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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft analytische
Elemente, Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Verwendung, um
einen Analyten nachzuweisen, unter Verwendung von Peroxidase oder
einem Peroxidase-markierten spezifischen Bindungsreagenz. Insbesondere
betrifft sie die Verringerung einer Beeinflussung durch Hämoglobin
beim Nachweis von solchen Analyten sowie die Verringerung der Beeinflussung
durch andere bekannte störende
Protein-Agentien.
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Hintergrund der Erfindung
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Es gibt einen kontinuierlichen Bedarf
in der medizinischen Praxis und Forschung und bei Analyse- und Diagnose-Prozeduren
für rasche
und genaue Bestimmungen chemischer und biologischer Substanzen,
die in verschiedenen Flüssigkeiten,
wie biologischen Flüssigkeiten
vorhanden sind. Zum Beispiel muß die
Anwesenheit von Proteinen, Hormonen, Arzneien, Viren, Mikroorganismen,
Narkotika und Steroiden für
eine wirksame Forschung, Diagnose und Behandlung genau und rasch
bestimmt werden.
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Eine große Vielzahl von analytischen
Verfahren ist in den jüngsten
Jahrzehnten entwickelt worden, um die genannten Substanzen nachzuweisen.
Die Verfahren sind sehr zuverlässig
geworden und in einigen Fällen zur
Automatisierung geeignet ebenso wie zur Verwendung in Kit-Form geeignet
geworden. Die meisten solcher Verfahren gründen darauf, was auf dem Gebiet
als "spezifische
Bindungsreaktionen" zwischen
einer nachzuweisenden Substanz (hierin als ein "spezifischer Bindungsligand" oder "Ligand" identifiziert) und
einem entsprechenden "Rezeptor" bekannt ist, der
spezifisch den Liganden erkennt und damit reagiert. Die meisten wohlbekannten
spezifischen Bindungsreaktionen finden zwischen immunreaktiven Mitteln
(in "Immunoassays"), wie etwa Antikörpern mit
Haptenen oder Antigenen statt, aber andere sind ebenso bekannt (wie
etwa Avidin mit Biotin und ein Zucker mit einem Lectin).
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Im allgemeinen können spezifische Bindungsassays
für eine
qualitative oder quantitative Bestimmung (oder beides) der Anwesenheit
oder Abwesenheit (oder Menge) eines interessie renden Analyten sorgen.
In einer Form von Assay, die als "kompetitiver Bindungs-Immunoassay" bekannt ist, wird
ein markiertes Analog des zu bestimmenden Liganden in Wettbewerb
mit einer festen Menge eines geeigneten Antikörpers gebracht, der mit sowohl
dem Liganden als auch dem Liganden-Analogen reagieren kann. Die
Markierung auf dem Analog kann in seiner "freien" oder komplexierten (das heißt umgesetzten)
Form in angemessener Weise nachgewiesen werden. Die Höhe des Signals
wird dann dem Benutzer Auskunft darüber geben, wie viel Ligand
in der zu testenden Probe ist.
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In einem alternativen Immunassay-Format,
bekannt als ein "Sandwich"-Immunassay oder
immunometrischen Assay, wird der Ligand mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen in Kontakt
gebracht, die an den Liganden an unterschiedlichen Epitopstellen
binden. Ein Rezeptor ist normalerweise in geeigneter Form markiert,
und der andere ist entweder auf einem festen Substrat immobilisiert
oder in der Lage, darauf immobilisiert zu werden. Die Menge an Ligand
ist direkt proportional zur Menge von zwischen dem Ligand und den
beiden Rezeptoren gebundenen Komplex.
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Immunoassays sind traditionellerweise
in Lösung
oder in Testvorrichtungen ausgeführt
worden, bei denen Flüssigkeiten
von den an dem Assay teilnehmenden Reagenzien in irgendeiner Weise
entfernt wurden. Trockenanalyseelemente und ihre Verwendung für Immunoassays
werden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben,
einschließlich
US-A-4,258,001 (Pierce
et al),
US-A-4,670,381 (Frickey et al),
WO
82/2601 (veröffentlicht
am 5. August 1992),
EP-A-0 051 183 (veröffentlicht
am 12. Mai 1982) und
EP-A-0 066 648 (veröffentlicht
am 15. Dezember 1982).
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Verbesserte Trockenanalyseelemente
und ihre Verwendung in Immunoassays werden beschrieben in
EP-A-0
587 222 , bei dem Enzymmarkierungen zum Nachweis verwendet
werden. Peroxidase ist die bevorzugte Enzymmarkierung. Solche Elemente
ermöglichen
den Nachweis von in sehr geringen Konzentrationen vorhandenen Analyten.
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Bei den Immunoassays, die in den
Trockenanalyse-Elementen unter Verwendung von Peroxidase als Markierung
durchgeführt
werden, können
die Ergebnisse durch das Vorhandensein von Materialien in Testproben
verändert
werden, die die Aktivität
des Enzyms beeinflussen. Diese störenden Effekte können durch
Einschluß von
Materialien in dem Assay-System überwunden
werden, die den Effekt der störenden
Agentien blockieren.
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WO 86/07462 (veröffentlicht
am 18. Dezember 1986) beschreibt die Verwendung von bestimmten modifizierten
Formen von Peroxidase, um den Effekt von störenden Agentien in Lösungsassays
zu verringern. Diese Formen schließen Apo-Peroxidase aus Meerrettich,
carboxymethylierte Meerrettich-Peroxidase und saure Formen von Meerrettich-Peroxidase
ein.
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Wenn jedoch Apo-Peroxidase aus Meerrettich
in einem Überschuß (100-facher Überschuß der Meerrettich-Peroxidase-Markierung)
zu beschichteten Elementen für
Immunoassays zugegeben wurde, um den Effekt von störenden Agentien
zu verringern, wurde eine signifikante Zunahme der Beeinflussung
durch Hämoglobin
beobachtet. Es wird geglaubt, daß dieser Effekt auf der Reaktivierung
der Apo-Peroxidase aus Meerrettich durch Hämoglobin beruhte. Da die Apo-Peroxidase
aus Meerrettich notwendigerweise in hohen Konzentrationen vorhanden
ist, erzeugt die Aktivierung dieses Materials ein beträchtliches
Signal und führt
zu großen Fehlern
in den Assays.
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Daher existiert ein Bedarf für ein Mittel,
um die Störung
bei beschichteten Immunoassays bei Verwendung einer Peroxidase als
Markierung zu reduzieren, ohne eine Beeinflussung der Resultate
durch Hämoglobin
in der Testprobe zu verursachen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die genannten Probleme sind durch
ein analytisches Element zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden
Probe gelöst
worden, umfassend eine poröse
Verteilungsschicht und enthaltend, unabhängig davon, in derselben oder
unterschiedlichen Schicht wie die poröse Verteilungsschicht,
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- a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches
Bindungsreagenz, und
- b) eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase,
so daß die
Apo-Peroxidase durch Hämoglobin
nicht reaktiviert werden kann.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ebenso ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden
Probe bereit, umfassend:
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A) In-Kontakt-Bringen einer flüssigen Probe,
von der angenommen wird, daß sie
einen spezifischen Bindungsliganden und Hämoglobin enthält, mit
einem analytischen Element, umfassend:
Eine poröse Verteilungsschicht,
und
eine oder mehrere zusätzliche
Schichten, die in flüssigem
Kontakt mit der porösen
Verteilungsschicht sind,
wobei das Element in wenigstens einer
der Schichten enthält:
ein
Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder
den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet,
oder
ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch
an entweder den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor
dafür bindet,
und
wobei das Element weiterhin enthält, unabhängig, in wenigstens einer der
Schichten,
eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende
Apo-Peroxidase, so daß die
Apo-Peroxidase durch Hämoglobin
nicht reaktiviert werden kann,
um eine Trennung der nicht-umgesetzten
Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels von der umgesetzten
Form des Peroxidase-markierten immunrekativen Mittels zu erreichen,
und
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B) Nachweisen von entweder der nicht-umgesetzten
oder der umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven
Mittels als ein Maß für den interessierenden
spezifischen Bindungsliganden.
