DE69428445T2

DE69428445T2 - Magnetische mit gelatine überzogene teilchen und sie verwendender immunoassay

Info

Publication number: DE69428445T2
Application number: DE69428445T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Ashihara; Mitsuo Isomura; Kazuya Shimada; Masayoshi Ueno
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1993-07-08
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2014-07-09
Also published as: CA2166705C; EP0709680A4; CA2166705A1; AU681893B2; EP0709680B1; ES2164710T3; DE69428445D1; AU7084594A; EP0709680A1; WO1995002185A1; JP3192149B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Magnetteilchen und ein Immunoassay-Verfahren unter Verwendung derselben. Insbesondere betrifft sie ein Immunoassay-Verfahren, das Magnetteilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 bis 10 um verwendet und ein organisches Polymermaterial als Kern, eine Schicht aus magnetischem Material, welche den Kern überzieht, und Gelatine, welche die äußere Schicht überzieht, umfaßt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei Immunoassay-Verfahren, insbesondere Enzym-Immunoassays, wurden bisher Perlen mit einem ziemlich großen Durchmesser als feste Phase verwendet. Es ist bekannt, daß eine Verringerung ihrer Größe und eine Erhöhung der Oberfläche der festen Phase sich vorteilhaft auf hohe Empfindlichkeitsstufen bei der Durchführung immunologischer Reaktionen auswirken.
Wenn jedoch Teilchen mit einem kleineren Durchmesser verwendet werden, muß eine Zentrifuge verwendet werden oder es muß eine Filtration unter Verwendung eines Filters für die B/F-Trennung erfolgen, so daß das Assay-Verfahren kaum als einfach und leicht bezeichnet werden kann. Deshalb wurde zur wirksamen und einfachen Durchführung der B/F-Trennung vorgeschlagen, daß Magnetteilchen mit kleinem Durchmesser verwendet werden.
So ist z. B. ein Immunoassay-Verfahren bekannt, bei dem durch Beschichten eines Magnetkerns mit Silan hergestellte Teilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 bis 10 um verwendet wurden (Japanische Patentveröffentlichungen Kokai Nr. 55-141670 und 50- 122997).
Ein anderes Immunoassay-Verfahren war bekannt, bei dem durch Beschichten eines magnetischen Metalloxidkerns mit einem Silan erhaltene Teilchen mit einer Teilchengröße von 0,1 bis 1,5 um verwendet wurden (Japanische Patentveröffentlichung Kokai Nr. 60- 1564).
Diese bekannten Teilchen, die ein magnetisches Metallmaterial als Kern umfassen, haben jedoch einige Nachteile. Z. B. zeigen sie schlechte Einheitlichkeit hinsichtlich der Teilchengröße oder besitzen schlechte Langzeit-Lagerbeständigkeit, wie anhand der Eisenmigration veranschaulicht.
Demzufolge wurden Versuche unternommen, die Teilchen zu verbessern und sie für Langzeit-Lagerung beständig zu machen. So sind z. B. Teilchen, die organische Polymermaterialien als Kern und eine aus einem Ferrit auf Eisenoxid-Basis zusammengesetzte Oberflächen-Beschichtungsschicht umfassen und eine Teilchengröße von 0,2 bis 3 um aufweisen, und ein Immunoassay-Verfahren unter Verwendung derselben (Japanische Patentveröffentlichung Kokai Nr. 3-115862, was EP-A-420 186 entspricht) bekannt. Des weiteren sind durch Dispergieren von ferromagnetischen Feinteilchen in Gelatine hergestellte Gelatine-Ferrit-Teilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 bis 100 um und ein Immunoassay-Verfahren unter Verwendung derselben bekannt (Japanische Patentveröffentlichung Kokoku Nr. 3-17103).
Des weiteren wurde ein Immunkomplextransfer-Assayverfahren vorgeschlagen, um eine Geräuschdämpfung zu erzielen (Tanpakushitsu, Kakusan, Koso, Band 37, S. 144).
WO 92/08134 offenbart kolloidale Teilchen mit einem festen Kern, der mit mindestens einer wasserlöslichen Gelatine beschichtet ist.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Magnetteilchen, die organische Polymermaterialien als Kern und eine Ferrit- Oberflächenschicht auf Eisenoxid-Basis umfassen, wurden hinsichtlich der Langzeit- Lagerbeständigkeit tatsächlich verbessert, doch einige Probleme sind noch ungelöst. Z.B. besitzen sie zum Zeitpunkt der Immunreaktion schlechtere Schwimmfähigkeit und neigen zum Zeitpunkt der B/F-Trennung in dem Immunoassay-Verfahren zu Teilchenaggregation und weisen darüber hinaus schlechte Wiederdispergierbarkeit auf. Was die durch Dispergieren ferromagnetischer Feinteilchen in Gelatine hergestellten Gelatine-Ferrit- Teilchen betrifft, wurde das Problem der Teilchenaggregation gelöst, doch ihr magnetisches Ansprechverhalten ist schlecht, so daß sie für Immunoassay-Verfahren, insbesondere für Enzym-Immunoassay-Verfahren, bei denen schnelle B/F-Trennung und schnelles Waschen erforderlich sind, nicht geeignet sind. Das Immunkomplextransfer-Assayverfahren ist nicht praktisch, da es eine größere Anzahl von Verfahrensschritten beinhaltet und eine relativ lange Assayzeit erfordert.
Die vorliegenden Erfinder haben ernste Anstrengungen unternommen, um diese Probleme zu lösen, und festgestellt, daß Magnetteilchen, die organische Polymermaterialien als Kern, eine Schicht aus magnetischem Material, welche den Kern überzieht, und eine Gelatineschicht, welche die Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material überzieht, umfassen und eine Teilchengröße von 1,0 bis 10 um aufweisen, wenn sie in Immunoassay- Verfahren verwendet werden, aufgrund der Tatsache, daß die Magnetteilchen über einen langen Zeitraum hinweg beständig sind, somit über einen langen Zeitraum hinweg gelagert werden können, geringes Rauschen und hohe Signalstärke in dem Assay zur Folge haben können, hinsichtlich Schwimmfähigkeit verbessert wurden, außerdem kaum zu Selbstaggregation neigen und ausreichendes magnetisches Ansprechverhalten und ausreichende Dispergierbarkeit zeigen, um eine schnelle B/T-Trennung und schnelles Waschen zu ermöglichen. Des weiteren können die Magnetteilchen dieser Erfindung leicht und in einer solchen Weise hergestellt werden, daß sie eine gewünschte Teilchengröße aufweisen und auch eine einheitliche Teilchengröße haben. Diese Tatsache kann ebenfalls als Folge des hohen Maßes an Reproduzierbarkeit bezeichnet werden.
