JP3192149B2 - ゼラチンを有する磁性粒子及びそれを用いた免疫測定法 - Google Patents
ゼラチンを有する磁性粒子及びそれを用いた免疫測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、磁性粒子及びそれを用いた免疫測定法に関
する。更に詳しくは、本発明は、核が高分子化合物であ
り、外側に磁性体で形成した層を有し、更に表面にゼラ
チンを有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を用いた免疫
測定法に関する。
する。更に詳しくは、本発明は、核が高分子化合物であ
り、外側に磁性体で形成した層を有し、更に表面にゼラ
チンを有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を用いた免疫
測定法に関する。
背景技術 免疫測定法、殊に酵素免疫測定法においては、従来か
ら、固相に大きな径を有するビーズが用いられてきた
が、粒径を小さくし、固相の表面積を大きくすることが
高感度の免疫反応を行うにあたって有利であることが知
られている。
ら、固相に大きな径を有するビーズが用いられてきた
が、粒径を小さくし、固相の表面積を大きくすることが
高感度の免疫反応を行うにあたって有利であることが知
られている。
しかし、粒径の小さい粒子を用いた場合は、B/F分離
を行うにあたって、遠心分離機を用いるか又はフィルタ
ーによる濾過を行わなければならず、簡便な方法とは言
い難い。そこで、効率よく且つ簡便にB/F分離を行う方
法として、粒径の小さい磁性粒子を採用する方法が提案
された。
を行うにあたって、遠心分離機を用いるか又はフィルタ
ーによる濾過を行わなければならず、簡便な方法とは言
い難い。そこで、効率よく且つ簡便にB/F分離を行う方
法として、粒径の小さい磁性粒子を採用する方法が提案
された。
この方法としては、例えば、マグネタイトを核として
シランを被覆した粒径が1.0〜10μｍの粒子を用いる免
疫測定法（特開昭55−141670号公報及び特開昭50−1229
97号公報）、また、磁性金属酸化物を核としてシランを
被覆した粒径が0.1〜1.5μｍの粒子を用いる免疫測定法
（特開昭60−1564号公報）等が知られている。
シランを被覆した粒径が1.0〜10μｍの粒子を用いる免
疫測定法（特開昭55−141670号公報及び特開昭50−1229
97号公報）、また、磁性金属酸化物を核としてシランを
被覆した粒径が0.1〜1.5μｍの粒子を用いる免疫測定法
（特開昭60−1564号公報）等が知られている。
しかしながら、これらの磁性金属を核とする粒子は、
粒子サイズの均一性に乏しく、また、鉄の溶出が認めら
れる等、長期保存に対する安定性が低い等の欠点を有し
ていた。
粒子サイズの均一性に乏しく、また、鉄の溶出が認めら
れる等、長期保存に対する安定性が低い等の欠点を有し
ていた。
そこで、核が有機高分子であり、表面が酸化鉄系のフ
ェライト被覆層を有する粒径0.2〜３μｍの粒子とそれ
を用いた免疫測定法（特開平３−115862号公報）、更
に、ゼラチン中に強磁性体微粒子を分散させた粒径1.0
〜100μｍのゼラチンフェライト粒子とそれを用いた免
疫測定法（特公平３−17103号公報）等の改良がなさ
れ、長期保存に対する安定化が計られている。
ェライト被覆層を有する粒径0.2〜３μｍの粒子とそれ
を用いた免疫測定法（特開平３−115862号公報）、更
に、ゼラチン中に強磁性体微粒子を分散させた粒径1.0
〜100μｍのゼラチンフェライト粒子とそれを用いた免
疫測定法（特公平３−17103号公報）等の改良がなさ
れ、長期保存に対する安定化が計られている。
更に、ノイズの低減を目指した免疫複合体転移測定法
（蛋白質核酸酵素、37巻、144頁）が提案された。
（蛋白質核酸酵素、37巻、144頁）が提案された。
発明の開示 核が有機高分子であり表面が酸化鉄系のフェライト被
覆層を有する磁性粒子は、長期保存に対する安定性の向
上は認められるが、免疫反応時の浮遊性が悪く、更に免
疫測定におけるB/F分離の際、粒子の凝集が認められ、
再分散性が悪い等、解決されるべき問題を有していた。
また、ゼラチン中に強磁性体微粒子を分散させたゼラチ
ンフェライト粒子は、粒子の凝集は解消したものの磁気
応答性が悪く、迅速なB/F分離及び洗浄を必要とする免
疫測定法、殊に酵素免疫測定法に適するものではなかっ
た。更に、免疫複合体転移測定法においては、免疫測定
における操作が多く、また測定時間が長くなり実用的で
はなかった。
覆層を有する磁性粒子は、長期保存に対する安定性の向
上は認められるが、免疫反応時の浮遊性が悪く、更に免
疫測定におけるB/F分離の際、粒子の凝集が認められ、
再分散性が悪い等、解決されるべき問題を有していた。
また、ゼラチン中に強磁性体微粒子を分散させたゼラチ
ンフェライト粒子は、粒子の凝集は解消したものの磁気
応答性が悪く、迅速なB/F分離及び洗浄を必要とする免
疫測定法、殊に酵素免疫測定法に適するものではなかっ
た。更に、免疫複合体転移測定法においては、免疫測定
における操作が多く、また測定時間が長くなり実用的で
はなかった。
本発明者らは、これらの問題を解決するため、鋭意努
力し、高分子化合物である核と、核の外側を覆う磁性体
で形成した層と、磁性体で形成した層の表面にゼラチン
を有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を製造し、それを
免疫測定法に使用したところ、ノイズが低く、シグナル
の高い測定結果を得ることができた。これは該磁性粒子
が長期に亘って安定で、長期保存ができること、粒子の
浮遊性が向上し、自己凝集が起こり難いこと、及び、迅
速なB/F分離と洗浄に対し充分な磁気応答性と分散性を
有していることに起因している。また、本発明の磁性粒
子は、所望の粒径の粒子を均一かつ容易に製造でき、こ
のことも再現性が高い結果を招いていると言える。
力し、高分子化合物である核と、核の外側を覆う磁性体
で形成した層と、磁性体で形成した層の表面にゼラチン
を有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を製造し、それを
免疫測定法に使用したところ、ノイズが低く、シグナル
の高い測定結果を得ることができた。これは該磁性粒子
が長期に亘って安定で、長期保存ができること、粒子の
浮遊性が向上し、自己凝集が起こり難いこと、及び、迅
速なB/F分離と洗浄に対し充分な磁気応答性と分散性を
有していることに起因している。また、本発明の磁性粒
子は、所望の粒径の粒子を均一かつ容易に製造でき、こ
のことも再現性が高い結果を招いていると言える。
すなわち本発明は、高分子化合物である核と、核の外
側を覆う磁性体で形成した層と、磁性体で形成した層の
表面にゼラチンを有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を
用いた免疫測定法である。