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Weiterhin umfaßt eine analytische Zusammensetzung
dieser Erfindung:
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- a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches
Bindungsreagenz,
- b) eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase,
so daß die
Apo-Peroxidase nicht durch
Hämoglobin
reaktiviert werden kann,
- c) ein oder mehrere Reagenzien, die dahingehend reagieren, ein
kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit
einer Peroxidase bereitzustellen, und
- d) ein Phenol- oder Anilin-Coreagenz für c).
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein genaues Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung
einer Peroxidase oder eines Peroxidase-markierten spezifischen Bindungsreagenz
bereit. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft, wenn ein trockenanalytisches
Element bei dem Assay verwendet wird. Die Wirkungen von bekannten
störenden
Agentien auf Peroxidase-Markierungen werden, wie erwartet, minimiert
und eine Beeinflussung aufgrund der Anwesenheit von Hämoglobin
wird in unerwarteter Weise vermieden.
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Diese Vorteile werden erzielt durch
Verwendung einer Form von Apo-Peroxidase in dem Assay, die modifiziert
worden ist, um die Histidin-Aminosäuren des Proteins zu blockieren,
so daß das
Enzym nicht durch Hämoglobin
reaktiviert werden kann. Die Blockierung kann durch Substitution
an wenigstens einem der Stickstoffatome der Histidin-Imidazolyl-Gruppen
erreicht werden, wie in größeren Einzelheiten
unten beschrieben.
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Die modifizierte Apo-Peroxidase bleibt
wirksam, um die störenden
Effekte durch andere häufige
störende
Protein-Agentien im Serum zu verringern. Der Stand der Technik lehrt,
daß nicht-modifizierte
Apo-Peroxidase in gleicher Weise nützlich sein sollte, wie modifizierte
Formen des Enzyms, wie etwa carboxymethylierte Peroxidase, um die
störenden
Agentien in Lösungsassays
zu entfernen. Jedoch verursacht die nicht-modifizierte Apo-Peroxidase
in dem Trockenassay-Format eine zusätzliche Beeinflussung in dem
Assay, die aus der Anwesenheit von Hämoglobin resultiert. Die vorliegende
Erfindung behandelt dieses Problem und stellt eine weitere Verbesserung
bereit.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1 ist
eine graphische Darstellung von Assay-Daten (Beeinflussung gegen
Beschichtungskonzentrationen), die unter Verwendung von verschiedenen
analytischen Elementen aus drei Patientenproben erhalten wurden,
wie im Detail in Beispiel 3 unten beschrieben ist.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft
in jedem analytischen Verfahren ausgeübt werden, das darauf angelegt
ist, ein kolorimetrisches, fluorometrisches oder chemilumineszierendes
Signal in Antwort auf die Anwesenheit von Peroxidase zu erzeugen.
Solche Assays können
den Nachweis eines organischen oder anorganischen Peroxids (wie
etwa Wasserstoffper oxid) oder Peroxidase (in ihrer freien Form)
oder den Nachweis eines nicht-immunologischen Analyten, der nicht
Peroxidase ist, unter Verwendung von Reaktions-Schemata beinhalten,
die die Reaktion von Peroxidase einbeziehen. In bevorzugten Ausführungsformen
betrifft die Erfindung die Ausübung
spezifischer Bindungsassays.
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Der Assay kann qualitativ, quantitativ
oder semi-quantitativ sein, um einen oder mehrere Analyten aus einer
großen
Vielzahl von Analyten in wäßrigen Flüssigkeiten,
wie etwa menschlichen und tierischen biologischen Flüssigkeiten,
Abwasserflüssigkeiten,
Nahrungsmitteln, Abwasser, chemischen Verarbeitungsflüssigkeiten
und anderen Proben nachzuweisen, die für einen Fachmann offensichtlich
sind. Biologische Flüssigkeiten,
wie etwa menschliches oder tierisches Serum, Plasma oder Urin, werden
bevorzugt mit dieser Erfindung getestet.
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Wasserstoffperoxid (oder ein anderes
Peroxid) kann mit dieser Erfindung ebenso bestimmt werden, wie Analyten,
die in der Lage sind, Peroxid zu erzeugen. Das heißt, der
Analyt kann in der Lage sein, an einer oder mehreren Reaktionen
teilzunehmen, die Wasserstoffperoxid erzeugen, das dann nachgewiesen
wird unter Verwendung von geeigneten Signalerzeugenden Reagenzien
und einer Peroxidase.
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Die vorliegende Erfindung ist besonders
vorteilhaft bei Assays, bei denen die Peroxidase in einer geschwindigkeitsbestimmenden
Weise verwendet wird. In den meisten Fällen sind solche Assays spezifische Bindungsassays,
bei denen die Peroxidase als eine Markierung von einem der immunreaktiven
Mittel verwendet wird, die benötigt
werden, um einen spezifischen Bindungsliganden nachzuweisen. Jedoch
würde ein
geschickter klinischer Chemiker in leichter Weise verstehen, daß es ebenso
Assays für
Metaboliten, Enzyme oder andere nichtimmunreaktive Analyten gibt,
bei denen Peroxidase ebenso in einer geschwindigkeitsbestimmenden
Weise verwendet wird. Deshalb soll die vorliegende Erfindung nicht
auf spezifische Bindungsassays beschränkt sein.
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Analytische Zusammensetzungen dieser
Erfindung, die bei Lösungsassays
nützlich
sind, können
eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz,
eine modifizierte Apo-Peroxidase (unten definiert), ein oder mehrere
Reagenzien zum Erzeugen eines Signals (unten definiert), und fakultativ ein
Phenol- oder Anilin-"Coreagenz" für diese
Signalerzeugenden Reagenzien enthalten.
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Coreagenzien, die auf diese Weise
verwendet werden können,
schließen
Verbindungen ein, die in verschiedener Weise als "Elektronentransfermittel" zum Erzeugen von
Farbsignalen, wie etwa die Phenole und Aniline, die zum Beispiel
in
US-A-4,828,983 (McClune) beschrieben sind, und
als "Verstärker" zum Erzeugen von
chemilumineszierenden Signalen bekannt sind, wie beschrieben zum
Beispiel in
US-A-4,729,950 (Kricka et al) und
US-A-4,598,044 (Kricka
et al). Andere nützliche
Coreagenzien werden in
EP-A-0 603 954 beschrieben.
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Drei bevorzugte Coreagenzien sind
4'-Hydroxyacetanilid,
3'-Chlor-4-hydroxyacetanilid
und 3',5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid.