Diese Erfindung stellt somit ein Immunoassay-Verfahren unter Verwendung von mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen bereit, die einen aus organischen Polymermaterialien bestehenden Kern, eine Schicht aus magnetischem Material, welche die Oberfläche des Kerns überzieht, und eine Gelatineschicht, welche die Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material überzieht, umfassen und eine Teilchengröße von 1,0 bis 10 um aufweisen.
Als Magnetteilchen, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, können z. B. jene genannt werden, die durch Verwendung von Magnetteilchen, die eine aus einem magnetischen Material auf der Oberfläche eines Kerns aus organischen Polymermaterialien gebildete Schicht umfassen, und Beschichten der Magnetteilchen mit Gelatine hergestellt werden. (Im folgenden werden derartige Teilchen als mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen bezeichnet).
Das oben genannte Verfahren des Beschichtens mit Gelatine kann mit Hilfe irgendeines Verfahrens, das auf diesem Gebiet allgemein verwendet wird, z. B. durch das Verfahren der chemischen Bindung unter Verwendung der funktionellen Gruppen auf der Magnetteilchen- Oberfläche und unter Verwendung von Gelatine, oder mit Hilfe des Verfahrens der Koazervierung [T. N. Evreinova (Autor): "Coacervates", Modern Biology Series 22, Kyoritsu Shuppan] durchgeführt werden.
Das Verfahren der chemischen Bindung unter Verwendung der funktionellen Gruppen auf der Magnetteilchen-Oberfläche und unter Verwendung von Gelatine kann z. B. dadurch durchgeführt werden, daß man die Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl- und/oder Thiolgruppen auf der Magnetteilchen-Oberfläche und die Amino- oder Carboxylgruppen der Gelatine einer Kondensation durch Entwässerung unterzieht.
Zur Entwässerung kann jedes Kondensationsmittel verwendet werden, das im allgemeinen bei Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen verwendet wird. Beispiele sind wasserlösliche Carbodiimide und Woodward-Reagenzien.
Unter anderem kann das Koppeln von Thiolgruppen an der Magnetteilchen-Oberfläche an Gelatine, wobei das Verfahren umfaßt, daß man im voraus Maleimidgruppen in Gelatine einführt und die maleimidierte Gelatine der Reaktion unterzieht, verwendet werden.
Zum Beschichten von Gelatine durch Koazervierung können das Verfahren, das das Beschichten der Außenoberfläche von Magnetteilchen mit durch Koazervierung hergestellten Gelatmeteilchen unter Verwendung des Verfahrens der chemischen Bindung umfaßt, und das Verfahren, das das Durchführen der Koazervierung von Gelatine in Gegenwart von Magnetteilchen umfaßt, verwendet werden.
Der hierin verwendete Ausdruck "Koazervierung" bedeutet Koazervatbildung und "Koazervat" bedeutet das gesamte aus einer an gelösten Stoffen reichen Phase und einer an gelösten Stoffen armen Phase zusammengesetzte System.
Obwohl je nach den Bedingungen zwei Arten der Koazervierung, eine einfache und eine komplexe, unterschieden werden können, kann jede Art bei der Herstellung der Teilchen dieser Erfindung verwendet werden.
Bei der einfachen Koazervierung machte man sich das Phänomen zunutze, daß die Löslichkeit des organischen Polymers abnimmt und eine Phasentrennung des organischen Polymers von der wäßrigen Lösung eintritt, wenn einer Lösung eines organischen Polymers z. B. ein Elektrolyt oder ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird oder wenn der pH einer Lösung eines organischen Polymers gleich dem isoelektrischen Punkt des organischen Polymers wird. Bei der komplexen Koazervierung bewirkt eine elektrische Wechselwirkung, die aus der Kombination eines Polykations und eines Polyanions herrührt, die Koazervierung. In diesem Fall sind das Mischungsverhältnis zwischen dem Polykation und dem Polyanion, die anfängliche Konzentration, das gleichzeitig vorliegende Salz und dessen Konzentration, und der pH bestimmende Faktoren.
Bei einem Verfahren zur Herstellung der als Beispiel angeführten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen werden eine Gelatine enthaltende Lösung (2 bis 10%), ein Metaphosphat-Salz (0,01 bis 5%), Magnetteilchen (0,3 bis 1%) und ein wasserlösliches Polysaccharid (0 bis 5%) verwendet und eine Säure wird zugesetzt, um dadurch den pH auf 2,5 bis 6,0 einzustellen, woraufhin die Koazervierung eintritt, um mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen zu ergeben. Dann wird die Gelatineschicht mit einem Aldehyd- Vernetzungsmittel umgesetzt, um die äußere Schicht unlöslich zu machen. Zur Beschichtung von Magnetteilchen verwendete Gelatine ist eine Art abgeleitetes Protein und wird aus Kollagen erhalten. Unter verschiedenen Spezies ist säurebehandelte Gelatine mit einem isoelektrischen Punkt von 6 bis 9 wünschenswert. Als wasserlösliches Polysaccharid sind z. B. Gummi arabicum, Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Agar und Carrageenan verwendbar.
Die Messung der Teilchengröße von Teilchen in dem Dispergiermittel kann unter Verwendung eines Teilchengrößen-Meßapparats unter Verwendung des Laserbeugungs- Verfahrens, z. B. eines LA-500 Apparats (Horiba Seisakusho), durchgeführt werden. Die mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen dieser Erfindung haben einen mittleren Teilchendurchmesser von 1 bis 10 um. Für wirksamere Immunoassay-Verfahren liegt die mittlere Teilchengröße jedoch vorzugsweise im Bereich von 2 bis 8 um. Kleinere Teilchen mit einer Teilchengröße von weniger als 1 um erfordern lange Zeit für die B/F-Trennung und machen es schwierig, den Assay auf einfache und leichte Weise durchzuführen.