側を覆う磁性体で形成した層と、磁性体で形成した層の
表面にゼラチンを有する粒径1.0〜10μｍの磁性粒子を
用いた免疫測定法である。
本発明の方法に用いることができる磁性粒子として
は、例えば、核に高分子化合物を用い、その外側に磁性
体で形成した層を有する磁性粒子を利用し、その磁性粒
子の表面にゼラチンを被覆したもの（以下ゼラチン磁性
粒子という）を挙げることができる。
は、例えば、核に高分子化合物を用い、その外側に磁性
体で形成した層を有する磁性粒子を利用し、その磁性粒
子の表面にゼラチンを被覆したもの（以下ゼラチン磁性
粒子という）を挙げることができる。
上記のゼラチンを被覆する方法としては、一般的に用
いられている方法を用いれば良く、例えば、磁性粒子表
面及びゼラチンの官能基を利用して化学結合させる方
法、コアセルベーション（T.N.EVREINOVA著、モダンバ
イオロジーシリーズ22、コアセルベート（共立出版））
等が挙げられる。
いられている方法を用いれば良く、例えば、磁性粒子表
面及びゼラチンの官能基を利用して化学結合させる方
法、コアセルベーション（T.N.EVREINOVA著、モダンバ
イオロジーシリーズ22、コアセルベート（共立出版））
等が挙げられる。
磁性粒子表面及びゼラチンの官能基を利用して化学結
合させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面のカル
ボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基とゼラチン
分子のアミノ基又はカルボキシル基の脱水縮合法等を用
いることができる。
合させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面のカル
ボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基とゼラチン
分子のアミノ基又はカルボキシル基の脱水縮合法等を用
いることができる。
脱水縮合剤としては、一般的にペプチド結合法で使用
されるものが利用できる。例えば、水溶性カルボジイミ
ド、ウッドワード試薬等である。さらに磁性粒子表面の
チオール基とゼラチンを結合させる方法として、例え
ば、予めマレイミド基を導入したゼラチンを反応させる
方法を挙げることができる。
されるものが利用できる。例えば、水溶性カルボジイミ
ド、ウッドワード試薬等である。さらに磁性粒子表面の
チオール基とゼラチンを結合させる方法として、例え
ば、予めマレイミド基を導入したゼラチンを反応させる
方法を挙げることができる。
コアセルベーションによってゼラチンを被覆する方法
としては、コアセルベーションにより作製したゼラチン
粒子を、磁性粒子の外層に化学結合法により被覆する方
法と、ゼラチンをコアセルベーションさせる際に磁性粒
子を共存させる方法とがある。
としては、コアセルベーションにより作製したゼラチン
粒子を、磁性粒子の外層に化学結合法により被覆する方
法と、ゼラチンをコアセルベーションさせる際に磁性粒
子を共存させる方法とがある。
本明細書においてコアセルベーションとは、コアセル
ベートを生成することを意味し、コアセルベートとは、
溶液物質に富む層とそれに乏しい層とよりなる系全体を
意味する。
ベートを生成することを意味し、コアセルベートとは、
溶液物質に富む層とそれに乏しい層とよりなる系全体を
意味する。
コアセルベーションは、条件の違いから単純コアセル
ベーションと、複合コアセルベーションの２つに分類さ
れるが、本発明粒子を製造するにあたっては、どちらの
方法を採用してもよい。
ベーションと、複合コアセルベーションの２つに分類さ
れるが、本発明粒子を製造するにあたっては、どちらの
方法を採用してもよい。
単純コアセルベーションは、例えば、高分子溶液中に
電解質や有機溶媒を添加したり、高分子溶液のpHが高分
子の等電点になった際に、高分子の溶解性が減少し、こ
の高分子が水溶液中から相分離することを利用する。複
合コアセルベーションは、ポリカチオンとポリアニオン
の組み合わせで電気的な相互作用でコアセルベーション
が起こる。この場合、ポリカチオンとポリアニオンの混
合比、初濃度、共存塩の種類、濃度、pHが関係する。
電解質や有機溶媒を添加したり、高分子溶液のpHが高分
子の等電点になった際に、高分子の溶解性が減少し、こ
の高分子が水溶液中から相分離することを利用する。複
合コアセルベーションは、ポリカチオンとポリアニオン
の組み合わせで電気的な相互作用でコアセルベーション
が起こる。この場合、ポリカチオンとポリアニオンの混
合比、初濃度、共存塩の種類、濃度、pHが関係する。
ゼラチン磁性粒子の製造方法の１つとしては、例え
ば、ゼラチン（２〜10％）、メタリン酸塩（0.01〜５
％）、磁性粒子（0.3〜１％）及び水溶性多糖類（０〜
５％）を含有する溶液を用い、これに酸を加えpH2.5〜
6.0に調整することによりコアセルベーションが起こ
り、ゼラチンが被覆された磁性粒子が生成する。その後
アルデヒド系架橋剤を作用させ不溶化する。磁性粒子を
被覆するために用いるゼラチンは、誘導蛋白質の一種で
あってコラーゲンより得られたものであり、なかでも等
電点がpH6〜９である酸処理ゼラチンが望ましい。水溶
性多糖類としては、例えば、アラビアゴム、カルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラ
ゲナン等を用いることができる。
ば、ゼラチン（２〜10％）、メタリン酸塩（0.01〜５
％）、磁性粒子（0.3〜１％）及び水溶性多糖類（０〜
５％）を含有する溶液を用い、これに酸を加えpH2.5〜
6.0に調整することによりコアセルベーションが起こ
り、ゼラチンが被覆された磁性粒子が生成する。その後
アルデヒド系架橋剤を作用させ不溶化する。磁性粒子を
被覆するために用いるゼラチンは、誘導蛋白質の一種で
あってコラーゲンより得られたものであり、なかでも等
電点がpH6〜９である酸処理ゼラチンが望ましい。水溶
性多糖類としては、例えば、アラビアゴム、カルボキシ
メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラ
ゲナン等を用いることができる。
分散媒中の粒子の粒径測定は、レーザー回析法を用い
た粒度測定機、例えば、LA−500（堀場製作所社製）等
により行うことができる。本発明のゼラチン磁性粒子の
粒径は、平均粒径で１〜10μｍであるが、効率のよい免
疫測定を行うためには２〜８μｍであることが好まし
い。粒径１μｍ未満の粒子では、B/F分離に長時間を有
し簡便な測定が困難となり、粒径10μｍを超える粒子で
は浮遊性が悪化するため高感度測定を行うことができな
い等の欠点を有している。
た粒度測定機、例えば、LA−500（堀場製作所社製）等
により行うことができる。本発明のゼラチン磁性粒子の
粒径は、平均粒径で１〜10μｍであるが、効率のよい免
疫測定を行うためには２〜８μｍであることが好まし
い。粒径１μｍ未満の粒子では、B/F分離に長時間を有
