣＧ抗体の中間体への結合実施例１からの磁気粒子中間体を加工してｈＣＧ検定に
使用する試薬を形成させた。モノクローナル抗ヒト絨毛
性ゴナドトロピン（抗ｈＣＧ）抗体（ロット番号ＡＳ１
１）をマサチューセッツ州、ミッドフィールドのチバ
コーニングダイアグノスティクス社からのＡＣＳ（商
標）トータルｈＣＧ検定より得て、結合パートナーとし
て用いた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）をシ
グマ社から購入した。実施例１からの50ｍｇの磁気粒子
中間体を、1.5 ｍｌの20ｍＭ２−［Ｎ−モルホリノ］
エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ5.5 中に再懸濁させ
た。0.2 ｍｌの20ｍＭＭＥＳ中の0.1 ｇのＥＤＣ溶液
を加え、懸濁液を室温で30分間に亘り再度混合した。1.
5 ｍｌの50ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ8.0 中の8.0 ｍｇ
の抗ｈＣＧ抗体溶液を加え、粒子を室温でさらに16時間
に亘り混合した。生成した抗体被覆粒子試薬を、２ｍｌ
の洗浄緩衝液と２ｍｌの１ＭＮａＣｌで洗浄し、さら
に0.5 ％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ7.4
（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を含有する10ｍＭのリン酸緩衝液で
３回洗浄した。

【００８８】洗浄後、粒子試薬を再懸濁させ、２ｍｌの
ＰＢＳ−ＢＳＡ中でブロッキングして、50℃で一晩に亘
り培養した。この追加の50℃でのブロッキング工程によ
り、実施例３に示すような非特異的結合特性が減少した
試薬を得た。次いでこの粒子を２ｍｌの洗浄緩衝液で３
回洗浄し、２ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中に再懸濁させ、使
用するまで４℃で貯蔵した。

【００８９】あるいは、追加のブロッキング工程を行な
わずに試薬を用いてもよい。

【００９０】（実施例３）トータルｈＣＧ／免疫学的検定実施例２で調製しブロッキングした試薬をサンドイッチ
検定に用いて臨床的効用を示した。ｈＣＧ血清標準物お
よびライト試薬（アクリジニウムエステルで標識付けた
ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体）は全て、上述したＡＣＳ
（商標）トータルｈＣＧ検定から得た。検定の方法は以
下のとおりである：50ｕｌのｈＣＧ標準物を、100 ｕｌ
のライト試薬および450 ｕｌの実施例２の試薬懸濁液と
混合した。混合物を37℃で7.5 分間に亘り培養した。粒
子を磁気的に分離し、１ｍｌの脱イオン水で洗浄し、10
0 ｕｌの脱イオン水で再懸濁した。相対光単位（Relati
veLight Unit ：ＲＬＵ）の化学発光信号を、表１に示
すように、チバコーニングダイアグノスティックス
社のマジックライトアナライザーＭＬＡ−１により読み
取った。

【００９１】表１ｈＣＧ濃度ＲＬＵ（％ＣＶ）％Ｂ／Ｂ最大 0ｍＩＵ／ｍｌ 3,043 （5.0 ％） 0.4 ％ 5 11,170 （2.7 ％） 1.6 25 40,420 （5.3 ％） 5.7 100 148,100 （2.7 ％） 20.7 500 460,950 （4.2 ％） 64.4 1200 715,360 （2.4 ％） 100. 用量（dose）に対してＢ／Ｂ最大値の％をプロットする
ことによりｈＣＧ標準物の用量応答曲線を作成した。こ
こでＢは結合標準物の信号であり、Ｂ最大値は結合した
1200ｍＩＵ／ｍｌ標準物の信号である。この結果、本発
明により調製した磁気粒子試薬を用いることにより感度
のあるｈＣＧ検定が行なえることが分かった。この固相
の高い結合能力により、ｈＣＧの1,000,000 ｍＩＵ／ｍ
ｌの濃度でさえも検定には「フック効果（hook effect
）」のないことが示された。その時の結合信号はＢ最
大の212 ％であった。