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In den beschriebenen analytischen
Zusammensetzungen können
die Peroxidase oder das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz
und Signal-erzeugende Reagenzien in jeder geeigneten Konzentration
vorhanden sein, die für
den Fachmann offensichtlich sein würde. Die modifizierte Apo-Peroxidase
ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 10-9 bis
ungefähr
10-3 vorhanden, wobei 10-7 bis
ungefähr
10-5 bevorzugt wird. Das Phenol- oder Anilin-Coreagenz
kann in einer Menge von ungefähr
0,001 bis ungefähr
150 mmolar vorhanden sein, wobei ungefähr 0,01 bis ungefähr 50 mmolar
bevorzugt ist. Es wäre
einem Fachmann in leichter Weise offensichtlich, wie in einer gegebenen
Zusammensetzung für
einen gegebenen Analyten die verschiedenen Mengen eingestellt werden
müßten.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Element und ein Verfahren zum
Nachweisen von spezifischen Ziel-Bindungsliganden (hiernach als
Liganden identifiziert), für
die Rezeptormoleküle
erhältlich
oder herstellbar sind. Beispiele für Ligand-Rezeptor-Komplexe (d. h. ein Reaktionsprodukt
von Ligand und dem entsprechenden Rezeptor) schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf Antikörper-Antigen,
Antikörper-Hapten,
Avidin-Biotin, Zucker-Lectin, Gelatine-Fibronectin und Protein-A-IgG-Komplexe.
Für die
Zwecke dieser Erfindung werden komplementäre Nukleinsäuren (d. h. hybridisierte Produkte
von komplementären
Strängen)
ebenso als Ligand-Rezeptor-Komplexe angesehen.
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Liganden schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf
Peptide, Polypeptide, Proteine (einschließlich Enzymen, Antikörpern, immunogenen
Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen und Avidin), Hormone (wie etwa
Thyroxin, Triiodthyronin, menschliches Choriongonadotropin, Östrogen,
ACTH und Substanz P), Vitamine, menschliche Immunsystem-Modulatoren (wie
etwa Interleukin-6), Steroide, Kohlenhydrate (wie etwa Polysaccharide),
Glycolipide, Arzneien (wie etwa Digoxin, Phenytoin, Phenobarbital,
Morphin, Carbamazepin und Theophyllin), Antibiotika (wie etwa Gentamicin),
Bestandteile von Zellen und Viren (wie etwa Streptococcus-Spezies,
Herpes-Viren, Gonococcus-Spezies, Chlamydien-Spezies, Retroviren,
Influenza-Viren, Prevotella-Spezies, Porphyromonas-Spezies, Actinobacillus-Spezies
und Mycobacterium-Spezies), Nukleinsäuren (einschließlich einzel-
und doppelsträngiger
Oligonukleotide), Pharmazeutika, Haptene, Lectine, Biotin und andere
Materialien, die Fachleuten in leichter Weise offensichtlich sind.
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Jedoch ist diese Erfindung besonders
vorteilhaft für
die Verwendung von Trockenanalyse-Elementen, um Analyte nachzuweisen,
bei denen das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz in
dem Element in geschwindigkeitsbestimmenden Mengen vorliegt.
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In den bevorzugten spezifischen Bindungsassays
schließen
Analyten, die so in Lösung
oder Trocken-Formaten unter Verwendung von Peroxidase als einem
geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionsteilnehmer bestimmt werden
können
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Diphenylhydantoin (oder Phenytoin), Carbamazepin, Phenobarbital,
C-reaktives Protein, Digoxin, ein Thyroninderivat (wie etwa Thyroxin
und Triiodothrtonin), Morphin, Theophyllin, Gentamicin, Vancomycin,
Tobramycin, TSH, hCG, verschiedene Proteine (wie etwa IgM-, IgG-,
IgE- und IgA-Proteine), Creatinkinase-MB, Troponine T und I und
Apoproteine A, A1 und B. Die verschiedenen anderen Reagenzien, die
zum Nachweis des Analyten in solchen Assays benötigt würden, liegen innerhalb des
Geschicksk d es normalen klinischen Chemikers. Daher würden zum
Beispiel ein oder mehrere herkömmliche
Reagenzien zusammen mit Peroxidase verwendet werden, um ein kolorimetrisches,
fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Signal nach einer oder
mehreren Reaktionen zu erzeugen.
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Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Antikörper" ganze Immunglobulin-Moleküle mit einer
einzelnen Spezifität
ein, wie es auf dem Gebiet herkömmlich
ist. Zusätzlich
soll der Begriff chemisch erzeugte Fragmente (wie etwa Fab, F(ab)', F(ab)2-Fragmente)
von solchen Molekülen
und genetisch erzeugte Äquivalente davon
(wie etwa "Einzelketten-Antikörper-Fragmente" oder ScFv-Fragmente)
einschließen.
Die Antikörper können monoklonal
oder polyklonal sein.
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Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt
durchgeführt
unter Verwendung eines analytischen Elements, umfassend eine poröse Verteilungsschicht
(gewöhnlich
eine aufgetragene Schicht), die eine geeignete Porösität zum Unterbringen
einer Testprobe, verdünnt
oder unverdünnt,
hat. Bevorzugt ist die poröse
Verteilungsschicht isotropisch porös, was bedeutet, daß sie in
jeder Dimension in gleicher Weise porös ist, so daß sich Flüssigkeiten
in jeder Dimension einförmig
verteilen, wie es durch miteinander verbundene Fasern, Partikeln
und anderen Bestandteilen der Schicht ermöglicht wird. Materialien, die
zum Herstellen von solchen Elementen nützlich sind, sind wohl bekannt.
Die porösen
Schichten können
aus Cellulose-, Glas- oder
polymeren Fasern, polymeren oder anorganischen partikulären Materialien
oder einer Kombination von solchen Materialien zusammengesetzt sein.
Details über
herkömmliche
Verteilungsschichten werden zum Beispiel in
US-A-3,992,158 (Przybylowicz
et al),
US-A- 4,258,001 (Pierce
et al),
US-A-4,292,272 (Kitajima et al) und
US-A-4,430,436 (Koyama
et al) bereitgestellt. Die bevorzugten porösen Verteilungsschichten sind
Verteilungsschichten mit Kügelchen
("beaded spreading
layers"), wobei
die Verteilungsschichten aus polymeren Partikeln und einem polymeren
Klebstoff hergestellt sind, wie in dem Patent von Pierce et al beschrieben.
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Das Element kann zusätzliche
Schichten neben den porösen
Verteilungsschichten enthalten, solange wie alle Schichten in flüssigem Kontakt
stehen, was bedeutet, daß sich
Flüssigkeiten
in leichter Weise von einer Schicht zu einer anderen Schicht bewegen
können,
sogar wenn solche Reagenzien sich nicht in leichter Weise von einer
Schicht zu einer anderen bewegen. Solche zusätzliche Schichten sind gewöhnlich aufgetragene
Schichten von verschiedenen Bindematerialien und einem oder mehreren
Reagenzien, die in dem Assay nützlich
sind, und schließen
ein, was in dem Gebiet als Unterschicht ("subbing layer"), Reagenzschicht, Aufzeichnungsschicht
und Strahlungsblockierschicht ("radiation
blocking layer")
bekannt ist. Materialien, die als Bindemittel in solchen Schichten
nützlich
sind, sind wohlbekannt, wie in den in dem vorhergehenden Absatz aufgeführten Patenten
beschrieben, und schließen
bevorzugt Gelatine (gehärtet
oder ungehärtet),
hydrophile Acrylamid- und Vinylpyrrolidon-Polymere ein. Einige Schichte können wasserunlöslich sein,
während
andere wasserlöslich
oder wasser-quellbar sind, so daß sie sich während eines
Assays auflösen
oder aufquellen. Es ist ebenso wahrscheinlich, daß sich einige
Schichten während
des Auftragens miteinander vermischen, so daß horizontale Zonen in einer
einzelnen getrockneten Schicht aus unterschiedlichen Auftragungsformulierungen gebildet
werden.