し簡便な測定が困難となり、粒径10μｍを超える粒子で
は浮遊性が悪化するため高感度測定を行うことができな
い等の欠点を有している。
また、１〜10μｍの粒径を持つゼラチン磁性粒子を製
造するためには、その粒子の核の粒径が0.1〜５μｍで
あることが好ましい。粒径５μｍ以上の核を用いてゼラ
チン磁性粒子を製造すると、ゼラチン磁性粒子の粒径は
10μｍ以上となる。さらに核の粒径が0.1μｍ未満で
は、製造したゼラチン磁性粒子の粒径が１μｍ未満とな
り効率がよい測定を実施することができない。
造するためには、その粒子の核の粒径が0.1〜５μｍで
あることが好ましい。粒径５μｍ以上の核を用いてゼラ
チン磁性粒子を製造すると、ゼラチン磁性粒子の粒径は
10μｍ以上となる。さらに核の粒径が0.1μｍ未満で
は、製造したゼラチン磁性粒子の粒径が１μｍ未満とな
り効率がよい測定を実施することができない。
ゼラチン磁性粒子の核となる高分子化合物としては、
例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、
ポリアクリル酸エステル、スチレンとメタアクリル酸エ
ステルとの共重合体、スチレンとアクリル酸エステルと
の共重合体、ポリマー化したシラン、有機シラン等を挙
げることができる。
例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、
ポリアクリル酸エステル、スチレンとメタアクリル酸エ
ステルとの共重合体、スチレンとアクリル酸エステルと
の共重合体、ポリマー化したシラン、有機シラン等を挙
げることができる。
核の外側に形成される磁性体は、磁性金属であり、例
えば、フェライト；マンガン、コバルト、ニッケル等の
金属を含むフェライト等を用いることができる。
えば、フェライト；マンガン、コバルト、ニッケル等の
金属を含むフェライト等を用いることができる。
本発明のゼラチン磁性粒子は、抗体又は抗原を粒子に
結合させて免疫測定に用いることができる。粒子に結合
させる抗体としては、薬剤、例えば、テオフィリン、フ
ェニトイン、バルプロ酸；低分子ホルモンとして、例え
ば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオール；
癌マーカーとして、例えば、CEA、AFP;ウイルス抗原と
して、例えば、HIV、ATLA、HBV;高分子ホルモンとし
て、例えば、TSH、インスリン；サイトカインとして、
例えば、IL−１、IL−２、IL−6;各種グロスファクター
として、例えば、EGF、PDGF;更に前記ウイルスの適当な
DNA、RNA等に対する抗体等を挙げることができる。ま
た、使用する抗原としては、ウイルス、例えば、HIV、A
TLA、HBV;前記のウイルスのDNA;高分子ホルモン、例え
ば、インスリン、TSH等を挙げることができる。
結合させて免疫測定に用いることができる。粒子に結合
させる抗体としては、薬剤、例えば、テオフィリン、フ
ェニトイン、バルプロ酸；低分子ホルモンとして、例え
ば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオール；
癌マーカーとして、例えば、CEA、AFP;ウイルス抗原と
して、例えば、HIV、ATLA、HBV;高分子ホルモンとし
て、例えば、TSH、インスリン；サイトカインとして、
例えば、IL−１、IL−２、IL−6;各種グロスファクター
として、例えば、EGF、PDGF;更に前記ウイルスの適当な
DNA、RNA等に対する抗体等を挙げることができる。ま
た、使用する抗原としては、ウイルス、例えば、HIV、A
TLA、HBV;前記のウイルスのDNA;高分子ホルモン、例え
ば、インスリン、TSH等を挙げることができる。
抗原又は抗体をゼラチン磁性粒子に結合する方法とし
ては、物理吸着法又は化学結合法を採用することができ
る。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記粒子と抗原又
は抗体とを反応させることにより行ものである。この反
応に使用する緩衝溶液としては、例えば、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等を挙げることが
できる。反応は、両者を室温にて混合することにより容
易に進行し、目的物を得ることができる。また、化学結
合法は、所謂ペプチド結合法におけるカルボジイミド法
を採用することができる。例えば、反応を行うに当たっ
て、0.1〜５％のゼラチン磁性粒子の分散液に対して等
量の水溶性カルボジイミドを酸性下（pH4〜６）加え、
室温で10分〜１時間反応させ、上清を除去した後、0.01
〜10.0mg/mlの、好ましくは0.1〜5mg/mlの抗体又は抗原
溶液を加えることにより結合させることができる。この
とき用いる緩衝液は、リン酸緩衝液等であることが望ま
しい。また、その他の化学結合法としては、例えば、無
水グルタル酸、Ｎ−サクシニミジル−４−マレイミド酪
酸（GMBS）、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサンカルボン酸（CHMS）、グルタ
ールアルデヒド、塩化シアヌル等の２価性架橋試薬の存
在下に行う方法も採用することができる（「ペプチド合
成法」丸善株式会社（昭和50年）、「酵素免疫測定法」
共立出版株式会社、「蛋白質核酸酵素」別冊第31号（19
87年）参照）。
ては、物理吸着法又は化学結合法を採用することができ
る。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記粒子と抗原又
は抗体とを反応させることにより行ものである。この反
応に使用する緩衝溶液としては、例えば、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等を挙げることが
できる。反応は、両者を室温にて混合することにより容
易に進行し、目的物を得ることができる。また、化学結
合法は、所謂ペプチド結合法におけるカルボジイミド法
を採用することができる。例えば、反応を行うに当たっ
て、0.1〜５％のゼラチン磁性粒子の分散液に対して等
量の水溶性カルボジイミドを酸性下（pH4〜６）加え、
室温で10分〜１時間反応させ、上清を除去した後、0.01
〜10.0mg/mlの、好ましくは0.1〜5mg/mlの抗体又は抗原
溶液を加えることにより結合させることができる。この
とき用いる緩衝液は、リン酸緩衝液等であることが望ま
しい。また、その他の化学結合法としては、例えば、無
水グルタル酸、Ｎ−サクシニミジル−４−マレイミド酪
酸（GMBS）、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサンカルボン酸（CHMS）、グルタ
ールアルデヒド、塩化シアヌル等の２価性架橋試薬の存
在下に行う方法も採用することができる（「ペプチド合
成法」丸善株式会社（昭和50年）、「酵素免疫測定法」