【００９２】（実施例４）塗膜層を磁気粒子に直接結合させて中間体を形成する二官能架橋剤を用いずに塗膜層が粒子に直接共有結合し
ている磁気粒子固相について記載する。413 ｍｇのシラ
ン化粒子を16ｍｌのメタノールで３回洗浄し、次いで16
ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、湿ったケーキを４ｍｌ
の洗浄緩衝液中に再懸濁させた。１ｍｌの脱イオン水中
の300 ｍｇのＥＤＣを加え、ただちに８ｍｌの洗浄緩衝
液中の200 ｍｇのＢＳＡを加え、懸濁液を室温で３時間
に亘り混合した。ＢＳＡ被覆粒子中間体を実施例１との
中間体と同様に加工して、使用するまで４℃で貯蔵し
た。これらの中間体磁気粒子をさらに加工して、試験検
定に使用する試薬を形成することができる。

【００９３】（実施例５）ジギトキシンの中間体への結合Ｕ．ピラン等のＪ．Immuno. Methods, 133,207巻（199
0）に記載されているハプテンの異種構造（heterolog
y）の理論に基づいて、実施例４からの磁気粒子中間体
を加工して、ジゴキシン（digoxin ）検定に使用するた
めの結合パートナーとしてジギトキシンを担持する試薬
を形成した。180 ｍｇの粒子を８ｍｌの50ｍＭの炭酸緩
衝液、ｐＨ9.5 中に再懸濁させた。Ｔ．スミス等のBioc
hem. 9,331巻（1970）の方法にしたがって、180 ｍｇの
ジギトキシンジアルデヒドを新たに調製し、粒子に加
えた。懸濁液を２時間に亘り混合した。３ｍｌの脱イオ
ン水中の150 ｍｇのシアノホウ水酸化ナトリウムを加
え、懸濁液をさらに16時間に亘り混合した。ジギトキシ
ン被覆粒子を２ｍｌの洗浄緩衝液と２ｍｌの１ＭＮａ
Ｃｌで洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した。

【００９４】洗浄後、粒子試薬を２ｍｌのＰＢＳ−ＢＳ
Ａ中に再懸濁させて、追加のブロッキング工程として50
℃で一晩に亘り培養し、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２ｍ
ｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中に再懸濁させ、使用するまで４℃
で貯蔵した。

【００９５】もしくは、追加のブロッキング工程を行な
わずに試薬を用いてもよい。

【００９６】（実施例６）ジゴキシン検定実施例５により調製した、追加にブロッキングしたジギ
トキシン被覆粒子試薬を、すべてチバコーニングダ
イアグノスティックス社のＡＣＳ（商標）ジゴキシン検
定から得た血清ジゴキシン標準物および化学発光ライト
試薬（アクリジニウムエステル（ＭＡｂ−ＡＥ）で標識
付けたモノクローナル抗ジゴキシン抗体）を用いて以下
の検定プロトコルにしたがったジゴキシン検定において
評価した。100 ｕｌのジゴキシン標準物を50ｕｌのライ
ト試薬（合計カウント：3,300,000 ＲＬＵ）に加えた。
混合物を37℃で2.5 分間に亘り培養した。100 ｕｇ／ｍ
ｌの濃度で実施例５のジギトキシン被覆粒子試薬500 ｕ
ｌを加え、混合物を37℃でさらに５分間に亘り培養し
た。粒子を分離し、１ｍｌの脱イオン水で２回洗浄し、
100 ｕｌの脱イオン水中に再懸濁させた。検定信号をＭ
ＬＡ−１で読み取り、結果を表２に示す。