Teilchen mit einer Teilchengröße von mehr als 10 um sind insofern von Nachteil, als sich die Schwimmfähigkeit verschlechtert, so daß Assays nicht mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden können.
Zur Herstellung von mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen mit einer Teilchengröße von 1 bis 10 um liegt die Teilchengröße des Kerns vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 5 um. Wenn ein Kern mit einer Teilchengröße von mehr als 5 um verwendet wird, ist die Teilchengröße der hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen größer als 10 ,im. Wenn ein Kern mit einer Teilchengröße von weniger als 0,1 um verwendet wird, haben die mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen eine Teilchengröße von weniger als 1 um, was es unmöglich macht, Assays wirksam durchzuführen. Die als Kernmaterial für die mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen zu verwendenden organischen Polymermaterialien beinhalten unter anderem Polystyrol, Polymethacrylsäureester, Polyacrylsäureester, Styrol- Methacrylsäureester-Copolymere, Styrol-Acrylsäureester-Copolymere, polymerisierte Silane - und organische Silane.
Das magnetische Material zur Bildung einer Kern-Beschichtungsschicht ist ein magnetisches Metallmaterial und es können Ferrit, Mangan-, Cobalt-, Nickel- oder ähnliche Metalle enthaltende Fernt-Spezies und dergleichen verwendet werden.
Wenn ein Antikörper oder Antigen daran gebunden ist, können die mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen dieser Erfindung in Immunoassay-Verfahren verwendet werden. Der an die Teilchen zu bindende Antikörper beinhaltet unter anderem Antikörper für Arzneistoffe wie Theophyllin, Phenytoin und Valproesäure, für niedrigmolekulare Hormone wie Thyroxin, Östrogen und Östradiol, für Krebsmarker wie CEA und AFP, für virale Antigene wie HIV, ATLA und HBV, für makromolekulare Hormone wie TSH und Insulin, für Cytokine wie IL-1, IL-2 und IL-6, für verschiedene Wachstumsfaktoren wie EGF und PDGF, und weiter für geeignete DNAs, RNAs und dergleichen der oben genannten Viren. Das zu verwendende Antigen beinhaltet unter anderem Viren wie HIV, ATLA und HBV, DNAs derartiger Viren und makromolekulare Hormone wie Insulin und TSH.
Zur Bindung eines Antigens oder Antikörpers an die mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen können das Verfahren der physikalischen Adsorption oder das Verfahren der chemischen Bindung verwendet werden. Die physikalische Adsorption wird durch Umsetzen der Teilchen mit einem Antigen oder Antikörper in einer geeigneten Pufferlösung durchgeführt. Der bei diesem Verfahren zu verwendende Puffer ist z. B. Phosphatpuffer, Tris-Hydrochlorid-Puffer, Carbonatpuffer oder dergleichen. Wenn beide Materialien bei Raumtemperatur gemischt werden, schreitet die Reaktion leicht fort, um das gewünschte Produkt zu liefern. Im Fall einer chemischen Bindung kann das sogenannte Carbodiimid- Verfahren unter den Verfahren zur Bildung einer Peptid-Bindung verwendet werden. So wird zum Durchführen der Reaktion z. B. eine wasserlösliche Carbodiimid-Lösung einer entsprechenden Menge einer 0,1 bis 5% Dispersion mit Gelatine beschichteter Magnetteilchen unter sauren Bedingungen (pH 4 bis 6) zugesetzt, die Reaktion wird 10 Minuten bis 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt, dann wird der Überstand entfernt und eine Antikörper- oder Antigen-Lösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 10,0 mg/ml, vorzugsweise 0,1 bis 5 mg/ml, wird zugesetzt, um den Antikörper oder das Antigen zu binden. Als bei dieser Gelegenheit zu verwendender Puffer sind Phosphatpuffer und dergleichen bevorzugt. Es ist auch möglich, die chemische Bindung gemäß anderen Verfahren in Gegenwart eines zweiwertigen Vernetzungsmittels wie Glutarsäureanhydrid, N-Succinimidyl-4-maleimidobuttersäure (GMBS), N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)- cyclohexancarbonsäure (CHMS), Glutaraldehyd oder Cyanursäurechlorid zu bewirken [s. "Peputido Goseiho (Peptidsynthese)", Maruzen Co. (1975); "Koso Men-eki Sokuteiho (Enzym-Immunoassay)", Kyoritsu Shuppan; "Tanpakushitsu, kakusan, Koso (Protein, Nukleinsäure, Enzym)", Ergänzung Nr. 31 (1987)].
Das Immunoassay-Verfahren dieser Erfindung kann unter anderem als Radioimmunoassay oder Enzym-Immunoassay durchgeführt werden. Diese Assay-Verfahren verwenden ein markiertes Antigen oder einen markierten Antikörper und das Ziel-Antigen oder der Ziel- Antikörper können mit Hilfe des Sandwich- oder Kompetitionsverfahrens gemessen werden.
Beim Enzym-Immunoassay-Verfahren werden an Antikörper gebundene, mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen mit einem Enzym-markierten Antikörper und einer Probe 1 Minute bis 18 Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 4ºC bis 40ºC, vorzugsweise 25ºC bis 38ºC. Der nicht umgesetzte Enzym-markierte Antikörper wird weggewaschen und dann wird ein geeignetes Substrat zugesetzt und die Aktivität des Antikörper-gebundenen Enzyms, das an die feste Phase gebunden ist, bestimmt, wodurch der Ligand in der Probe quantitativ bestimmt werden kann.
Das zur Markierung zu verwendende Enzym beinhaltet unter anderem Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase und Glucoseoxidase. Das bei dem Assay zu verwendende Substrat sollte natürlich eines sein, das an das verwendete Enzym angepaßt ist, und beinhaltet somit unter anderem ABTS, Luminol-H&sub2;O&sub2; (für Peroxidase), p- Nitrophenylphosphat, Methylumbelliferylphosphat, 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4- (3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan (im folgenden als AMPPD bezeichnet) (für alkalische Phosphatase), p-Nitrophenyl-β-O-galactose, Methylumbelliferyl-β-O-galactose (für β-Galactosidase) und dergleichen.