共立出版株式会社、「蛋白質核酸酵素」別冊第31号（19
87年）参照）。
本発明における免疫測定法としては、例えば、放射免
疫測定法、酵素免疫測定法等を採用することができる。
これらの測定法は、標識された抗原又は抗体を用いる免
疫測定法であって、サンドイッチ法又は競争法により、
目的とする抗原又は抗体を測定することができる。
疫測定法、酵素免疫測定法等を採用することができる。
これらの測定法は、標識された抗原又は抗体を用いる免
疫測定法であって、サンドイッチ法又は競争法により、
目的とする抗原又は抗体を測定することができる。
酵素免疫測定法は、例えば、抗体結合ゼラチン磁性粒
子と酵素標識抗体と検体とを、１分〜18時間反応させて
行うものである。反応温度は４℃〜40℃であり、好まし
くは25℃〜38℃である。未反応酵素標識抗体を洗浄後、
固相に結合した抗体結合酵素の活性を基質を加えて測定
することにより、検体のリガンドの量を定量することが
できる。
子と酵素標識抗体と検体とを、１分〜18時間反応させて
行うものである。反応温度は４℃〜40℃であり、好まし
くは25℃〜38℃である。未反応酵素標識抗体を洗浄後、
固相に結合した抗体結合酵素の活性を基質を加えて測定
することにより、検体のリガンドの量を定量することが
できる。
標識に用いる酵素は、例えば、パーオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ等である。この際基質は、用いる酵素に
適したものを用いることはいうまでもなく、例えば、AB
TS、ルミノール−H2O2（パーオキシダーゼ用）、ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホ
スフェート、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−
メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−
1,2−ジオキセタン（以下、AMPPDと記す）（アルカリホ
スファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−ｏ−ガラ
クトース、メチルウンベリフェリル−β−ｏ−ガラクト
ース（β−ガラクトシダーゼ用）等を使用することがで
きる。
ルカリホスファターゼ、β−ラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ等である。この際基質は、用いる酵素に
適したものを用いることはいうまでもなく、例えば、AB
TS、ルミノール−H2O2（パーオキシダーゼ用）、ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホ
スフェート、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−
メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−
1,2−ジオキセタン（以下、AMPPDと記す）（アルカリホ
スファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−ｏ−ガラ
クトース、メチルウンベリフェリル−β−ｏ−ガラクト
ース（β−ガラクトシダーゼ用）等を使用することがで
きる。
測定は、４℃〜40℃で１分〜18時間反応させ、生じた
発色、蛍光量又は発光量を測定することにより行うもの
である。他に測定は、４℃〜40℃の範囲で加温しながら
行う所謂レート法を採用することもできる。
発色、蛍光量又は発光量を測定することにより行うもの
である。他に測定は、４℃〜40℃の範囲で加温しながら
行う所謂レート法を採用することもできる。
一方、放射免疫測定法は、上記酵素標識のかわりに
125I等の放射同位元素を標識して行うものである。放射
能を測定する以外の操作は、前記酵素免疫測定法の場合
と同じである。
125I等の放射同位元素を標識して行うものである。放射
能を測定する以外の操作は、前記酵素免疫測定法の場合
と同じである。
抗原又は抗体への放射標識は、既に市販されているボ
ルトンハンター試薬により容易に調製することができ
る。例えば、0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かした
抗原又は抗体溶液にこのボルトンハンター試薬を加え１
〜２時間後に、Ｇ−25の脱塩カラム等を用いて未反応の
ボルトンハンター試薬を除去することにより調製するこ
とができる。
ルトンハンター試薬により容易に調製することができ
る。例えば、0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かした
抗原又は抗体溶液にこのボルトンハンター試薬を加え１
〜２時間後に、Ｇ−25の脱塩カラム等を用いて未反応の
ボルトンハンター試薬を除去することにより調製するこ
とができる。
この他、クロラミンＴ法やヨードジン法等を採用する
ことにより容易に125Iの放射標識を行うことができる。
ことにより容易に125Iの放射標識を行うことができる。
免疫反応を行うにあたっては、本発明のゼラチン磁性
粒子に試料を加え、４℃〜40℃、好ましくは20℃〜38℃
で１分〜18時間反応させるものである。この後、生理食
塩水又は蒸留水で洗浄を行い、放射標識抗体をこのゼラ
チン磁性粒子に加え、４℃〜40℃好ましくは20℃〜38℃
で１分〜18時間反応させ、生理食塩水又は蒸留水で洗浄
を行い、その放射能活性を計測するものである。測定に
はシンチレーションカウンターを使用するものである。
粒子に試料を加え、４℃〜40℃、好ましくは20℃〜38℃
で１分〜18時間反応させるものである。この後、生理食
塩水又は蒸留水で洗浄を行い、放射標識抗体をこのゼラ
チン磁性粒子に加え、４℃〜40℃好ましくは20℃〜38℃
で１分〜18時間反応させ、生理食塩水又は蒸留水で洗浄
を行い、その放射能活性を計測するものである。測定に
はシンチレーションカウンターを使用するものである。
また本発明の測定法は、イソルミノールやアクリジン
エステル等を標識した化学発光測定法、フルオレセイン
やローダミンを標識した蛍光免疫測定法で行うこともで
きる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシ
アネート法を採用することにより容易に行うことできる
（「酵素免疫測定法」医学書院、1987年）。
エステル等を標識した化学発光測定法、フルオレセイン
やローダミンを標識した蛍光免疫測定法で行うこともで
きる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシ
アネート法を採用することにより容易に行うことできる
（「酵素免疫測定法」医学書院、1987年）。
同様に、抗体の測定は、例えば、本発明のゼラチン磁
性粒子を用い、試料と抗原を結合した磁性粒子を混合し
て、４℃〜40℃、１分〜18時間反応させた後、生理食塩