【００９７】表２ジゴキシンＲＬＵ（％ＣＶ）％Ｂ／Ｂｏ 0 108,850（1.0 ％） 100 ％ 0.5 ｎｇ／ｍｌ 77,603（3.2 ％） 71.3％ 1.0 62,393（5.8 ％） 57.3％ 2.0 47,407（3.8 ％） 43.5％ 4.0 35,823（3.2 ％） 32.9％ 6.0 30,800（8.9 ％） 28.3％用量に対してＢ／Ｂｏの％をプロットすることにより、
ジゴキシン標準物についての用量応答曲線を作成した。
ここでＢは結合標準物の信号であり、Ｂｏは用量がゼロ
での結合信号である。0.1 ｎｇ／ｍｌ未満検定感度を評
価した感度のあるジゴキシン検定を行なった。ＥＤ50は
1.56ｎｇ／ｍｌと推測される。塗膜層のシラン化粒子表
面への直接の結合の効果および低分子量化合物を塗膜層
に接合して試験検定に使用する試薬を形成させる際の本
発明の適用の効果を確認した。

【００９８】（実施例７）従来技術の工程との比較シラン化磁気粒子を結合パートナー（具体的にはチバ
コーニングダイアグノスティクス社のマジック（登録
商標）ライトＴアップ検定から得た親和性精製ヤギ抗マ
ウス抗体（ＧＡＭＡｂ））で被覆した。タンパク様塗膜
としてＢＳＡおよび架橋剤としてグルタルアルデヒドを
使用した実施例１の変形である本発明による方法並びに
米国特許第4,554,088 号に記載されている従来の方法の
両者をこの研究に用いた。各々の方法において、８、
４、0.8 ｍｇでの３つの異なる充填量のＧＡＭＡｂを、
50ｍｇの粒子の３つのバッチにそれぞれ結合させ、続い
て実施例の追加のブロッキングを行なった。

【００９９】これらの試薬の結合能力と非特異的結合
（ＮＳＢ）特性を比較するために、ＧＡＭＡｂ被覆粒子
の６つのバッチすべてを２つのライト試薬と反応させ
た：アクリジニウムエステルで標識付けたモノクローナ
ル抗ピリジノリン抗体（ＭＡｂ−ＡＥ、合計カウント：
2,800,000 ＲＬＵ）、およびアクリジニウムエステルで
標識付けたＧＡＭＡｂ（ＧＡＭＡｂ−ＡＥ、合計カウン
ト：2,580,000 ＲＬＵ）。ＭＡｂ−ＡＥは磁気粒子上の
ＧＡＭＡｂに特異的に結合する。一方、粒子上に結合し
たＧＡＭＡｂ−ＡＥのどの反応も非特異的結合であると
考えられる。100 ｕｌのいずれかのライト試薬を100 ｕ
ｇ／ｍｌの濃度での500 ｕｌのＧＡＭＡｂ被覆粒子と混
合させて、その混合物を37℃で7.5 分間に亘り培養し
た。粒子を磁気的に分離し、１ｍｌの脱イオン水で２回
洗浄し、100 ｕｌの脱イオン水中で再懸濁させた。ＭＬ
Ａ−１アナライザーにより化学発光信号を読み取った。

【０１００】従来の方法により調製した粒子を用いた検
定結果を表３に示す。

【０１０１】表３ＧＡＭＡｂ信号ＮＳＢ信号／ＮＳＢ充填量（％ＣＶ）（％ＣＶ）の比 8 ｍｇ 796,120 ＲＬＵ 12,597ＲＬＵ 63.2 （ 1.2％）（ 2.9％） 4 ｍｇ 887,653 37,663 23.6 （ 1.9％）（ 1.5％） 0.8ｍｇ 819,843 74,930 10.9 （ 1.0％）（ 0.5％）抗体の充填量が減少するにつれ、非保護表面の露出され
る部分が増大するために非特異的結合の量が著しく増大
するのが明確である。非特異的結合を抑制するために、
通常は固定化方法において過剰の結合パートナーを使用
することが必要である。