Die quantitative Bestimmung erfolgt dadurch, daß man die Reaktion 1 Minute bis 18 Stunden lang bei 4ºC bis 40ºC fortschreiten läßt und dann die resultierende Farbebtwicklung, Fluoreszenz-Intensität oder Lumineszenz-Intensität mißt. Zur Messung kann auch das sogenannte Verhältnisverfahren, das unter Erwärmen im Bereich von 4ºC bis 40ºC durchzuführen ist, verwendet werden.
Das Radioimmunoassay-Verfahren verwendet ein Radioisotop wie 1251 als Markierung anstelle der oben genannten Enzym-Markierung. Die Vorgehensweise ist im allgemeinen die gleiche wie bei dem oben genannten Enzym-Immunoassay-Verfahren, mit der Ausnahme, daß Radioaktivität gemessen wird.
Die Radiomarkierung von Antigenen oder Antikörpern kann leicht unter Verwendung des bereits auf dem Markt erhältlichen Bolton-Hunter-Reagens durchgeführt werden. So kann die Radiomarkierung z. B. leicht durch Zugabe des Bolton-Hunter-Reagens zu einer Antigen- oder Antikörper-Lösung in 0,1 M wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und nach Verstreichen von 1 bis 2 Stunden durch Entfernen des nicht umgesetzten Bolton-Hunter- Reagens unter Verwendung von z. B. einer G-25-Entsalzungssäule durchgeführt werden.
Das Chloramin T-Verfahren oder das Iodogen-Verfahren können z. B. ebenfalls verwendet werden, um leicht eine ¹²&sup5;I-Markierung zu erzielen.
Um ein Fortschreiten der Immunreaktion zu erlauben, wird den mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen dieser Erfindung eine Probe zugesetzt und das Gemisch wird 1 Minute bis 18 Stunden lang bei 4ºC bis 40ºC, vorzugsweise 20ºC bis 38ºC, gehalten. Dann werden die Teilchen mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen oder destilliertem Wasser gewaschen, ein radiomarkierter Antikörper wird den mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen zugesetzt und die Reaktion wird bei 4ºC bis 40ºC, vorzugsweise 20ºC bis 38ºC, 1 Minute bis 18 Stunden lang fortschreiten gelassen, gefolgt von Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, und die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen.
Das Assay-Verfahren dieser Erfindung kann auch als Chemilumineszenz-Assay oder Immunofluoreszenz-Assay durchgeführt werden. Bei ersterem wird Isoluminol, ein Acridinester oder dergleichen als Markierung verwendet, und bei letzterem wird Fluorescein, Rhodamin oder dergleichen als Markierung verwendet. In diesen Fällen kann die Markierung leicht unter Verwendung des Aktivester-Verfahrens oder Isocyanat-Verfahrens erfolgen ("Koso Men-eki Sokuteiho (Enzym-Immunoassay)", Igaku Shoin, 1987).
Ähnlich werden bei einem Beispiel für ein Antikörper-Assayverfahren Antigen-gebundene, mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen gemäß dieser Erfindung mit einer Probe gemischt und die Reaktion wird bei 4ºC bis 40ºC 1 Minute bis 18 Stunden lang fortschreiten gelassen, dann werden die Teilchen mit physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser gewaschen, weiter werden ein markierter anti-Human-Immunoglobulin-Antikörper oder ein markiertes Antigen zugesetzt, die Reaktion wird bei 4ºC bis 40ºC 1 Minute bis 18 Stunden lang fortschreiten gelassen, Waschen wird durchgeführt und die Aktivität der Markierung wird gemessen.
Wie oben erwähnt handelt es sich bei dem Immunoassay-Verfahren gemäß der Erfindung um eines, bei dem Magnetteilchen, die einen organischen Polymerkern, eine Schicht aus magnetischem Material, welche den Kern überzieht, und auf die Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material aufgetragene Gelatine umfassen, verwendet werden. Diese Erfindung kann als Immunoassay-Verfahren verwendet werden, das in der Lage ist, geräuscharme, signalstarke Daten zu liefern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt Vergleichsdaten zur Trübung des Überstands, die dadurch erhalten werden, daß man Magnetteilchen, Gelatine-Ferrit-Teilchen und mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen in dispergierter Form in die entsprechenden Zellen eines Spektralphotometers gibt und die Dispersionen stehen läßt.
Fig. 2 zeigt Vergleichsdaten zur Trübung des Überstands, die dadurch erhalten werden, daß man Magnetteilchen, Gelatine-Fernt-Teilchen und mit Gelatine beschichtete Magnetteilchen in dispergierter Form einer Magnetabscheidung unterzieht.
Fig. 3 zeigt im Vergleich die Aggregationsgrade an alkalische Phosphatase gebundener Magnetteilchen und an alkalische Phosphatase gebundener, mit Gelatine beschichteter Magnetleilchen, wie sie nach der Magnetabscheidung, Stehenlassen und Zugabe eines Substrats zu finden sind.
Fig. 4 zeigt im Vergleich die Aggregationsgrade an alkalische Phosphatase gebundener Magnetteilchen und an alkalische Phosphatase gebundener, mit Gelatine beschichteter Magnetteilchen, wie sie nach der Magnetabscheidung, Stehenlassen und Zugabe eines Substrats zu finden sind.
Fig. 5 zeigt im Vergleich Signalwerte, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.
Fig. 6 zeigt im Vergleich Blindwerte, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.
Fig. 7 zeigt im Vergleich S/R-Verhältnisse, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.
Fig. 8 zeigt im Vergleich Signalwerte, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.
Fig. 9 zeigt im Vergleich Blindwerte, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.
Fig. 10 zeigt im Vergleich S/R-Verhältnisse, die mit Magnetteilchen und mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen erhalten werden.