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Die Schichten des Elements können selbsttragend
sein, bevorzugt sind sie aber auf einem geeigneten dimensionsstabilen,
nicht-porösen,
chemisch-inerten Träger
angeordnet. Nützliche
Trägermaterialien
schließen polymere Filme, Metallfolien, Papier und andere
auf dem Gebiet wohlbekannte Materialien ein. Ein transparenter Polyesterträger wird
bevorzugt.
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Die Peroxidase oder das Peroxidase-markierte
spezifische Bindungsreagenz, das bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist in einer oder mehreren Schichten des Elements
eingeschlossen. Dieses Reagenz ist in der Lage, an entweder den
spezifischen interessierenden Bindungsliganden oder seinen entsprechenden
Rezeptor zu binden. Bei kompetitiven Bindungsimmunoassays ist das
markierte Regenz gewöhnlich
ein markiertes Analog des spezifischen Bindungsliganden (wie etwa
markierte Haptenderivate des Liganden). In Sandwich-Assays kann
das markierte immunreaktive Mittel ein markierter Rezeptor für den Liganden
sein, oder es kann ein markiertes Molekül (wie etwa ein markierter
Anti-Antikörper)
sein, das an den Rezeptor (wie etwa einen Antikörper) bindet.
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Markierte spezifische BindungsReagenzien
können
unter Verwendung von einer Anzahl von bekannten Prozeduren hergestellt
werden, und viele solcher Reagenzien sind kommerziell erhältlich von
einer Anzahl von Quellen. Herstellungsprozeduren schließen diejenigen
ein, die von Yoshitake et al Eur.J.Biochem. 101, 395, 1979 und in
US-A-5,106,732 (Kondo
et al) beschrieben sind.
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Mit "Peroxidase" wird in dieser Anmeldung jede peroxidierende
Substanz (enzymatisch oder andersartig) gemeint, die die Oxidation
eines Substrats, wie etwa eines Leukofarbstoffs, in der Anwesenheit
von Wasserstoffperoxid oder einem anderen Oxidationsmittel katalysiert,
um ein geeignetes Signal zu erzeugen. Mikrobielle, Pilz- oder Pflanzen-Peroxidasen
werden bevorzugt, wobei Meerrettich-Peroxidase am bevorzugtesten ist.
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Die Menge an Peroxidase-markiertem
spezifischen Bindungsreagenz in einem Element dieser Erfindung kann
in breiter Weise variieren aufgrund der Menge der in der Reaktion
verwendeten anderen Bestandteile und der vermuteten Menge an Analyt
in der Testprobe. Im allgemeinen beträgt die in dem Element vorhandene
Menge wenigstens ungefähr
2 μg/m2, wobei ungefähr 4 bis ungefähr 25 μg/m2 bevorzugt wird.
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Das Peroxidase-markierte spezifische
Bindungsreagenz, das bei dieser Erfindung nützlich ist, ist bevorzugt ein
Peroxidase-markiertes Haptenderivat des Liganden oder ein Peroxidasemarkierter
Antikörper.
Jedoch kann ein Konjugat von Avidin oder einer anderen spezifischen
Bindungsverbindung mit Peroxidase ebenso bei der Ausübung dieser
Erfindung verwendet werden. Wenn die Markierung beispielsweise an
einem Hapten erfolgt, kann sie eine Peroxidase-markierte Arznei,
Hormon, Protein, Metabolit, Chelat oder Haptenderivat derselben
sein. Beispiele für
solche Materialien schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Peroxidasemarkierte Haptenderivate von Digoxin, Diphenylhydantoin,
Phenobarbital, C-reaktivem Protein, einem Thyroninderivat, wie etwa
Thyroxin, Carbamazepin oder einem anderen Analyten der oben beschrieben
ist.
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Ein wesentliches Reagenz, das bei
der Ausübung
dieser Erfindung verwendet wird, ist eine modifizierte Apo-Peroxidase.
Diese Proteine sind modifiziert worden, indem die Imidazolylgruppen
in den Histidin-Aminosäuremolekülen in der
Protein-Aminosäurenkette
blockiert worden sind, so daß die
Apo-Peroxidase durch Hämoglobin
nicht reaktiviert werden kann. Die Imidazolylgruppen werden an wenigstens
einem der Stickstoffatome des Rings durch Substitution mit einem
alkylierenden Reagenz, Kondensationsreagenz oder Additionsreagenz
blockiert, das in ausreichender Weise die Stereokonfiguration der
Histidin-Aminosäuren
zerstört,
um eine Wiederherstellung der Peroxidaseaktivität in dem Apo-Peroxidasemolekül zu verhindern,
aber die spezifische Immunizität
des Proteins nicht verändert.
Die Stickstoffatome werden durch das kovalente Anhängen einer
Alkyl-, Aryl-, Alkanoyl-, Aroyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-,
Alkylaminocarbonyl- oder Arylaminocarbonyl-Gruppe daran durch ein
geeignetes modifizierendes Additions-, Kondensations- oder Alkylierungsreagenz
blockiert.
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Beispiele für derlei nützliche modifizierenden Additionsreagenzien
schließen
aktive Halogenalkylierende Agenzien jeden Typs ein, wie etwa:
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- (1) Halogenmethylcarbonyl-Gruppen-enthaltende Verbindungen,
wie etwa Chloressigsäure
und ihre Amide und Ester, Iodessigsäure und ihre Amide und Ester,
und Bromessigsäure
und ihre Amide und Ester,
- (2) Halogenethylcarbonyl- und Halogenethylsulfonyl-Gruppen-enthaltende
Verbindungen, wie etwa 3-Chlorpropionsäure und ihre Ester, 3-Chlorpropiophenon
und 3-Chlorpropionamid,
- (3) Arylmethylhalogenide, wie etwa Benzylchlorid, 1-Chlormethyl-2-methylnaphthalen,
1-Chlormethylnaphthalen,
4-Chlormethylbiphenyl und 4-Chlormethylbenzoesäure, und
- (4) Säurehalogenide,
wie etwa Acetylchlorid, Propionylchlorid, Benzoylchlorid und Naphthoylchlorid.