【０１０２】上述したのと同様なプロトコルを用いて本
発明により調製した試薬について試験した。結果を表４
に示す。

【０１０３】表４ＧＡＭＡｂ信号ＮＳＢ信号／ＮＳＢ充填量（％ＣＶ）（％ＣＶ）の比 8 ｍｇ 811,353 ＲＬＵ 9,973ＲＬＵ 81.4 （ 0.9％）（ 1.9％） 4 ｍｇ 647,027 10,627 60.9 （ 6.2％）（ 5.8％） 0.8ｍｇ 319,233 12,513 25.5 （ 1.0％）（10.3％）本発明により調製した試薬は、塗膜層で固相表面を効果
的に覆っているために、従来の方法により調製した試薬
よりも著しく少ない非特異的結合を示した。同様の理由
により、抗体の充填量が減少するにつれ、非特異的結合
はほとんど増加しなかった。８ｍｇの抗体を新しいコー
ティング工程に用いる場合、検定信号は従来の工程から
の最適の結果とほぼ同一であることは注目に値する。ま
た、本発明により調製した試薬について、検定信号は結
合方法に用いた抗体結合パートナーの量に比例すること
が分かる。このことは、粒子表面上の結合部位の数を調
節してどのような特定の検定のニーズも満たすことがで
きることを示唆している。表３および４からの信号／Ｎ
ＳＢ比を比較すると、異なる濃度の抗体充填量で本発明
による方法を用いて著しく良好な比が達成されたことを
示している。具体的には、本発明により調製した0.8 ｍ
ｇを充填した試薬の信号／ＮＳＢ比は、従来技術により
調製した４ｍｇを充填した試薬の信号／ＮＳＢ比と非常
に近く、したがって、従来技術の方法を用いてその充填
範囲における本発明により達成された信号／ＮＳＢ比と
同様な信号／ＮＳＢ比を達成するためには、充填量を５
倍にすることが必要とされる。

【０１０４】この実験は市販のどのモノクローナル抗体
により同様に行なってもよい。

【０１０５】（実施例８）塗膜層の磁気粒子への結合実施例１の方法と同様な方法を用いて、１ｇのシラン化
粒子を160 ｍｇのウシガンマグロブリン塗膜（カリフォ
ルニア州、アービンのＩＣＮから得たＢＧＧ、ロット番
号Ｂ００５）で被覆して中間体を形成した。中間体を加
工して、実施例１に記載したように貯蔵した。

【０１０６】（実施例９）ビオチンの中間体への結合実施例８で調製した中間体を加工して修飾中間体を形成
した。ＢＧＧ被覆粒子を16ｍｇの洗浄緩衝液中に再懸濁
させ、続いて３ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中
の60ｍｇのビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（シグマ社から得た、Ｂ−2643）を添加
した。この懸濁液を室温で３時間に亘り混合し、生成し
たビオチン被覆修飾中間体を実施例２に記載したように
ブロッキングした。修飾中間体は、アビジンまたはスト
レプトアビジン標識付け結合パートナーを用いた別の種
類の試薬を調製するための前駆体として用いてもよい。

【０１０７】あるいは、追加のブロッキング工程を行な
わずに修飾中間体を用いてもよい。

【０１０８】（実施例１０）検定結合パートナーのビオチン修飾中間体への結合本発明の試薬上に結合パートナー（抗体または抗原）を
直接固定化するために、実施例９で調製したビオチニル
化（biotinylated）修飾中間体を、固定化すべき抗体ま
たは抗原に接合したアビジンまたはストレプトアビジン
とともに用いて、免疫学的検定の試薬を形成できる。ス
トレプトアビジン−ＰＹＤ接合体は、カリフォルニア
州、パロアルトのメトラバイオシステム社のピリリンク
ス検定から得た。１ｕｇ／ｍｌの濃度の25ｕｌのストレ
プトアビジン−ＰＹＤおよび200 ｕｇ／ｍｌの濃度の20
0 ｕｌのビオチン被覆修飾中間体（実施例９）を混合
し、加工して、実施例１および２に関して上述したよう
に貯蔵した。

