JPH02501500A - 生物学的診断検定システム - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物学的液体たとえば全血、血漿または血清の生物学的活性成分の定
量のための検定に関する。
生物学的液体中に存在する被検物質の迅速な分析のための検定要素としては、本
技術分野にて多くのものが知られている。とくに興味がもたれるものは、血漿か
らたとえば遠心分離または抽出によって血球を予め分離する必要がない、全血サ
ンプルでの分析を実施可能にする要素である。たとえば乾式多層分析要素が知ら
れている。これはサンプルとして1滴の全血を適用すると、フィルター要素によ
って血漿から細@(赤血球、白血琢)が分離され、ついで間組の被検物質を含有
する血漿は1個または複数個の試薬層へ移動する。
被検物質と試薬の間の相互作用の結果として、要素内に被検物質の存在に相当す
る検知可能な変化がもたらされる。検知可能な変化はたとえば肉眼での評価また
はデンシトメーター等を用いて分光測定法による読み収シが可能な色の変化であ
ってもよい。螢光標識生物学的活性種の存在に基づく他の構成においては、螢光
放出シグナルを発生させ、これを螢光測定法によって測定することもできる。
一般的に、また全血もしくは血漿がサンプルとして用いられる場合とくに、正確
かつ再現性のある結果を得るためには、問題の被検物質と使用される試薬とが、
検知可能な変化をもたらす相互作用に参加して利用されることが重要である。し
かしながら、残念なことに、フルオレセイン、ローダミン等のような染料や、各
種の生物学的活性化合物とくに薬物たとえばフエノバルビトール、フェニトイン
、サイロキシン(T4)のようなホルモンは、分子量2000までの小分子で、
血漿タンパク質に結合する。これらの種の血漿タンパク質に対する親和性は、当
然ながら得られた結果の正確さに悪影響を及ぼし、サンプル・が非希釈の場合に
とくに然シである。すなわち、化合物が最初、全血または血漿サンプル中に存在
する場合、化合物は血漿タンパク質と複合体を形成していることが考えられ、し
たがって分析的に有意な程度まで置換または解離させて生じた総遊離生物学的活
性棟を定量できるようにしなければならない。検定に染料、染料抱合体および試
薬として用いられる他の化合物につい℃は、血漿タンパク質に結合することを防
止するか、また、結合した場合には置換または解離を行う必要がある。
この目的で免疫検定に有用なものとして、様々な化合物が開示されてきた。米国
特許第3.911,096号にはT4の遮断剤として有様な様々を物質が挙げら
れている。たとえば、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸(ANS)、ナ
フタレンスルホン酸、2,4゜6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)
等である。
米国特許第3,928,553号には、トリヨードサイロニンおよびサイロキシ
ンに対する各種結合阻害剤として、たとえばバルビッール酸およびその誘導体、
サリチレートならびにジエチルマロニル尿素ナトリウム塩が記載されている。米
国特許第4,622,293号にはヨードサイロニン検定における遮断剤として
2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン−5−スルホン酸(HMS)の使
用が教示されている。
公知の遮断剤はすべての場合に満足できるものではない。このような試剤が効果
的に機能するためには、様々な性質をもつことが望ましい。たとえば、遮断剤ま
たは置換剤は、検知可能なシグナルを与えるために用いられる特異的結合対の相
互作用を妨害してはならない。さらに、螢光標識被検物質を用い、螢光放出シグ
ナルを発生させる検定においては、遮断剤または置換剤は、それ自体がまたは血
漿タンパク質と複合体を形成した場合に、螢光標識と同じ励起および放射領域に
実質的な螢光を示してはならない。さらに、標識の螢光を消光することがあって
はならない。したがって、分析の精度に悪影響を与えることがなく、診断的検定
に使用できる遮断剤またはmm剤の必要性に常に絶えることがない。
本発明は、フェノキシ置換ナフタレン化合物およびその塩を、遮断剤および/ま
たは置換剤として利用する診断検定システムを提供するものである。このフェノ
キシ置換ナフタレン化合物は、式
(式中、Rはスルホン酸、カルボン酸、リン酸等のようなイオン性の基であつ℃
、ナフタレン環構造上のどの炭素原子に結合していてもよい)で示される。
本明細書および請求の範囲において使用される「イ“オン性の基」の語は、水中
でイオン化され、分子の溶解性を改善する基を意味する。この化合物に導入でき
る代入的な適当なイオン性の基としては、スルホン酸(−s○3H)、カルボン
酸(−COOH)、リン酸(−〇P(○H)2)等を挙げることができる。
式Iに包含される化合物の塩は、式
(式中、Xは生物学的に許容される陽イオン、たとえばNa”、に+ 等である
)で示される。
上述のように、ff1i換基Rd、ナフタレン環構造のどの炭素原子に結合して