水又は蒸留水で洗浄し、更に標識抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体又は標識抗原を加え、４℃〜40℃で、１分〜18時
間反応させ、洗浄し、標識物の活性を測定することによ
り行うことができる。
性粒子を用い、試料と抗原を結合した磁性粒子を混合し
て、４℃〜40℃、１分〜18時間反応させた後、生理食塩
水又は蒸留水で洗浄し、更に標識抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体又は標識抗原を加え、４℃〜40℃で、１分〜18時
間反応させ、洗浄し、標識物の活性を測定することによ
り行うことができる。
本発明は、高分子化合物である核と、核の外側を覆う
磁性体で形成された層と、磁性体で形成された層の表面
をゼラチンを有する磁性粒子免疫測定法である。本発明
の方法は、ノイズが低くシグナルが高い免疫測定方法と
して用いることができる。
磁性体で形成された層と、磁性体で形成された層の表面
をゼラチンを有する磁性粒子免疫測定法である。本発明
の方法は、ノイズが低くシグナルが高い免疫測定方法と
して用いることができる。
図面の簡単な説明 図１は、磁性粒子、ゼラチンフェライト粒子及びゼラ
チン磁性粒子をそれぞれ分光光度計のセルに入れ、静置
した時の上清の濁度を比較した図である。
チン磁性粒子をそれぞれ分光光度計のセルに入れ、静置
した時の上清の濁度を比較した図である。
図２は、磁性粒子、ゼラチンフェライト粒子及びゼラ
チン磁性粒子をそれぞれ集磁した時の上清の濁度を比較
した図である。
チン磁性粒子をそれぞれ集磁した時の上清の濁度を比較
した図である。
図３は、アルカリ性フォスファターゼを結合した磁性
粒子及びゼラチン磁性粒子を集磁し、放置した後、基質
を加え、粒子の凝集の程度を比較した図である。
粒子及びゼラチン磁性粒子を集磁し、放置した後、基質
を加え、粒子の凝集の程度を比較した図である。
図４は、アルカリ性フォスファターゼを結合した磁性
粒子及びゼラチン磁性粒子を集磁し、放置した後、基質
を加え、粒子の凝集の程度を比較した図である。
粒子及びゼラチン磁性粒子を集磁し、放置した後、基質
を加え、粒子の凝集の程度を比較した図である。
図５は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のシグナル値を
比較した図である。
比較した図である。
図６は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のブランク値を
比較した図である。
比較した図である。
図７は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のS/Nを比較し
た図である。
た図である。
図８は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のシグナル値を
比較した図である。
比較した図である。
図９は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のブランク値を
比較した図である。
比較した図である。
図10は、磁性粒子とゼラチン磁性粒子のS/Nを比較し
た図である。
た図である。
発明の実施するための最良の形態 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ 高分子化合物粒子の製造 攪拌機、温度計、モノマー滴下ロート、還流冷却器、
加熱装置、窒素ガス導入管を有する重合反応容器にイオ
ン交換水230部を仕込み、80℃でスチレンとアクリル酸
２−エチルヘキシル及びエチレングリコールジメタクリ
レートの80/10/10の混合モノマー（Ａ）１部と10％の過
硫酸アンモニウム水溶液10部を加え、その後上記混合モ
ノマー（Ａ）99部を３時間滴下して高分子化合物粒子を
得た。この粒子を電子顕微鏡で観察したことろ、ほぼ単
分散で、粒径は0.3μｍであった。
加熱装置、窒素ガス導入管を有する重合反応容器にイオ
ン交換水230部を仕込み、80℃でスチレンとアクリル酸
２−エチルヘキシル及びエチレングリコールジメタクリ
レートの80/10/10の混合モノマー（Ａ）１部と10％の過
硫酸アンモニウム水溶液10部を加え、その後上記混合モ
ノマー（Ａ）99部を３時間滴下して高分子化合物粒子を
得た。この粒子を電子顕微鏡で観察したことろ、ほぼ単
分散で、粒径は0.3μｍであった。
実施例２ 磁性粒子の製造 攪拌機、温度計、酸化剤液、滴下ロート、加熱装置、
窒素ガス導入管を有する磁性体生成装置に前記高分子化
合物粒子エマルジョン（固形分30％）100部を仕込み、N
2ガスを導入して核エマルジョン中の酸素を脱気させ
た。
窒素ガス導入管を有する磁性体生成装置に前記高分子化
合物粒子エマルジョン（固形分30％）100部を仕込み、N
2ガスを導入して核エマルジョン中の酸素を脱気させ
た。
次いで、予め用意した塩化第１鉄溶液100部（固形分4
0部）、酢酸アンモニウム150部（固形分75部）を装置内
に投入し、充分に攪拌混合しながら70℃に加温した。そ
の後撹拌を続けながらアンモニア水にてpH7.2に調製し
た。
0部）、酢酸アンモニウム150部（固形分75部）を装置内
に投入し、充分に攪拌混合しながら70℃に加温した。そ
の後撹拌を続けながらアンモニア水にてpH7.2に調製し
た。
この溶液に亜硝酸ナトリウム溶液を約１時間かけて15
0部（固形分15部）を滴下した。滴下反応中窒素ガスの
導入、攪拌を続けながら液温70℃、pH7.0〜7.2の範囲に
保ち、該粒子表面にフェライト被覆を形成した。約20分
後、溶液を冷却して、濾過、イオン交換水による洗浄を
繰り返した後、粒子を取り出してフェライト被覆した磁
性粒子を得た。
0部（固形分15部）を滴下した。滴下反応中窒素ガスの
導入、攪拌を続けながら液温70℃、pH7.0〜7.2の範囲に
保ち、該粒子表面にフェライト被覆を形成した。約20分
後、溶液を冷却して、濾過、イオン交換水による洗浄を
繰り返した後、粒子を取り出してフェライト被覆した磁
性粒子を得た。
実施例３ 等電点がpH9である酸処理ゼラチン0.4gを40℃の温水2
0mlに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpH9に調製し
た。この混合液を予め40℃に加温した30容量％のエチル
アルコール溶液15mlに注ぎ、よく攪拌した。これに10％
ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液80μｌ、10％アルキル
スルホマレイン酸0.1ml、実施例２により製造した磁性
粒子0.2gを加えよく攪拌した。続いて40℃に保ちながら
10容量％の酢酸溶液を滴下しpHを5.0に調製し粒子を生
成させた。生成した粒子分散液を４℃に保持し、グルタ
ールアルデヒド65mgを加え、撹拌後４℃で一夜静置し
た。これを0.9％NaClで洗浄後、0.9％NaClで10％粒子溶