【０１０９】（実施例１１）ピリジノリン検定Ｓ．セーディン等の「J.Bone & Mineral Res. 」、８
巻、635 頁（1993）に報告されている骨再吸収マーカー
（bone resorption marker）であるピリジノリン（ＰＹ
Ｄ）を測定する競合免疫学的検定を行なって、実施例１
０の結合パートナーの間接的な固定化の利点を説明す
る。

【０１１０】ＰＹＤ標準物はメトラバイオシステムス社
のピリリンクス検定から得た。モノクローナル抗ＰＹＤ
抗体（ロット番号３Ｇ６）はまたメトラバイオシステム
ス社から得て、アクリジニウムエステルで標識を付け
て、生成したＭＡｂ−ＡＥを以下のプロトコルにより行
なった検定においてライト試薬として用いた：200 ｕｌ
のＰＹＤ標準物を25ｕｌのライト試薬（合計カウント：
3,800,000 ＲＬＵ）および実施例１０の予備混合固相試
薬と反応させた。混合物を37℃で7.5 分間に亘り培養
し、粒子を分離して、１ｍｌの脱イオン水で洗浄し、10
0 ｕｌの脱イオン水中に再懸濁させた。ＭＬＡ−１から
のデータを表５に示す。

【０１１１】表５ピリジノリンＲＬＵ（％ＣＶ）％Ｂ／Ｂｏ 0 521,767 （4.2 ％） 100 ％ 50ｎＭ 440,913 （2.4 ％） 84.5 ％ 150 359,849 （0.8 ％） 69.0 ％ 300 276,903 （3.4 ％） 53.1 ％ 600 195,547 （7.7 ％） 37.5 ％感度のあるピリジノリン検定標準曲線を作成して、本発
明とともにストレプトアビジン−ビオチン結合系を使用
することを示した。この手法では、ビオチン被覆試薬を
結合パートナーに接合したアビジンと混合することを考
慮し、生成した試薬は特定の検定において直接用いるこ
とができる。

【０１１２】前述した実施例は本発明の特定の実施態様
を説明するために記載したものであり、本発明の範囲を
限定することを意図したものではない。本発明の範囲内
のさらなる実施態様および利点は当業者には明確なもの
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】結合パートナーを従来技術により最大限ではな
く充填した表面部分の部分断面図

【図２】結合パートナーを従来技術により最大限に充填
した表面部分の部分断面図

【図３】結合パートナーとブロッキング剤が従来技術に
より充填された理想化した表面部分の部分断面図

【図４】結合パートナーとブロッキング剤が従来技術に
より充填された実際の表面部分の部分断面図

【図５】塗膜と結合パートナーが本発明の１つの実施態
様により充填された表面の部分断面図

【図６】塗膜と結合パートナーが本発明の別の実施態様
により充填された表面の部分断面図

【図７】結合パートナーの固相への結合、および不活性
物質の固相への結合による塗膜の形成、並びに結合パー
トナーの塗膜層への結合に含まれる化学反応路を示す流
れ図

【符号の説明】

10、40、50、60、70、90 磁気粒子 12、52、72 金属コアまたは固相 14、74 多孔性表面 16、78 シラン層 18、94 結合パートナー 20 グルタルアルデヒド 22、76 孔 24 開口部 26 試料溶液 27 反応物 30 非被覆部分 56 ブロッキング剤 80 不活性物質 92 結合剤