BESTE ART UND WEISE DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung dieser Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von makromolekularen Teilchen
In ein mit einem Rührer, einem Thermometer, einem Monomer-Tropftrichter, einem Rückflußkühler, einem Heizgerät und einem Stickstoffgas-Einlaß ausgerüstetes Polymerisationsgefäß wurden 230 Teile entionisiertes Wasser gegeben. Dann wurden bei 80ºC 1 Teil eines Monomergemischs (A), zusammengesetzt aus Styrol, 2-Ethylhexylacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat in den Verhältnissen 80/10/10, und 10 Teile einer 10% wäßrigen Ammoniumpersulfat-Lösung zugesetzt und dann wurden 99 Teile des gleichen wie oben erwähnten Monomergemischs (A) über einen Zeitraum von 3 Stunden zugetropft, woraufhin makromolekulare Teilchen erhalten wurden. Elektronenmikroskopie ergab, daß diese Teilchen praktisch in monodispersem Zustand vorlagen und eine Teilchengröße von 0,3 um hatten.

Beispiel 2

Herstellung von Magnetteilchen

In einen mit einem Rührer, einem Thermometer, einer Oxidationsmittel-Lösung, einem Tropftrichter, einem Heizgerät und einer Stickstoffgas-Einlaßröhre ausgerüsteten Apparat zur Bildung von magnetischem Material wurden 100 Teile der wie oben erwähnt erhaltenen Emulsion organischer Polymermaterial-Teilchen (Feststoff-Gehalt: 30%) gegeben. Stickstoffgas wurde zugeführt, um die Kernemulsion von Sauerstoff zu befreien.
Dann wurden 100 Teile einer Eisen(II)chlorid-Lösung (Feststoff-Gehalt: 40 Teile) und 150 Teile Ammoniumacetat (Feststoffgehalt: 75 Teile), die jeweils zuvor hergestellt worden waren, in den Apparat gegeben und der Inhalt wurde unter gründlichem Rühren auf 70ºC erwärmt. Danach wurde der pH mit wäßrigem Ammoniak auf 7,2 eingestellt, während das Rühren fortgesetzt wurde.
150 Teile einer Natriumnitrit-Lösung (Feststoff-Gehalt: 15 Teile) wurden der resultierenden Substanz über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde zugetropft. Während des Zutropfens wurde die flüssige Phase unter kontinuierlicher Stickstoffgas-Zufuhr und kontinuierlichem Rühren bei einer Temperatur von 70ºC und einem pH im Bereich von 7,0 bis 7,2 gehalten, um eine Fernt-Beschichtung auf der Oberfläche der Teilchen zu bilden. Nach etwa 20 Minuten wurde die Lösung abgekühlt und flitriert, und der Feststoff wurde wiederholt mit entionisiertem Wasser gewaschen. Ferrit-Magnetteilchen wurden so gewonnen.