液とし、４容量％ホルマリン溶液を等容量加え、分散後
４℃で一週間静置した。得られたゼラチン磁性粒子の粒
径をLA−500で測定したところ平均6.2μｍであった。
0mlに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpH9に調製し
た。この混合液を予め40℃に加温した30容量％のエチル
アルコール溶液15mlに注ぎ、よく攪拌した。これに10％
ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液80μｌ、10％アルキル
スルホマレイン酸0.1ml、実施例２により製造した磁性
粒子0.2gを加えよく攪拌した。続いて40℃に保ちながら
10容量％の酢酸溶液を滴下しpHを5.0に調製し粒子を生
成させた。生成した粒子分散液を４℃に保持し、グルタ
ールアルデヒド65mgを加え、撹拌後４℃で一夜静置し
た。これを0.9％NaClで洗浄後、0.9％NaClで10％粒子溶
液とし、４容量％ホルマリン溶液を等容量加え、分散後
４℃で一週間静置した。得られたゼラチン磁性粒子の粒
径をLA−500で測定したところ平均6.2μｍであった。
実施例４ 等電点がpH9である酸処理ゼラチン0.4gを40℃の温水1
0mlに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpH9に調製し
た。ここに、40℃に加温したアラビアゴム0.4g、10mlを
加えよく撹拌した。この混合液に予め40℃に加温した30
容量％のエチルアルコール溶液15mlに注ぎ、よく攪拌し
た。これに10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液80μ
ｌ、10％アルキルスルホマレイン酸0.1ml、実施例２に
より製造した磁性粒子0.2gを加えよく攪拌した。続いて
40℃に保ちながら10容量％の酢酸溶液を滴下しpHを5.0
に調製し粒子を生成させた。生成した粒子分散液を４℃
に保持し、グルタールアルデヒド65mgを加え、よく攪拌
後４℃で一夜静置した。これを0.9％NaClで洗浄後、0.9
％NaClで10％粒子溶液とし、４容量％ホルマリン溶液を
等量加え、分散後４℃で一週間静置した。得られたゼラ
チン磁性粒子の粒径をLA−500で測定したところ平均4.7
μｍであった。
0mlに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpH9に調製し
た。ここに、40℃に加温したアラビアゴム0.4g、10mlを
加えよく撹拌した。この混合液に予め40℃に加温した30
容量％のエチルアルコール溶液15mlに注ぎ、よく攪拌し
た。これに10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液80μ
ｌ、10％アルキルスルホマレイン酸0.1ml、実施例２に
より製造した磁性粒子0.2gを加えよく攪拌した。続いて
40℃に保ちながら10容量％の酢酸溶液を滴下しpHを5.0
に調製し粒子を生成させた。生成した粒子分散液を４℃
に保持し、グルタールアルデヒド65mgを加え、よく攪拌
後４℃で一夜静置した。これを0.9％NaClで洗浄後、0.9
％NaClで10％粒子溶液とし、４容量％ホルマリン溶液を
等量加え、分散後４℃で一週間静置した。得られたゼラ
チン磁性粒子の粒径をLA−500で測定したところ平均4.7
μｍであった。
実施例５ 粒子の浮遊性の検討 実施例３で得られたゼラチン磁性粒子と、比較対象と
して実施例２で製造した磁性粒子及びゼラチン中に強磁
性体微粒子が分散しているゼラチンフェライト粒子（特
公平３−17103号公報）をそれぞれ0.015％の濃度で２％
BSAを含む100mMトリス−塩酸、150mM NaCl溶液（pH7.
2）に分散させ、1mlを分光光度計（日立製作所社製）セ
ルに入れ、室温で静置させた。５〜40分後に上清の濁度
を波長660nmの吸光度を測定することにより測定した。
その相対濁度を図１に示す。
して実施例２で製造した磁性粒子及びゼラチン中に強磁
性体微粒子が分散しているゼラチンフェライト粒子（特
公平３−17103号公報）をそれぞれ0.015％の濃度で２％
BSAを含む100mMトリス−塩酸、150mM NaCl溶液（pH7.
2）に分散させ、1mlを分光光度計（日立製作所社製）セ
ルに入れ、室温で静置させた。５〜40分後に上清の濁度
を波長660nmの吸光度を測定することにより測定した。
その相対濁度を図１に示す。
実施例６ 粒子の磁気分離速度の比較 実施例３で得られたゼラチン磁性粒子と、比較対象と
して実施例２で製造した磁性粒子及びゼラチン中に強磁
性体微粒子が分散しているゼラチンフェライト粒子（特
公平３−17103号公報）をそれぞれ0.015％の濃度で２％
BSAを含む100mMトリス−塩酸、150mM NaCl溶液（pH7.
2）に分散させ、1mlをチューブに取り表面磁場が1000ガ
ウスの磁石に接触させた。接触15秒〜２分後に上清の濁
度を波長660nmの吸光度を測定することにより測定し
た。その相対濁度を図２に示す。
して実施例２で製造した磁性粒子及びゼラチン中に強磁
性体微粒子が分散しているゼラチンフェライト粒子（特
公平３−17103号公報）をそれぞれ0.015％の濃度で２％
BSAを含む100mMトリス−塩酸、150mM NaCl溶液（pH7.
2）に分散させ、1mlをチューブに取り表面磁場が1000ガ
ウスの磁石に接触させた。接触15秒〜２分後に上清の濁
度を波長660nmの吸光度を測定することにより測定し
た。その相対濁度を図２に示す。
実施例７ 各粒子の乾燥状況での凝集度の比較 アルカリ性フォスファターゼを感作した実施例２で製
造した磁性粒子又は実施例３で製造したゼラチン磁性粒
子（0.015％）のそれぞれ250μｌをカートリッジに入れ
磁石に接して粒子を集磁させ上清を取り除いた。さらに
0.9％NaClを300μｌ加え粒子を集磁させる操作により洗
浄を行った。さらに0.9％NaClで２回、蒸留水で３回ず
つ洗浄し集磁したまま室温で０〜30分間放置した。この
後、発光基質であるAMPPDを加え37℃、５分間反応させ
た。その後直ちにルミノメーター（ALOKA社製）で発光
量を測定した。図３に粒子の乾燥（放置）時間とシグナ
ル値の関係を示す。また、この発光基質であるAMPPDを
加えた該粒子溶液をELISAプレートに入れ写真を取った
ものを図４に示す。
造した磁性粒子又は実施例３で製造したゼラチン磁性粒
子（0.015％）のそれぞれ250μｌをカートリッジに入れ
磁石に接して粒子を集磁させ上清を取り除いた。さらに
0.9％NaClを300μｌ加え粒子を集磁させる操作により洗
浄を行った。さらに0.9％NaClで２回、蒸留水で３回ず
つ洗浄し集磁したまま室温で０〜30分間放置した。この
後、発光基質であるAMPPDを加え37℃、５分間反応させ
た。その後直ちにルミノメーター（ALOKA社製）で発光