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】反応物の捕捉に使用する、外面を有する
固相からなる中間体であって、前記外面が不活性物質と共有結合して該外面上に塗膜を
形成し、該塗膜が前記反応物を捕捉するための結合パー
トナーを固着できるように選択されることを特徴とする
中間体。
【請求項２】前記不活性物質がタンパク様物質からな
ることを特徴とする請求項１記載の中間体。
【請求項３】前記不活性物質が、ウシ血清アルブミ
ン、ウシガンマグロブリン、アポフェリチン、オバルブ
ミン、アビジン、ストレプトアビジン、ペプチド、ポリ
アミノ酸、および合成ポリアミノ化合物からなる群より
選択されることを特徴とする請求項２記載の中間体。
【請求項４】前記不活性物質が非タンパク様物質から
なることを特徴とする請求項１記載の中間体。
【請求項５】前記不活性物質が、ポリアミノ化合物お
よび合成アミノ酸からなる群より選択されることを特徴
とする請求項４記載の中間体。
【請求項６】前記不活性物質が前記固相を実質的に被
覆するのに十分な量で加えられていることを特徴とする
請求項１記載の中間体。
【請求項７】前記固相が、磁気粒子、高分子ビーズ、
ガラスビーズ、タイタ板、スライド、光学導波管、およ
び試験管壁からなる群より選択されることを特徴とする
請求項１記載の中間体。
【請求項８】前記固相がシラン化されていることを特
徴とする請求項１記載の中間体。
【請求項９】前記固相がシラン化磁気金属酸化物粒子
からなることを特徴とする請求項８記載の中間体。
【請求項１０】前記不活性物質が、異種二官能性また
は同種二官能性の架橋剤を介して前記固相に共有結合し
ていることを特徴とする請求項１記載の中間体。
【請求項１１】前記不活性物質がグルタルアルデヒド
を介して前記固相に共有結合していることを特徴とする
請求項１０記載の中間体。
【請求項１２】前記不活性物質が架橋剤を用いずに前
記固相に直接共有結合していることを特徴とする請求項
１記載の中間体。
【請求項１３】前記不活性物質および前記固相の各々
が、それらの間にペプチド結合を形成するのに利用でき
る官能基を有し、該不活性物質が、前記官能基の１つを
活性化してペプチド結合を形成するように選択した活性
化剤を用いて前記固相に直接共有結合していることを特
徴とする請求項１２記載の中間体。
【請求項１４】前記固相がペプチド結合の形成に利用
できるアミノ基を有し、前記不活性物質がペプチド結合
の形成に利用できるカルボキシル基を有することを特徴
とする請求項１３記載の中間体。
【請求項１５】前記活性化剤が、Ｎ、Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド；Ｎ、Ｎ′−ジイソプロピルカ
ルボジイミド；１、１′−カルボニルジイミダゾール；
および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドヒドロクロライドからなる群より
選択されることを特徴とする請求項１３記載の中間体。
【請求項１６】請求項１記載の中間体の前記不活性物
質に少なくとも一種類の結合パートナーを結合してなる
試薬。
【請求項１７】前記不活性物質に結合した複数の種類
の結合パートナーを含み、各々の結合パートナーを、別
々の反応物を捕捉するように選択することを特徴とする
請求項１６記載の試薬。
【請求項１８】前記少なくとも一種類の結合パートナ
ーが前記不活性物質に共有結合していることを特徴とす
る請求項１６記載の試薬。
【請求項１９】前記不活性物質および前記結合パート
ナーの各々が、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド
基、ヒドロキシル基、およびスルフィドリル基からなる
群より選択される共有結合に利用できる官能基を含み、
前記結合パートナーが活性化剤を用いて前記不活性物質
に共有結合されていることを特徴とする請求項１８記載
の試薬。
【請求項２０】前記活性化剤が、Ｎ、Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド；Ｎ、Ｎ′−ジイソプロピルカ
ルボジイミド；１、１′−カルボニルジイミダゾール；