Beispiel 3

Mit Säure behandelte Gelatine (0,4 g) mit einem isoelektrischen Punkt von pH 9 wurde in 20 ml warmem Wasser bei 40ºC gelöst und der pH der Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. Diese Mischlösung wurde in 15 ml 30 (Vol.-)% Ethylalkohol-Lösung, die zuvor auf 40ºC erwärmt worden war, gegossen, gefolgt von gründlichem Rühren. Dazu wurden 80 ul 10% Natriumhexametaphosphat-Lösung, 0,1 ml 10% Alkylsulfomaleat und 0,2 g der in Beispiel 2 hergestellten Magnetteilchen gegeben, gefolgt von gründlichem Rühren. Dann wurde der pH des Gemischs durch Zutropfen von 10 (Vol.-)% Essigsäure- Lösung auf 5,0 eingestellt, während das Gemisch bei 40ºC gehalten wurde. Glutaraldehyd (65 mg) wurde der so gebildeten Teilchendispersion zugesetzt, während letztere bei 4ºC gehalten wurde. Das resultierende Gemisch wurde gerührt und dann bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Dieses wurde mit 0,9% NaCl gewaschen und dann wurde daraus eine 10% Teilchendispersion mit 0,9% NaCl hergestellt. Ein entsprechendes Volumen einer 4 (Vol.- )% Formaldehyd-Lösung wurde zugesetzt und nach dem Dispergieren wurde das Gemisch bei 4ºC 1 Woche lang stehen gelassen. Eine Messung mit einem LA-500 Apparat ergab, daß die so erhaltenen, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen einen mittleren Durchmesser von 6,2 um aufwiesen.

Beispiel 4

Mit Säure behandelte Gelatine (0,4 g) mit einem isoelektrischen Punkt von pH 9 wurde in 10 ml warmem Wasser bei 40ºC gelöst und der pH der Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt. Dieser Lösung wurden 0,4 g in 10 ml auf 40ºC erwärmtem Wasser gelöstes Gummi arabicum zugesetzt, gefolgt von gründlichem Rühren. Diese Mischlösung wurde in 15 ml 30 (Vol.-)% Ethylalkohol-Lösung, die zuvor auf 40ºC erwärmt worden war, gegossen, gefolgt von gründlichem Rühren. Dieser wurden 80 ul 10% Natriumhexametaphosphat- Lösung, 0,1 ml 10% Alkylsulfomaleat und 0,2 g der in Beispiel 2 hergestellten Magnetteilchen zugesetzt, gefolgt von gründlichem Rühren. Dann wurde der pH des Gemischs durch Zutropfen von 10 (Vol.-)% Essigsäure-Lösung auf 5,0 eingestellt, während das Gemisch bei 40ºC gehalten wurde. Glutaraldehyd (65 mg) wurde der so gebildeten Teilchendispersion zugesetzt, während letztere bei 4ºC gehalten wurde. Das resultierende Gemisch wurde gut gerührt und dann bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Dieses wurde mit 0,9% NaCl gewaschen und dann wurde daraus eine 10% Teilchendispersion mit 0,9% NaCl hergestellt. Ein entsprechendes Volumen einer 4 (Vol.-)% Formaldehyd-Lösung wurde zugesetzt und nach erfolgter Dispergierung wurde das Gemisch 1 Woche lang bei 4ºC stehen gelassen. Eine Messung mit einem LA-500 Apparat ergab, daß die so erhaltenen, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen einen mittleren Durchmesser von 4,7 um aufwiesen.

Beispiel 5

Untersuchung zur Schwimmfähigkeit der Teilchen

Die in Beispiel 3 hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen, die in Beispiel 2 hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen (zum Vergleich) und Gelatine- Fernt-Teilchen mit in Gelatine dispergierten ferromagnetischen Teilchen (Japanische Patentveröffentlichung Kokoku Nr. 3-17 103) (zum Vergleich) wurden jeweils in einer Konzentration von 0,015% in 100 mM Tris-Hydrochlorid-150 mM NaCl-Puffer (pH 7,2), der 2% BSA(Rinderserumalbumin) enthielt, dispergiert. 1 ml einer jeden Dispersion wurde in eine Zelle eines Spektralphotometers (Hitachi) gegeben und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach 5 bis 40 Minuten wurde die Trübung des Überstands durch Messen der Extinktion bei einer Wellenlänge von 660 nm gemessen. Die so erhaltenen Daten zur relativen Trübung sind in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 6

Vergleich der Teilchen-Spezies hinsichtlich der magnetischen Abscheidbarkeit

Die in Beispiel 3 hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen, die in Beispiel 2 hergestellten Magnetteilchen (zum Vergleich) und Gelatine-Ferrit-Teilchen mit in Gelatine dispergierten ferromagnetischen Teilchen (Japanische Patentveröffentlichung Kokoku 3- 17103) (zum Vergleich) wurden jeweils in einer Konzentration von 0,015% in 100 mM Tris- Hydrochlorid-150 mM NaCl-Puffer (pH 7,2), der 2% BSA enthielt, dispergiert. 1 ml einer jeden Dispersion wurde in ein Reagenzglas gegeben und das Reagenzglas wurde mit einem Magnet mit einer magnetischen Feldstärke an der Oberfläche von 1000 Gauss in Kontakt gebracht. Nach 15 Sekunden bis 2 Minuten des Kontaktierens mit einem Magnet wurde die Trübung des Überstands durch Messen der Extinktion bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt. Die so erhaltenen relativen Trübungsdaten sind in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 7

Vergleich der Teilchen-Spezies hinsichtlich der Aggregationsneigung unter Trocknungsbedingungen