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Andere nützliche modifizierende Reagenzien
schließen
Anhydride (wie etwa Essigsäureanhydrid, Phthalsäureanhydrid,
Diethylpyrocarbonat und Bernsteinsäureanhydrid), aktive Ester
(wie etwa N-Acetoxysuccinimid, N-Proprionyloxysuccinimid und andere,
wie beschrieben in
GB 2,064,800A ), Vinylsulfonyl-
und Vinylcarbonyl-Gruppen-enthaltende Verbindungen (wie etwa Vinylsulfonamid,
Natriumvinylsulfonat, Natriumacrylat, Natriummethacrylat, Ethylacrylat
und andere, die einem Fachmann in leichter Weise offensichtlich sind),
Isocyanate (wie etwa Butylisocyanat, p-Bromphenylisocyanat und Phenylisocyanat),
Aldehyde (wie etwa Benzaldehyd, Acetaldehyd und Propionaldehyd)
und Epoxide (wie etwa Glycidol) ein.
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Eine Technik zum Durchführen dieser
Modifizierung ist es, die Apo-Peroxidase mit Diethylpyrocarbonat
unter Verwendung einer im wesentlichen von Miles in Methods in Enzymology
47, Seiten 431-442 (1977) beschriebenen Prozedur umzusetzen. Spezifische
Details für
diese Prozedur werden in der Herstellung 1 unten bereitgestellt.
Das Resultat ist eine modifizierte Apo-Peroxidase, die die Histidin-Aminosäuren mit
Ethoxycarbonylgruppen substituiert hat.
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Eine alternative und bevorzugte Technik
umfaßt
das Carboxyalkylieren der Apo-Peroxidase unter Verwendung eines
geeigneten Reagenz, wie etwa Iodessigsäure, Chloressigsäure oder
Bromessigsäure.
Einzelheiten bezüglich
einer solchen Technik werden von Gurd in Methods in Enzymology,
11, Seiten 532-541 (1967) bereitgestellt. Zum Beispiel kann die
Apo-Peroxidase ein
carboxyalkyliertes Derivat sein (das heißt mit carboxyalkylierten Histidin-Aminosäuren), wie
unten in Herstellung 2 vor den Beispielen beschrieben.
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Die modifizierte Apo-Peroxidase ist
in dem Element dieser Erfindung in einer Menge von ungefähr 0,1 bis
ungefähr
100 mg/m2 vorhanden, und bevorzugt in einer
Beschichtung von ungefähr
0,5 bis ungefähr
20 mg/m2. Eine bevorzugte Beschichtung wird
in dem Beispiel unten gezeigt.
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Die Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes
spezifisches Bindungsreagenz und die modifizierte Apo-Peroxidase
sind, unabhängig,
in derselben oder unterschiedlichen Schichten des Elements dieser
Erfindung. Darüberhinaus
können
sie unabhängig
in der porösen
Verteilungsschicht oder in einer zusätzlichen Schicht des Elements
oder in unabhängigen
Zonen einer einzelnen Schicht (wie etwa der porösen Verteilungsschicht) sein.
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In einer Ausführungsform dieser Erfindung
umfaßt
ein Vielschicht-Analyse-Element zur Bestimmung eines interessierenden
spezifischen Bindungsliganden in einer Hämoglobinumfassenden Probe einen nicht-porösen Träger, der
darauf in Flüssigkontakt
hat:
Eine erste Reagenz- oder Pufferschicht,
eine Rezeptorschicht,
umfassend ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch
an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder
einen Rezeptor dafür
bindet,
eine poröse
Verteilungsschicht, enthaltend ein Reagenz, das ein kolorimetrisches
oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
und einer Peroxidase bereitstellt, und
an die poröse Verteilungsschicht
angrenzend, eine zweite Reagenzschicht, enthaltend:
ein Peroxidase-markiertes
immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den
interessierenden
spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet,
und
eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich, wie oben
definiert.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung umfaßt
ein Vielschicht-Analyse-Element
zur Bestimmung eines interessierenden spezifischen Bindungsliganden
in einer Hämoglobin-umfassenden
Probe einen nicht-porösen
Träger,
der darauf in Flüssigkontakt
hat:
Eine erste Reagenz- oder Pufferschicht, und
eine
poröse
Verteilungsschicht, enthaltend ein Reagenz, das ein kolorimetrisches
oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
und einer Peroxidase bereitstellt,
wobei die poröse Verteilungsschicht
vielfache Zonen hat, einschließlich
einer
ersten Zone, enthaltend ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel,
das spezifisch an entweder an den interessierenden spezifischen
Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und
einer zweiten
Zone, die ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel enthält, das
spezifisch an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden
oder einen Rezeptor dafür
bindet, und eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich, wie
oben definiert.
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Bei diesem Element können die
Zonen der porösen
Verteilungsschicht horizontale oder vertikale Regionen der Schicht
sein. Bevorzugt sind sie horizontale Zonen, die durch separate Beschichtungen
erzeugt worden sind, welche vor oder nach dem Aufbringen der porösen Verteilungsschicht-Bestandteile
aufgetragen worden sind. Während
des Beschichtungsprozesses, um das Element herzustellen, können sich
die separaten Beschichtungen (zum Beispiel die Formulierungen, die
für getrennte
zweite Reagenz- und Rezeptorschichten verwendet werden) in der porösen Verteilungsschicht
auflösen,
wodurch sie eine einzelne getrocknete Schicht mit vielfachen Zonen
bilden. Eine Technik hierfür
mittels Gravur-Beschichtungstechnologie wird in größerem Detail
in
EP-A-0 517 338 beschrieben.
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In noch einer weiteren Ausführungsform
ist das Element dem bevorzugten Element ähnlich, aber das nicht-markierte
immunreaktive Mittel, Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel
und die modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich sind durch die
gesamte poröse
Verteilungsschicht verteilt.
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Das Element dieser Erfindung kann
ebenso ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel enthalten, das in
der Lage ist, mit entweder dem interessierenden spezifischen Bindungsliganden
oder seinem Rezeptor zu reagieren. Bei kompetitiven Bindungsimmunoassays
ist dieses immunreaktive Mittel im allgemeinen ein Rezeptor (wie
etwa ein Antikörper)
für den
Ligand. Bei Sandwich-Immunoassays kann das nicht-markierte immunreaktive
Mittel ein Rezeptor für
den Ligand oder ein Bindungsmolekül sein, das mit dem Rezeptor
reaktiv ist (wie etwa ein Anti-Antikörper). In bevorzugten Ausführungsformen
ist das immunreaktive Mittel ein für den Ligand spezifischer Antikörper.
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Das nicht-markierte immunreaktive
Mittel und das Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel werden im
allgemein in irgendeiner Weise in dem Element getrennt gehalten,
bis der Assay begonnen hat. Sie können voneinander getrennt sein,
indem man sie in unterschiedliche Schichten des Elements unterbringt,
oder sie können
in derselben Schicht sein, aber ein Bestandteil ist innerhalb eines
Materials eingekapselt, das den Bestandteil freisetzt, wenn der
Assay begonnen wurde, oder sie können
sich in separaten Zonen derselben Schicht befinden.
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Es wird ebenso bevorzugt, daß die nicht-markierten
immunreaktiven Mittel auf geeigneten Partikeln immobilisiert sind,
die in einer Schicht insgesamt des Elements dispergiert sind. Solche
Partikel können
aus jedem geeigneten Material zusammengesetzt sein, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Glas, Eisenoxide, Keramik, organische synthetische oder natürlich vorkommende
Polymere, und haben eine durchschnittliche Partikelgröße von ungefähr 0,01
bis 10 μm.