および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドヒドロクロライドからなる群より
選択されることを特徴とする請求項１９記載の試薬。
【請求項２１】前記少なくとも一種類の結合パートナ
ーが前記不活性物質に非共有結合していることを特徴と
する請求項１６記載の試薬。
【請求項２２】前記少なくとも一種類の結合パートナ
ーが前記不活性物質に吸収的に結合していることを特徴
とする請求項２１記載の試薬。
【請求項２３】前記中間体が、前記塗膜層に結合した
結合対の第１の物質を含んで試薬を形成し、結合パート
ナーを担持する前記結合対の第２の物質に結合するよう
に前記第１の物質が選択されていることを特徴とする請
求項１記載の中間体。
【請求項２４】前記結合対が、ビオチンとアビジン、
およびビオチンとストレプトアビジンからなる群より選
択されることを特徴とする請求項２３記載の中間体。
【請求項２５】前記結合パートナーが、抗体、抗原、
ハプテン、酵素、酵素基質、抑制体、補因子、結合タン
パク質、結合タンパク質基質、担体タンパク質、担体タ
ンパク質基質、レクチン、炭化水素、ホルモン、ホルモ
ン受容体、ホルモン効果器、ホルモン抑制体、ホルモン
誘発物質、ペプチド、遺伝子プローブ、アビジン、ビオ
チン、およびストレプトアビジンからなる群より選択さ
れることを特徴とする請求項１６記載の試薬。
【請求項２６】前記不活性物質が、前記結合パートナ
ーと複合体を形成する反応物に対して不活性であること
を特徴とする請求項１６記載の試薬。
【請求項２７】前記外面が小さな孔を有し、該小さな
孔が前記不活性物質で満たされていることを特徴とする
請求項１記載の中間体。
【請求項２８】反応物の捕捉に使用する、外面を有す
る固相からなる中間体であって、前記外面が実質的に非架橋の不活性物質と結合して該外
面上に塗膜を形成し、該塗膜が前記反応物を捕捉するた
めの結合パートナーを固着できるように選択されること
を特徴とする中間体。
【請求項２９】前記固相がシラン化されていることを
特徴とする請求項２８記載の中間体。
【請求項３０】前記不活性物質が、異種二官能性また
は同種二官能性の架橋剤を介して前記固相に共有結合し
ていることを特徴とする請求項２８記載の中間体。
【請求項３１】前記不活性物質が架橋剤を用いずに前
記固相に直接共有結合していることを特徴とする請求項
２８記載の中間体。
【請求項３２】前記不活性物質に結合した少なくとも
一種類の結合パートナーを含んで試薬を形成することを
特徴とする請求項２８記載の中間体。
【請求項３３】反応物の捕捉に使用する、外面を有す
るシラン化された固相からなる中間体であって、前記外面が不活性物質と結合して該外面上に塗膜を形成
し、該塗膜が前記反応物を捕捉するための結合パートナ
ーを固着するように選択されることを特徴とする中間
体。
【請求項３４】前記固相がシラン化された磁気金属酸
化物粒子からなることを特徴とする請求項３３記載の中
間体。
【請求項３５】前記不活性物質に結合した少なくとも
一種類の結合パートナーを含んで試薬を形成することを
特徴とする請求項３３記載の中間体。
【請求項３６】少なくとも一種類の反応物を、該反応
物と結合する結合パートナーを使用することにより捕捉
する試薬であって、外面を有する固相、該固相に共有結合して該固相上に塗膜を形成する不活性
物質、および該不活性物質に結合した少なくとも一種類
の結合パートナーからなり、各々の結合パートナーが反応物を捕捉するように選択さ
れることを特徴とする試薬。
【請求項３７】前記固相がシラン化された磁気金属酸
化物粒子からなることを特徴とする請求項３６記載の中
間体。
【請求項３８】前記不活性物質が、異種二官能性また
は同種二官能性の架橋剤を介して前記固相に共有結合し
ていることを特徴とする請求項３６記載の中間体。
【請求項３９】前記不活性物質が架橋剤を用いずに前
記固相に直接共有結合していることを特徴とする請求項
３６記載の中間体。
【請求項４０】前記少なくとも一種類の結合パートナ
ーが前記不活性物質に共有結合していることを特徴とす
る請求項３６記載の試薬。
【請求項４１】少なくとも一種類の反応物を、該反応
物と結合する結合パートナーを使用することにより捕捉
する試薬であって、外面を有する固相、該固相に結合して該固相上に塗膜を形成する実質的に非