Eine 250 ul-Portion einer Dispersion (0,015%) der in Beispiel 2 hergestellten Magnetteilchen oder der in Beispiel 3 hergestellten, mit alkalischer Phosphatase gebundenen, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen wurde in eine Patrone gegeben und einer Magnetabscheidung unterzogen, indem die Patrone mit einem Magneten kontaktiert wurde, und der Überstand wurde entfernt. Weiter wurde durch Zugabe von 300 ul 0,9% NaCl gewaschen, gefolgt von einer Magnetabscheidung. Das Waschen wurde weiter zweimal mit 0,9% NaCl und dreimal mit destilliertem Wasser wiederholt. Die magnetisch abgeschiedenen Teilchen wurden bei Raumtemperatur 0 bis 30 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde das lumineszierende Substrat, AMPPD, zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC 5 Minuten lang fortschreiten gelassen. Unmittelbar danach wurde die Lumineszenz-Intensität unter Verwendung eines Luminometers (ALOKA) gemessen. Die so erhaltenen Verhältnisse zwischen Teilchentrocknungs-(Stand-)Zeit und Signalwert sind in Fig. 3 gezeigt. Eine Photographie der Dispergierung dieser Teilchen, die durch das lumineszierende Substat ergänzt und auf eine ELISA-Platte gelegt wurden, ist in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 8

Carboxylierung von Teilchen

Eine 100 mg Portion der in Beispiel 3 hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen wurde jeweils dreimal mit destilliertem Wasser, Wasser und destilliertem Wasser gewaschen, dann wurden 50 mg Glutarsäureanhydrid, suspendiert auf 5 Vol.-% in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, zugesetzt und die Reaktion wurde 10 Minuten lang fortschreiten gelassen. Danach wurden die Teilchen dreimal mit 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Teilchen werden als carboxylierte Teilchen bezeichnet.

Beispiel 9

Herstellung von an anti-AFP-Antikörper gebundenen carboxylierten Teilchen

Eine 25 mg Portion der in Beispiel 8 hergestellten carboxylierten Teilchen wurde in 2,5 ml 10 mM Phosphat-Puffer (pH 4, 5) dispergiert und 25 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids wurden der Dispersion zugesetzt. Nachdem man die Reaktion bei Raumtemperatur 20 Minuten lang fortschreiten gelassen hatte, wurde der Überstand entfernt, 2,5 ml einer anti- AFP-Antikörper-Lösung (1 mg/ml, 20 mM Phosphat-Puffer, pH 4, 5) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde mit einem Kopfüber-Mischer gerührt. Nach 2 Stunden wurden die Teilchen fünfmal mit einer 2% BSA-Lösung (0,1 M Tris-Hydrochlorid, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,5) gewaschen und dann in der gleichen BSA-Lösung dispergiert.

Beispiel 10

AFP-Assay unter Verwendung von an anti-AFP-Antikörper gebundenen carboxylierten Teilchen

In einer Patrone wurden 10 ul einer Probe, die 200 ng/ml AFP-Antigen enthielt, mit 250 ul der Dispersion der in Beispiel 9 hergestellten, an anti-AFP-Antikörper gebundenen carboxylierten Teilchen gemischt und die Reaktion wurde bei 37ºC 10 Minuten lang fortschreiten gelassen. Die Patrone wurde mit einem Magnet mit einem Magnetfeld an der Oberfläche mit einer Stärke von 3000 Gauss kontaktiert, um dadurch die Magnetabscheidung der Teilchen zu bewirken. Der Überstand wurde durch Dekantieren entfernt. 300 ul physiologischer Kochsalzlösung wurden den Teilchen zugesetzt und nach Rühren und Magnetabscheidung wurde der Überstand durch Dekantieren abgeschopft. Diese Vorgehensweise wurde dreimal wiederholt. Dann wurden die Teilchen mit 250 ul der Lösung an alkalische Phosphatase gebundener anti-AFP-Antikörper (FaN) (0,1 ug/ml, 0,1 M Tris-Hydrochlorid, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;) gemischt und die Reaktion wurde bei 37ºC 10 Minuten lang fortschreiten gelassen. Die Teilchen wurden durch Dekantieren unter Verwendung von physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Eine 200 ug/ml des lumineszierenden Substrats, AMPPD (0,1 M DEA-Hydrochlorid, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0), enthaltende Substrat-Lösung wurde der die wie oben behandelten Teilchen enthaltenden Patrone zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37ºC 5 Minuten lang fortschreiten gelassen. Danach wurde die Lumineszenz-Intensität unter Verwendung eines Luminometers (ALOKA) gemessen.
Die in Beispiel 2 hergestellten Magnetteilchen wurden getrennt aminosilaniert, dann carboxyliert und dann wurden anti-AFP-Antikörper an die Teilchen gebunden, welche dann zum Assay von AFP verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5, 6 und 7 gezeigt. Signalwerte sind in Fig. 5 angegeben, Blindwerte (Geräuschwerte) in Fig. 6 und SIR-Verhältnisse in Fig. 7.

Maleimidierung mit Gelatine beschichteter Magnetteilchen

Eine 20 mg Portion der in Beispiel 3 hergestellten, mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen wurde in 4 ml 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) dispergiert und 2 ml einer GMBS-Lösung (1 mg/ml, Ethanol) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde kopfüber gerührt. Nach einer Stunde wurden 2 ml der gleichen GMBS-Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde kopfüber gerührt. Nach einer Stunde wurden die Teilchen dreimal mit Ethanol und weitere dreimal mit 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) gewaschen.