Bevorzugt werden die Partikel aus synthetischen Polymeren hergestellt
und haben geeignete Oberflächengruppen
für die
Adsorption oder kovalentes Anhängen
der Moleküle des
immunreaktiven Mittels. Eine große Vielzahl von solchen Materialien
sind auf dem Gebiet bekannt, wie diejenigen, die in
US-A-4,828,978 (Warren
III et al),
US-A-4,997,772 (Sutton et al),
US-A-5,147,777 (Sutton
et al),
US-A-5,177,023 (Sutton et al) beschrieben
sind.
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Besonders nützliche polymere Partikel sind
diejenigen, die aus ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren
Monomeren mit reaktiven Carboxy, 2-substituierten Ethylsulfonyl-
oder Vinylsulfonyl-Gruppen hergestellt sind, wie in den im vorhergehenden
Absatz aufgeführten
Patenten beschrieben.
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Bei der Verwendung von Peroxidase
als die Markierung bei dem Verfahren dieser Erfindung gibt es einen
Bedarf, das Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel in Kontakt
mit Wasserstoffperoxid oder einem ähnlichen Oxidationsmittel und
den geeigneten Reagenzien zu bringen, um ein kolorimetrisches oder
chemilumineszierendes Signal zu erzeugen. Nützliche Reagenzien zum Bereitstellen
eines kolorimetrischen Signals schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf
Imidazol- oder Triarylmethan-Leukofarbstoffe, wie etwa diejenigen,
die in
US-A-4,089,747 (Bruschi) und den darin aufgeführten Angaben,
US-A-4,670,385 (Babb
et al),
EP-A-0 122 641 (veröffentlicht am 24. Oktober 1984)
und der japanischen Patentanmeldung
58(1983)-045557 beschrieben
sind. Andere nützliche
Reagenzien wären
einem Fachmann im Hinblick auf die beträchtliche Menge an Literatur
auf diesem Gebiet in leichter Weise offensichtlich. Die Triarylimidazol-Leukofarbstoffe
des oben aufgeführten
Bruschi-Patents werden bei der Ausübung dieser Erfindung bevorzugt.
Solche Leukofarbstoffe sind entweder kommerziell erhältlich oder
unter Verwendung von bekannten Prozeduren und Ausgangsmaterialien
in leichter Weise herzustellen.
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Diazonium- und Tetrazoliumsalze sind
ebenso nützlich,
solange sie einen Chromophor in der Anwesenheit von Peroxidase und
einem Oxidationsmittel bereitstellen können. Ein Diazoniumsalz ist
im allgemeinen ein organisches Salz einer Verbindung mit einem Diazoniumradikal.
Tetrazoliumsalze sind organische Salze, bei denen der organische
Teil ein oder zwei Tetrazolringe enthält, die im allgemeinen Arylsubstituenten
an verschiedenen Positionen haben.
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Viele nützliche Diazonium- und Tetrazoliumverbindungen
werden zum Beispiel in
US-A- 3,905,872 (Forgione),
US-A-4,772,553 (Fujii
et al),
US-A-4,892,817 (Pawlak) und
US-A- 4,892,833 (Weiss
et al) beschrieben, von denen einige aus kommerziellen Quellen erhältlich sind
oder unter Verwendung von bekannten Prozeduren und Ausgangsmaterialien
leicht herzustellen sind.
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Chemilumineszierende Signale können unter
Verwendung einer Vielzahl von bekannten Reagenzien erzeugt werden.
Ein bevorzugtes chemilumineszierendes Signal-erzeugendes Reagenz
ist ein 2,3-Dihydro-l,4-phthalazindionderivat (hierin identifiziert
als "DPD"). Jedes freie oder
konjugierte DPD, das in einen angeregten Zustand in einer chemilumineszierenden
Reaktion umgewandelt werden kann und bei der Rückkehr zu einem nicht-angeregten
Zustand Licht emittiert, ist bei der Ausübung dieser Erfindung nützlich.
Eine beträchtliche
Anzahl von solchen Verbindungen sind auf dem Gebiet bekannt, einschließlich denjenigen,
die in
US-A- 4,598,044 (Kricka
et al) und Chemiluminescence in Organic Chemistry, Gundermann und
McCapra, Springer-Verlag, Berlin, 1987, Seiten 204-207 beschrieben
sind. Solche Verbindungen sind im allgemeinen als "Hydrazide vom Luminoltyp" bekannt und schließen Phthalsäurehydrazide,
Naphthalen-l,2-dicarbonsäurehydrazide,
Anthracen-2,3-Dicarbonsäurehydrazide,
Phenanthren-l,2-dicarbonsäurehydrazide,
Fluoren-l,2-dicarbonsäurehydrazide,
Benzo[g,h,i]perylen-l,2-dicarbonsäurehydrazide, Coronen-l,2-dicarbonsäurehydrazide und
andere ein, die Fachleuten leicht offensichtlich sind. Luminol ist
ein bevorzugtes chemilumineszierendes Signal-erzeugendes Reagenz.
Verschiedene Phenole und Aniline werden als Verstärker mit
DPD-Verbindungen verwendet.
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Die Elemente dieser Erfindung können ebenso
eine Vielzahl von Zusatzstoffen enthalten, die für solche Elemente häufig sind,
um bei der Herstellung, der Verteilung der Flüssigkeit, der Absorption unerwünschter Strahlung
und der Rezeptorstabilität
zu helfen.
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Das Element kann unter Verwendung
von herkömmlichen
Beschichtungsprozeduren und ausrüstung hergestellt
werden, die in umfangreichem Stand der Technik beschrieben sind
(einschließlich
Gravur-, Gießlackier-
("curtain techniques"), Trichter- ("hopper techniques") und anderen Beschichtungstechniken).
Die Elemente können
in einer Vielzahl von Gestaltungen und Formen konfiguriert sein,
einschließlich
verlängerter Bänder jeder
beliebigen Breite, Blätter,
Plättchen
oder Chips.
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Darüberhinaus kann das Verfahren
dieser Erfindung manuell oder automatisiert sein, unter Verwendung
von geeignetem analytischen Gerät
und -Prozeduren. Im allgemeinen beinhaltet das Verfahren das In-Kontakt-Bringen
der Reagenzien in dem Element durch Aufträufeln einer Testprobe (z. B.
1 bis 200 μl)
auf die poröse
Verteilungsschicht ein. Die Bewegung der Flüssigkeit innerhalb des Elements
mischt im Ergebnis die Reagenzien, so daß die Reaktionen stattfinden
können.
Nach der Probenauftragung wird das Element einer Bedingung ausgesetzt,
wie etwa Inkubation, Heizen oder einer anderen Prozedur, die wünschenswert
sein kann, um die Reaktionen im Element zu beschleunigen oder anderweitig
zu erleichtern (sowie jegliche spezifische Bindungskomplexe in den
Immunoassays).
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Für
die Immunoassays kann in einigen Fällen ein geeignetes Signal
für ein
quantitatives Ergebnis erhalten werden, ohne eine effektive Trennung
der umgesetzten (gebundenen) und nicht-umgesetzten (ungebundenen)
Formen des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels. Jedoch
wird bevorzugt, daß die
Formen innerhalb einer Zone des Elements getrennt werden, wie es
typisch in solchen Tests ist, die als heterogene Immunoassays bekannt
sind. Daher kann ein Signal in einer definierten Region der Zone
bewertet werden.