架橋の不活性物質、および該不活性物質に結合した少な
くとも一種類の結合パートナーからなることを特徴とす
る試薬。
【請求項４２】前記不活性物質が、異種二官能性また
は同種二官能性の架橋剤を介して前記固相に共有結合し
ていることを特徴とする請求項４１記載の中間体。
【請求項４３】前記不活性物質が架橋剤を用いずに前
記固相に直接共有結合していることを特徴とする請求項
４１記載の中間体。
【請求項４４】前記不活性物質に結合した複数の種類
の結合パートナーを含み、該複数の種類の結合パートナ
ーの各々が、別々の反応物を捕捉するように選択される
ことを特徴とする請求項４１記載の試薬。
【請求項４５】少なくとも一種類の反応物を、該反応
物と結合する結合パートナーを使用することにより捕捉
する試薬であって、外面を有するシラン化された固相、該固相に結合して該固相上に塗膜を形成する不活性物
質、および該不活性物質に結合した少なくとも一種類の
結合パートナーからなることを特徴とする試薬。
【請求項４６】反応物を捕捉するためのキットであっ
て、外面を有する固相、および前記外面に共有結合して、該
外面上に塗膜を形成する不活性物質からなり、前記塗膜が前記反応物を捕捉するための結合パートナー
を固着するように選択されることを特徴とするキット。
【請求項４７】反応物を捕捉するためのキットであっ
て、外面を有する固相、および前記外面に結合して、該外面
上に塗膜を形成する実質的に非架橋の不活性物質からな
り、前記塗膜が前記反応物を捕捉するための結合パートナー
を固着するように選択されることを特徴とするキット。
【請求項４８】反応物を捕捉するためのキットであっ
て、外面を有するシラン化された固相、および前記外面に結
合して、該外面上に塗膜を形成する不活性物質からな
り、前記塗膜が前記反応物を捕捉するための結合パートナー
を固着するように選択されることを特徴とするキット。
【請求項４９】反応物を捕捉するのに使用する中間体
を製造する方法であって、 (a) 外面を有する固相を用意し、 (b) 前記外面上に前記反応物を捕捉するための結合パ
ートナーを固着するのに適した不活性物質を選択し、 (c) 前記外面に該不活性物質を共有結合させて該外面
上に塗膜を形成する、各工程からなることを特徴とする
方法。
【請求項５０】前記工程(b) と(c) との間で、前記外
面に架橋剤を共有結合させる工程を行ない、前記不活性物質が前記架橋剤と共有結合して前記塗膜を
形成することを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５１】前記固相がシラン化された外面を有
し、前記架橋剤がグルタルアルデヒドからなることを特
徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５２】 (d) 前記不活性物質に少なくとも一
種類の結合パートナーを結合させて試薬を形成する工程
を前記工程(c) の後に行なうことを特徴とする請求項４
９記載の方法。
【請求項５３】少なくとも一種類の反応物を捕捉する
方法であって、 (a) 外面を有する固相と、前記外面と共有結合して該
外面上に塗膜を形成する不活性物質と、前記不活性物質
に結合した、前記反応物と複合体を形成できる少なくと
も一種類の結合パートナーとを含む試薬を用意し、 (b) 該試薬と前記反応物を含有する試料との混合物を
形成する、各工程からなることを特徴とする方法。
【請求項５４】少なくとも一種類の反応物を捕捉する
方法であって、 (a) 外面を有する固相と、前記外面と結合して該外面
上に塗膜を形成する実質的に非架橋の不活性物質と、前
記不活性物質に結合した、前記反応物と複合体を形成で
きる少なくとも一種類の結合パートナーとを含む試薬を
用意し、 (b) 該試薬と前記反応物を含有する試料との混合物を
形成する、各工程からなることを特徴とする方法。
【請求項５５】少なくとも一種類の反応物を捕捉する
方法であって、 (a) 外面を有するシラン化された固相と、前記外面と
結合して該外面上に塗膜を形成する不活性物質と、前記
不活性物質に結合した、前記反応物と複合体を形成でき
る少なくとも一種類の結合パートナーとを含む試薬を用
意し、 (b) 該試薬と前記反応物を含有する試料との混合物を
形成する、各工程からなることを特徴とする方法。