Beispiel 12

Herstellung von an TP-Antigen gebundenen Teilchen

3,5 ug Iminothiolan wurden 350 ul Antigen-Lösung (300 ug/ml, 50 mM wäßriges Natriumhydrogencarbonat, pH 8,2) eines Treponema pallidum (TP) in Form einer Lösung zugesetzt. Nachdem man die Reaktion 30 Minuten lang bei 37ºC fortschreiten gelassen hatte, wurde der Puffer durch 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (1 mM EDTA·2 Na, pH 7,0) unter Verwendung von PD-10 (Pharmacia) ersetzt. In diesem Gemisch wurden 3,5 mg der in Beispiel 11 hergestellten maleimidierten Teilchen dispergiert. Nach 2-stündigem Rühren unter Verwendung eines Kopfüber-Mischers wurden die Teilchen dreimal mit 50 mM Natriumphosphat-Puffer (1 mM EDTA·2 Na, pH 7,0) und weitere dreimal mit einer 2% BSA-Lösung (50 mM Tris-Hydrochlorid, 0,15 M Natriumchlorid, 1 mM EDTA·2 Na, pH 7,2) gewaschen und dann in der gleichen 2% BSA-Lösung dispergiert, um eine an TP- Antigen gebundene Teilchendispersion zu ergeben.

Beispiel 13

Antikörper-Detektionsassay unter Verwendung von an TP-Antigen gebundenen Teilchen

In einer Patrone wurden 20 ul einer 10-fachen Verdünnung eines positiven Serums für anti- TP-Antikörper mit 350 ul der 0,01% Dispersion der an TP-Antigene gebundenen Teilchen, die in Beispiel 12 hergestellt wurde, gemischt und die Reaktion wurde bei 37ºC 10 Minuten lang fortschreiten gelassen. Die Patrone wurde mit einem Magnet mit einem Magnetfeld an der Oberfläche mit einer Stärke von 3000 Gauss zur Magnetabscheidung der Teilchen kontaktiert und der Überstand wurde durch Dekantieren abgeschopft. Dann wurden 300 ul physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und das Gemisch wurde gerührt. Die Patrone wurde in gleicher Weise wie oben erwähnt entwässert. Diese Vorgehensweise wurde dreimal wiederholt. Dann wurden 250 ul der Lösung eines an alkalische Phosphatase gebundenen anti-Human-Antikörpers (0,2 ug/ml, 50 mM Mes-Natriumsalz, pH 6,8) zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37ºC 10 Minuten lang fortschreiten gelassen. Die Patrone wurde dann in gleicher Weise wie oben erwähnt gewaschen. Der Teilchen enthaltenden Patrone wurden 200 ul einer 200 ug/ml des lumineszierenden Substrats AMPPD (0,1 M DEA-Hydrochlorid, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37ºC 5 Minuten lang fortschreiten gelassen. Danach wurde die Lumineszenz-Intensität unter Verwendung eines Luminometers (ALOKA) gemessen.
Der erhaltene Signalwert ist in Fig. 8 gezeigt, der Blindwert (Geräuschwert) in Fig. 9 und das S/R-Verhältnis in Fig. 10.

INDUSTRIELLE EINSETZBARKEIT

Die in Immunoassay-Verfahren gemäß dieser Erfindung zu verwendenden Magnetteilchen sind jeweils aus einem Kern, der im wesentlichen aus organischen polymeren Materialien besteht, einer Schicht aus magnetischem Material, welche den Kern überzieht, und Gelatine auf der Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material zusammengesetzt und sind deshalb im wesentlichen frei von Eisenmigration und deshalb gegenüber längeren Lagerungszeiträumen sehr beständig. Sie besitzen hervorragendes magnetisches Ansprechverhalten und erfahren kaum Selbstaggregation, so daß erwartet werden kann, daß sie den Anforderungen der schnellen B/F-Trennung und des schnellen Waschens in zufriedenstellender Weise entsprechen. Deshalb kann das Verfahren dieser Erfindung geräuscharme, signalstarke Assay-Ergebnisse liefern.

Claims

1. Mit Gelatine beschichtetes Magnetteilchen, welches einen Kern, der ein organisches Polymermaterial umfaßt, eine Schicht aus magnetischem Material, welche die Oberfläche des Kerns überzieht, und eine Gelatineschicht, welche die Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material überzieht, umfaßt, wobei das Teilchen einen Durchmesser von 1,0 bis 10 um aufweist.

2. Mit Gelatine beschichtetes Magnetteilchen nach Anspruch 1, wobei der Kern einen Durchmesser von 0,1 bis 5 um aufweist.

3. Mit Gelatine beschichtetes Magnetteilchen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das organische Polymermaterial mindestens einen aus Polystyrol, Polymethacrylsäureestern, Polyacrylsäureestern, Styrol-Methacrylsäureester- Copolymeren, Styrol-Acrylsäureester-Copolymeren, polymerisierten Silanen und organischen Silanen ausgewählten Vertreter umfaßt.

4. Immunoassay-Verfahren unter Verwendung von mit Gelatine beschichteten Magnetteilchen, die einen Kern, der ein organisches Polymermaterial umfaßt, eine Schicht aus magnetischem Material, welche die Oberfläche des Kerns überzieht, und eine Gelatineschicht, welche die Oberfläche der Schicht aus magnetischem Material überzieht, umfassen, wobei die Teilchen einen Durchmesser von 1,0 bis 10 um aufweisen.

5. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem der Kern einen Durchmesser von 0,1 bis 5 um aufweist.

6. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei welchem das organische Polymermaterial mindestens einen aus Polystyrol, Polymethacrylsäureestern, Polyacrylsäureestern, Styrol-Methacrylsäureester-Copolymeren, Styrol-Acrylsäureester-Copolymeren, polymerisierten Silanen und organischen Silanen ausgewählten Vertreter umfaßt.

7. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, bei welchem markierte Antigene oder Antikörper verwendet werden.