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Das Aufbringen einer Substratlösung (zum
Beispiel 5 bis 200 μl)
auf die Zone des Elements ist das bevorzugte Verfahren zum Beeinflussen
dieser Trennung und zum Erhalt des geeigneten Signals. Jede erwünschte Rate
und Weise der Aufbringung der Substratlösung kann verwendet werden.
Diese Lösung
kann ein Substrat für
die Peroxidase oder andere Signalerzeugende Reagenzien enthalten,
oder nur eine gepufferte Waschlösung
sein. Wenn die bevorzugten Leukofarbstoffe (oben beschrieben) oder
die Verbindungen vom Luminoltyp im Element verwendet werden, enthält die Substratlösung bevorzugt
einen phenolischen Signalverstärker
oder ein Elektronentransfermittel, von denen viele auf dem Gebiet
bekannt sind. Eine bevorzugte Verbindung ist 4'-Hydroxyacetanilid. Die Menge der Reagenzien
in der Substratlösung
dürfte
Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sein.
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Die folgenden Beispiele erläutern die
Erfindung und sollen nicht als beschränkend aufgefaßt werden. Alle
prozentualen Angaben sind in Gewicht, sofern nichts anderweitig
angezeigt.
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Materialien und Verfahren
für die
Beispiele:
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Herstellung 1:
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Eine modifizierte Apo-Peroxidase
aus Meerrettich wurde hergestellt durch Auflösen von Apo-Peroxidase (1,1
g) aus Meerrettich in Wasser (7 ml), Diethylpyrocarbonat (0,94 g)
wurde unter Rühren
zugegeben, und die resultierende Mischung wurde unter Mischen bei
24°C für 2 Stunden
inkubiert. Die Inkubation wurde unter Rühren bei 4°C für 18 weitere Stunden fortgesetzt.
Die resultierende Produktmischung (21,5 ml) wurde gegen zwei Austausche
an Phosphatpuffer (3 Liter, 10 mmolar, pH 7) dialysiert. Die dialysierte
Mischung enthielt eine Apo-Peroxidase
(40 mg/ml) aus Meerrettich mit Ethoxycarbonylgruppen an den Imidazolylgruppen der
Histidin-Aminosäuren.
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Herstellung 2:
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Eine alternative modifizierte Apo-Peroxidase
aus Meerrettich wurde hergestellt durch Zugeben von Apo-Peroxidase
(3%) aus Meerrettich zu einer gepufferten Lösung von Iodessigsäure (3%,
pH 5,5) und bei 24°C
für 24
Stunden gemischt. Die resultierende Produktlösung wurde gegen zwei Austausche
von Wasser (3 Liter) bei 24°C
für 24
Stunden dialysiert. Die Analyse der dialsysierten Mischung bestätigte das
Vorhandensein von Apo-Peroxidase aus Meerrettich mit Imidazolylgruppen,
die mit Carboxymethylgruppen substituiert waren, bei einer Ausbeute
von ungefähr
85%.
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Herstellung von Konjugat
von Digoxin und Peroxidase:
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Das bei den Elementen verwendete
Peroxidase-markierte Digoxin-Analog wurde mit den Prozeduren und
mittels Reagenzien hergestellt, die in
EP-A-0 468 590 und
EP-A-0
468 591 beschrieben sind.
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Herstellung von Konjugat
aus Diphenylhydantoin und Peroxidase:
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Ein wasserlösliches Konjugat eines Diphenylhydantoin-Haptens
und Amin-angereicherter Meerrettich-Peroxidase wurde wie folgt hergestellt.
Diese Herstellung ist nur beispielhaft. Alternative Herstellungsverfahren
existieren ebenso.
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Das Hapten, 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidinedion,
wurde hergestellt mittels Prozeduren, die in in
EP-A- 0
517 327 beschrieben sind (veröffentlicht am 5. Mai 1993).
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Es wird in dieser Veröffentlichung
als "HD-2" identifiziert. Eine
Amin-angereicherte Meerrettich-Peroxidase wurde hergestellt unter
Verwendung der allgemeinen Prozedur aus Beispiel 1 von
US-A-5,162,219 .
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Das Hapten wurde an eine Amin-angereicherte
Meerrettich-Peroxidase durch Auflösen von "HD-2" (15,5
mg) in trockenem N,N-Dimethylformamid (1,031 ml), enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) konjugiert.
Eine Lösung
von Amin-angereicherter Meerrettich-Peroxidase (1 ml, 10 mg/ml)
in N(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(3-propansulfonsäure)puffer
(pH 8, 0,1 molar), wurde mit N,N-Dimethylformamid (500 μl), enthaltend
4'-Hydroxyacetanilid
(10 mmolar) unter Vortex-Mischen kombiniert und wurde dann in ein
42°C-Wasserbad
gebracht. Die "HD-2"-Lösung (500 μl) wurde
tropfenweise zur Enzymlösung
unter Vortex-Mischen zugegeben, so daß das molare Verhältnis 50:1
war. Die Reaktionsmischung wurde für 1 Stunde bei 42°C unter leichtem
Rühren
inkubiert.
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Das Reaktionsprodukt wurde wie folgt
dialysiert:
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- a) Gegen eine Mischung von N,N-Dimethylformamid (1 Liter),
enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid
(10 mmolar) und den oben aufgeführten
Puffer (pH 8, 0,1 molar) in einem 1 : 1-Verhältnis bei 42°C für eine Stunde.
- b) Dialysebedingung a) wurde wiederholt.
- c) Gegen den aufgeführten
Puffer (1,5 Liter, 0,1 molar, pH 8), enthaltend bovines Seriumalbumin
(0,1%) bei 8°C
für 1,5
Stunden.
- d) Gegen den aufgeführen
Puffer (1,5 Liter, 0,1 molar, pH 8) bei 8°C für 18 Stunden. e) Gegen Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer
(1,5 Liter, 0,04 molar, pH 7,5), enthaltend Natriumchlorid (0,15
molar) bei 8°C
für 2 Stunden.
- f) Dialysebedingung e) wurde für 4 Stunden wiederholt.
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Die Produktlösung enthielt 1,48 mg/ml des
Diphenylhydantoin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats, bestimmt mittels Spektrophotometrie.
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Andere Materialien:
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Monoklonale Anti-Digoxin-Antikörper wurden
an Poly[styrol-co-p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)styrol] (95 : 5
Gewichtsverhältnis,
1,0 μm durchschnittlicher
Durchmesser)-Kügelchen
unter Verwendung der in
US-A-5,177,023 (Sutton
et al) beschriebenen Prozeduren angehängt. In ähnlicher Weise wurden monoklonale Anti-Diphenylhydantoin-Antikörper an
polymere Partikel zur Verwendung in Beispiel
3 unten angehängt.
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TRITONTM X-100
nicht-ionisches oberflächenaktives
Mittel ist von Union Carbide erhältlich.
TETRONICTM 7908 nicht-ionisches oberflächenaktives
Mittel ist von BASF erhältlich,
und Olin 10G nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist von
der Olin Corporation erhältlich.
Alle anderen Reagenzien und Bestandteile, die in den Elementen und
Verfahren verwendet werden, sind entweder kommerziell erhältlich oder
in leichter Weise unter Verwendung von herkömmlichen Ausgangsmaterialien
und unter Verwendung von bekannten Prozeduren herstellbar.