量を測定した。図３に粒子の乾燥（放置）時間とシグナ
ル値の関係を示す。また、この発光基質であるAMPPDを
加えた該粒子溶液をELISAプレートに入れ写真を取った
ものを図４に示す。
実施例８ 粒子のカルボキシル化 実施例３で製造したゼラチン磁性粒子100mgを蒸留
水、水、蒸留水で各々３回洗浄した後、容量５％に0.1M
炭酸水素ナトリウムで懸濁した無水グルタル酸を50mg加
え10分間反応させた。反応終了後、0.1M炭酸水素ナトリ
ウム溶液で３回洗浄し更に蒸留水で５回洗浄しこれをカ
ルボキシル化粒子とした。
水、水、蒸留水で各々３回洗浄した後、容量５％に0.1M
炭酸水素ナトリウムで懸濁した無水グルタル酸を50mg加
え10分間反応させた。反応終了後、0.1M炭酸水素ナトリ
ウム溶液で３回洗浄し更に蒸留水で５回洗浄しこれをカ
ルボキシル化粒子とした。
実施例９ 抗AFP抗体結合カルボキシル粒子の調整 20mMリン酸緩衝液（pH4.5）2.5mlに実施例８で製造し
たカルボキシル化粒子25mgを分散させこれに水溶性カル
ボジイミド25mgを加えた。室温で20分間反応させた後、
上清を除去し、抗AFP抗体溶液（1mg/ml、20mMリン酸緩
衝液、pH4.5）2.5ml加えエンドオーバーエンドミキサー
で攪拌した。２時間後、この粒子を２％BSA溶液（0.1M
トリス−塩酸、1mM、MgCl2、pH7.5）で５回洗浄しこ
れを同じBSA溶液に分散させ、抗AFP抗体結合カルボキシ
ル粒子とした。
たカルボキシル化粒子25mgを分散させこれに水溶性カル
ボジイミド25mgを加えた。室温で20分間反応させた後、
上清を除去し、抗AFP抗体溶液（1mg/ml、20mMリン酸緩
衝液、pH4.5）2.5ml加えエンドオーバーエンドミキサー
で攪拌した。２時間後、この粒子を２％BSA溶液（0.1M
トリス−塩酸、1mM、MgCl2、pH7.5）で５回洗浄しこ
れを同じBSA溶液に分散させ、抗AFP抗体結合カルボキシ
ル粒子とした。
実施例10 抗AFP抗体結合粒子によるAFPアッセイ 実施例９で作製した抗AFP抗体を結合した粒子250μｌ
にAFP抗原200ng/mlを含むサンプル10μｌを混合し、カ
ートリッジ中37℃で10分間、反応させた。このカートリ
ッジを表面磁場が3000ガウスの磁石に接して粒子を集磁
させ、上清をデカンテーションにより排液した。さらに
粒子に、生理食塩水300μｌを加え攪拌し、集磁後上清
をデカンテーションにより排液した。この操作を３回繰
り返した。次にアルカリ製フォスファターゼを結合した
抗AFP抗体（Fab′）250μｌ（0.1μg/ml、0.1M、トリス
−塩酸、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2）を混合し、37℃10
分間反応させた。さらに生理食塩水を用いたデカンテー
ションの方法で洗浄した。この粒子を含むカートリッジ
に発光基質であるAMPPD、200μg/mlを含む基質液（0.1M
DEA−塩酸、1mM MgCl2、pH10.0）を200μｌ加え37℃
５分間反応させた。その後ルミノメーター（ALOKA社
製）で発光量を測定した。
にAFP抗原200ng/mlを含むサンプル10μｌを混合し、カ
ートリッジ中37℃で10分間、反応させた。このカートリ
ッジを表面磁場が3000ガウスの磁石に接して粒子を集磁
させ、上清をデカンテーションにより排液した。さらに
粒子に、生理食塩水300μｌを加え攪拌し、集磁後上清
をデカンテーションにより排液した。この操作を３回繰
り返した。次にアルカリ製フォスファターゼを結合した
抗AFP抗体（Fab′）250μｌ（0.1μg/ml、0.1M、トリス
−塩酸、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2）を混合し、37℃10
分間反応させた。さらに生理食塩水を用いたデカンテー
ションの方法で洗浄した。この粒子を含むカートリッジ
に発光基質であるAMPPD、200μg/mlを含む基質液（0.1M
DEA−塩酸、1mM MgCl2、pH10.0）を200μｌ加え37℃
５分間反応させた。その後ルミノメーター（ALOKA社
製）で発光量を測定した。
また、実施例２で製造した磁性粒子をアミノシラン化
し、カルボキシル化後、抗AFP抗体を結合した磁性粒子
を製造し、AFPを測定した。その結果を図５、６及び７
に示す。図５にシグナル値、図６にブランク値（ノイズ
値）、図７にS/Nを示す。
し、カルボキシル化後、抗AFP抗体を結合した磁性粒子
を製造し、AFPを測定した。その結果を図５、６及び７
に示す。図５にシグナル値、図６にブランク値（ノイズ
値）、図７にS/Nを示す。
実施例11 ゼラチン磁性粒子のマレイミド化 100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）4mlに実施例
３で調製したゼラチン磁性粒子20mgを分散させ、これに
GMBS溶液（1mg/ml、エタノール）2mlを加え、エンドオ
ーバーエンドで攪拌した。１時間後、さらに同じGMBS溶
液2mlを加え、エンドオーバーエンドで攪拌した。１時
間後、エタノールで３回洗浄し、さらに100mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）で３回洗浄し、これをマレイ
ミド化粒子とした。
３で調製したゼラチン磁性粒子20mgを分散させ、これに
GMBS溶液（1mg/ml、エタノール）2mlを加え、エンドオ
ーバーエンドで攪拌した。１時間後、さらに同じGMBS溶
液2mlを加え、エンドオーバーエンドで攪拌した。１時
間後、エタノールで３回洗浄し、さらに100mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）で３回洗浄し、これをマレイ
ミド化粒子とした。
実施例12 TP抗原結合粒子の調製 トレポネーマ パリダム（TP）抗原溶液（300μg/m
l、50mM炭酸水素ナトリウム水溶液、pH8.2）350μｌに
イミノチオラン溶液3.5μｇを加えた。37℃で30分間反
応させた後、PD−10（ファルマシア社製）を用いて緩衝
液を50mMリン酸カリウム緩衝液（1mM EDTA・2Na、pH7.
0）に交換した。これに実施例11で調製したマレイミド
化粒子3.5mgを分散させた。２時間エンドオーバーエン
ドミキサーで攪拌した後に、50mMリン酸ナトリウム緩衝
液（1mM EDTA・2Na、pH7.0）で３回洗浄し、さらに、
２％BSA溶液（50mM トリス−塩酸、0.15M塩化ナトリウ
ム、1mM EDTA・2Na、pH7.2）で３回洗浄し、これと同
じ２％BSA溶液に分散させ、TP抗原結合粒子とした。
l、50mM炭酸水素ナトリウム水溶液、pH8.2）350μｌに
イミノチオラン溶液3.5μｇを加えた。37℃で30分間反
応させた後、PD−10（ファルマシア社製）を用いて緩衝
液を50mMリン酸カリウム緩衝液（1mM EDTA・2Na、pH7.