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Beispiele 1 & 2: Analytische
Elemente zum Nachweis von Digoxin
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Trockenanalyse-Elemente dieser Erfindung,
die zum Nachweis von Digoxin nützlich
sind, wurden unter Verwendung herkömmlicher Prozeduren und mit
den folgenden Beschichtungsformulierungen hergestellt. Die Gravur-
und Rezeptor-Beschichtungen diffundierten in die poröse Verteilungsschicht,
um separate Zone nahe den Grenzen der getrockneten porösen Verteilungsschicht
zu bilden.
-
-
-
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Das als Beispiel 1 identifizierte
Element enthielt eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich
mit carboxymethylierten Histidin-Aminosäuren in der Gravur-Beschichtung.
Das als Beispiel 2 identifizierte Element enthielt dieselbe modifizierte
Apo-Peroxidase aus Meerrettich aus einer anderen Herstellungscharge.
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Ein Kontroll-Element war in jeder
Hinsicht identisch, außer
daß nicht-modifizierte
Apo-Peroxidase aus Meerrettich
anstelle der modifizierten Apo-Peroxidase aus Meerrettich in der
Gravur-Beschichtung verwendet wurde.
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Die Rate der Signalbildung wurde
bestimmt durch Aufbringen einer Testprobe (11 μl), enthaltend Digoxin in einer
auf menschlichem Serum basierenden Matrix, auf das Element und Inkubieren
des Elements für 5
Minuten bei 37°C.
Eine Substratlösung
(12 μl),
enthaltend Wasserstoffperoxid (0,04%), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 μmolar) in
einer Natriumphosphat-gepufferten Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (0,01 molarer Puffer, pH 6,8), wurde dann aufgebracht.
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Unmittelbar nach der Auftragung der
Substratlösung
wurde das Element bei 37°C
gehalten, während die
Messung der Rate der Farbstoffbildung über ungefähr 2,5 Minuten bei 670 nm durchgeführt wurde,
unter Verwendung von herkömmlicher
Reflexions-Densitometrie.
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Jede Testprobe wurde sowohl mit einem
Hämolysat,
erzeugt durch Beschallen von Vollblut, um die in Tabelle I unten
angezeigte Menge an Hämoglobin
bereitzustellen, als auch mit Di goxin (2 ng/ml) versehen. Die Testproben
mit 8 mg/dl Hämoglobin
wurden getestet unter Verwendung einer herkömmlichen Radioimmunassay-Methode
[Bayse et al, "Reference
Method for Digoxin by Radioimmunoassay, Proposed Standard (1985)", National Committee
for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Document I/LA9-P, NCCLS:
Villanova, PA, 1986], um eine Richtwert-Messung für Digoxin
bereitzustellen (1,87 ng/ml).
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Die in Tabelle I unten gezeigten
Resultate zeigen, daß eine
beträchtliche
Beeinflussung bei der Digoxin-Bestimmung bei Verwendung des Kontroll-Elements
stattfindet, da die nicht-modifizierte
Apo-Peroxidase aus Meerrettich reaktiviert wurde (das heißt ihre
Enzymaktivität
wiederhergestellt hatte), was zu einem unerwünschten Signal in der Anwesenheit
von Hämoglobin
führte.
Da das bei den Assays erzeugte Signal umgekehrt proportional zur
Menge des Analyten in den Testproben ist, sind die beeinflußten Resultate
negativ. Die Beeinflussung wurde bei Verwendung der Elemente der
vorliegenden Erfindung erheblich verringert. Das heißt, die
Resultate waren nur geringfügig
negativ oder geringfügig
positiv.
-
-
Beispiel 3: Analytisches
Element zum Nachweis von Diphenylhydantoin (Phenytoin)
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Analytische Elemente wurde in ähnlicher
Weise zu den oben in Beispielen 1 und 2 beschriebenen hergestellt,
außer
daß sie
Reagenzien hatten, die zum Nachweis von Diphenylhydantoin geeignet
waren. Die Elemente wurden unter Verwendung von herkömmlichen
Prozedu ren und -Gerät
beschichtet und hatten die folgenden grundlegenden Beschichtungszusammensetzungen
und Struktur:
Elementstruktur
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Die Elemente wurden verwendet, um
zwei Patienten Testproben auf Diphenylhydantoin zu testen, die vom
Jackson Memorial Hospital (Miami, Florida) erhalten worden waren,
wobei von den Proben bekannt war, daß sie verschiedene Mengen an
Analyt sowie störende
Blutprotein-Agentien enthielten, von denen bekannt ist, daß sie die
Testresultate in der Abwesenheit von nicht-modifizierter Apo-Peroxidase
aus Meerrettich beeinflussen. Die Testproben werden hierin als "Patient 1" und "Patient 2" identifiziert.
Eine dritte Testprobe, identifiziert als "Patient 3", wurde von einem Angestellten
der Eastman Kodak Company erhalten, wobei die Probe keine bekannte
Menge an Analyt enthielt. Zu dieser dritten Testprobe wurden jedoch
20 μg/ml
Analyt zugegeben.
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Bezugsassays wurden an den Testproben
unter Verwendung von HPLC durchgeführt, und dann wurden die oben
beschriebenen Elemente verwendet. Die Resultate wurden bestimmt
unter Verwendung eines EKTACHEMTM E-250-Analyators
(Eastman Kodak Company), und jegliche Beeinflussung wurde durch
Vergleich des Analysator-Ergebnisses mit dem mittels HPLC erhaltenen
Resultats bestimmt. Die Resultate der Assays werden in 1 zusammengefaßt, wobei
die Beeinflussung auf der y-Achse und verschiedene Beschichtungsniveaus
(mg/m2) von modifizierter oder nicht-modifizierter
Apo-Peroxidase aus Meerrettich für
die separaten Tests auf der x-Achse gezeigt werden.
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Die Daten in dem ersten Satz an Balkendiagrammen
aus 1 wurden erhalten
unter Verwendung eines analytischen Elements, enthaltend 10 mg/m2 von nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich
in der Gravur-Beschichtung, das aber in einem unterschiedlichen
Herstellungsprozeß als
die anderen Elemente, enthaltend nicht-modifizierte Apo-Peroxidase
aus Meerrettich hergestellt wurde. Die Daten in den letzten beiden
Sätzen
von Balkendiagrammen (Reihe B) aus 1 wurden
unter Verwendung von Elementen der vorliegenden Erfindung erhalten,
enthaltend modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich mit carboxymethylierten Histidin-Aminosäuren.
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Das erste Balkendiagramm in jedem
Satz Balkendiagramme zeigt die Resultate von der "Patient 1"-Testprobe,
das zweite Balkendiagramm zeigt die Resultate von den "Patient 2"-Testproben, und das
dritte Balkendiagramm zeigt die Resultate von den "Patient 3"-Testproben.
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Die Daten in 1 zeigen, daß die ohne Apo-Peroxidase aus
Meerrettich jeglichen Typs durchgeführten Assays beträchtlich
mehr Beeinflussung als die anderen Assays aufwiesen. Mit der Erhöhung der
Konzentration an nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich
nahm der Umfang der Beeinflussung ab, aber die endgültige Verbesserung
für die
meisten Patientenproben wurde mit den Elementen der vorliegenden
Erfindung, enthaltend modifiziertes Apo-Enzym, erzielt.