0）に交換した。これに実施例11で調製したマレイミド
化粒子3.5mgを分散させた。２時間エンドオーバーエン
ドミキサーで攪拌した後に、50mMリン酸ナトリウム緩衝
液（1mM EDTA・2Na、pH7.0）で３回洗浄し、さらに、
２％BSA溶液（50mM トリス−塩酸、0.15M塩化ナトリウ
ム、1mM EDTA・2Na、pH7.2）で３回洗浄し、これと同
じ２％BSA溶液に分散させ、TP抗原結合粒子とした。
実施例13 TP抗原結合粒子による抗体検出系アッセイ 実施例12で作製した0.01％TP抗原結合粒子350μｌに1
0倍希釈した抗TP抗体陽性血清20μｌを混合し、カート
リッジ中37℃で10分間反応させた。このカートリッジを
表面磁場が3000ガウスの磁石に接して粒子を集磁させ、
上清をデカンテーションにより廃液した。この後、生理
食塩水300μｌを加え攪拌した。このカートリッジを前
記方法により廃液した。この操作を３回繰り返した。次
にアルカリ性ホスファターゼを結合した抗ヒト抗体250
μｌ（0.2μg/ml、50mM Mes−水酸化ナトリウム、pH6.
8）を混合し、37℃、10分間反応させた。このカートリ
ッジを前記方法で洗浄した。この粒子を含むカートリッ
ジに発光基質であるAMPPD、200μg/mlを含む基質液（0.
1M EDA−塩酸、1mM MgCl2、pH10.0）を200μｌ加え、
37℃、５分間反応させた。その後ルミノメーター（ALOK
A社製）で発光量を測定した。
0倍希釈した抗TP抗体陽性血清20μｌを混合し、カート
リッジ中37℃で10分間反応させた。このカートリッジを
表面磁場が3000ガウスの磁石に接して粒子を集磁させ、
上清をデカンテーションにより廃液した。この後、生理
食塩水300μｌを加え攪拌した。このカートリッジを前
記方法により廃液した。この操作を３回繰り返した。次
にアルカリ性ホスファターゼを結合した抗ヒト抗体250
μｌ（0.2μg/ml、50mM Mes−水酸化ナトリウム、pH6.
8）を混合し、37℃、10分間反応させた。このカートリ
ッジを前記方法で洗浄した。この粒子を含むカートリッ
ジに発光基質であるAMPPD、200μg/mlを含む基質液（0.
1M EDA−塩酸、1mM MgCl2、pH10.0）を200μｌ加え、
37℃、５分間反応させた。その後ルミノメーター（ALOK
A社製）で発光量を測定した。
図８にシグナル値、図９にブランク値（ノイズ値）、
図10にS/Nを示す。
図10にS/Nを示す。
産業上の利用可能性 本発明の免疫測定方法で用いられる磁性粒子は、高分
子化合物である核と、核の外側を覆う磁性体で形成した
層と、磁性体形で形成した層の表面にゼラチンを有して
いるため、鉄の溶出がほとんどなく長期保存に対し極め
て安定している。また、磁気応答性に優れかつ自己凝集
が起こり難いため、迅速なB/F分離及び洗浄を行うに際
し、充分な対応が期待できる。従って、本発明の方法
は、ノイズが低く、シグナルの高い測定結果を得ること
ができる。
子化合物である核と、核の外側を覆う磁性体で形成した
層と、磁性体形で形成した層の表面にゼラチンを有して
いるため、鉄の溶出がほとんどなく長期保存に対し極め
て安定している。また、磁気応答性に優れかつ自己凝集
が起こり難いため、迅速なB/F分離及び洗浄を行うに際
し、充分な対応が期待できる。従って、本発明の方法
は、ノイズが低く、シグナルの高い測定結果を得ること
ができる。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−115862（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−195161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−82723（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−504303（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/553 G01N 33/548
Claims (7)
- 【請求項１】高分子化合物である核と、前記核の外側を
覆う磁性体で形成した層と、前記磁性体で形成した層の
表面に被覆したゼラチンとからなり、粒径が1.0〜10μ
ｍであることを特徴とするゼラチン磁性粒子。 - 【請求項２】核が、粒径0.1〜５μｍである請求項１記
載のゼラチン磁性粒子。 - 【請求項３】高分子化合物が、ポリスチレン、ポリメタ
アクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、スチレ
ンとメタアクリル酸エステルとの共重合体、スチレンと
アクリル酸エステルとの共重合体、ポリマー化したシラ
ン及び有機シランからなる群より選択される少なとも１
種である請求項１又は２記載のゼラチン磁性粒子。 - 【請求項４】高分子化合物である核と、前記核の外側を
覆う磁性体で形成した層と、前記磁性体で形成した層の
表面に被覆したゼラチンとを有する粒径が1.0〜10μｍ
のゼラチン磁性粒子を用いることを特徴とする免疫測定
法。 - 【請求項５】核が、粒径0.1〜５μｍである請求項４記
載の免疫測定法。 - 【請求項６】高分子化合物が、ポリスチレン、ポリメタ
アクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、スチレ
ンとメタアクリル酸エステルとの共重合体、スチレンと
アクリル酸エステルとの共重合体、ポリマー化したシラ
ン及び有機シランからなる群より選択される少なくとも
１種である請求項４又は５記載の免疫測定法。 - 【請求項７】免疫測定法が、標識抗原又は標識抗体を用
いるものである請求項４、５又は６記載の免疫測定法。
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| CN112034159B (zh) * | 2020-09-06 | 2023-08-29 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途 |
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| JPS59195161A (ja) * | 1983-04-21 | 1984-11-06 | Fujirebio Inc | 磁性粒子及びその製造法 |
| US4965007A (en) * | 1988-05-10 | 1990-10-23 | Eastman Kodak Company | Encapsulated superparamagnetic particles |
| JP2979414B2 (ja) * | 1989-09-29 | 1999-11-15 | 富士レビオ株式会社 | 磁性粒子およびそれを用いた免疫測定法 |
| US5169754A (en) * | 1990-10-31 | 1992-12-08 | Coulter Corporation | Biodegradable particle coatings having a protein covalently immobilized by means of a crosslinking agent and processes for making same |
-
1994
- 1994-07-08 WO PCT/JP1994/001120 patent/WO1995002185A1/ja active IP Right Grant
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- 1994-07-08 JP JP50395695A patent/JP3192149B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 CA CA002166705A patent/CA2166705C/en not_active Expired - Fee Related
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- 1994-07-08 DE DE69428445T patent/DE69428445T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 EP EP94919875A patent/EP0709680B1/en not_active Expired - Lifetime
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