いてもよい。本発明の°とくに好ましい態様においては、1−2エノキシナ7)
レンー8−スルホン酸(PNS)およびその塩が、遮断剤および/または置換剤
として使用される。PNSは式%式%
本発明はPNSおよびその塩の有効濃度を検定に際して使用すると、検定成分の
血漿タンパク質への結合の遮断および/または最初結合していた成分の置換が分
析的に有意な程度、通常50%以上、好ましくは75係以上達成され、しかも検
定の精度には有意な妨害を与えないことを発見したものである。PNSは、被検
物質の標識として用いられる染料たとえばフルオレセイの抱合体、薬剤たとえば
フエノバルビタールおよびフェニトイン、ホルモンたとえばサイロキシン(T、
)のような検定の成分が血漿タンパク質へ結合するのを遮断し、!lた最初に結
合していたタンパク質から置換するのに有効であることが発見された。ざらに、
これらの機能を発揮するのに必要な濃度において、PNSは浴准中で実質的な螢
光を示すことはなく、また溶液中でのこのような染料の螢光を有意に消光するこ
ともな−・点で有利である。ヒドロキシビペラゾンエチルスルホネート(HEP
ES )緩衝液(PH1,2)中、PNSは304言コに極大吸収を示す(g
= 3.5 ×103)。同じ緩衝液中で、PNSは、414 nmに極大発光
を示しく290nmで励起)、螢光量子収量(Of)はエタノール中で0.54
である。
特定の検定に必要なフェノキシ置換ナフタレン化合物およびその塩の量は、定量
される特定の被検物質、サンプル中に存在する被検物質の量、検定反応液中に入
ってくる他の取分等のような因子に依存し、変動する。特定の検定における有効
量は、通常の範囲試験を用いて決定できる。通常、反応液の総重量に対して約0
.05重量係から約2重関係までのフェノキシ置換化合物が必要である。
フェノキシ置換ナフタレン化合物およびその塩は、検定が行われる−において必
要な濃度、水に溶解する。
たとえばきわめて低い−では、すなわちp)13未満ではPNSはプロトン化石
れ、浴液から沈殿する。免疫検定法は、通常6より高い声、好ましくは6〜8の
範囲で行われる。この関係ある一範囲内では、PNSは水に必要な濃度、溶解す
る。
好ましい態様の説明
不発明は、フェノキン置換ナフタレン化合物およびその塩の、生物学的診断検定
における一般的な使用を包含する。好ましい態様においては、これらの化合物お
よびその塩が利用された免役検定法、すなわち抗原−抗体の相互作用に基づく検
定法が提供される。抗原には、分子量約100〜約2.000、さらに典型的に
は分子量約125〜約1,0DDOもの、たとえばアルカロイド、ステロイド、
ベンズヘテロサイクリック、プリン等のような薬剤が包含される。抗体はポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントであってよい。
検定は、慣用の「湿式」技術に従って行われてもよく、また多層要素のような「
乾式」検定要素を用いて実施することもできる。このような乾式検定要素は本技
術分野において公知であシ、したがってこの検定要素についての詳細な説明は不
要であろう。これらの検定要素は、実質的に均一な多孔性をもつ膜のような単層
の液体透過性マトリックス材料から作成され、少なくともその一部には診断試薬
組成物が分散されている。米国特許第3.607,093号にはこの種類の検定
要素が開示されている。また、このような検定要素は1種または2種以上の機能
を行う各種の層をもつ複数個の層からなるものでもよい。たとえば、米国特許第
3,368.872号には、サンダルを受容するための多孔性テープを包含する
生物学的液体分析用の多層分析要素が開示されている。この受容層は試験層の上
に設けられる。1滴の血液でもよいサンプルは多孔性の受容テープ上に適用され
、これがす受容のための多孔性の層を包含する多層分析デバイスが開示されてい
る。多孔性材料は均一の多孔性を有し、これが毛細管移動を可能にし、試験液の
成分が隣接する試薬層に入る前に均一々分布が与えられる。すなわち、本発明に
よる多層要素は、1滴の試験液体を受容し、試薬層に試験液体成分を均一に分布
させることができる層または他の手段を包含することが好ましい。
他の態様においては、検定要素には液体から細胞(赤血球、白血球等)または他
の妨害種を除去するためのフィルター要素を包含してもよい。
本発明の検定要素は複数個の試薬NZを包含することができ、その各層にはその
要素に利用されるリグナル発生システムで一役を担う試薬を含有する。また、他
の様々な層たとえば、反応もしくは相互作用の結果として形成された拡散性シグ
ナル発生株の受容に適合した層、または要素内に発生したシグナルの検知を補助
するために要素内に適切に設けられる液体透過性、光遮断性の層などを包含させ
ることもできる。フェノキシ置換ナフタレン層は、これらの分析要素の任意の適
当な層に導入することができる。フィルター要素および/またはサンプル拡散も
しくは分布層を包含する多層要素の場合は、化合物をフィルター層またはサンダ
ル拡散層に導入するのが好ましい。
本発明は、生物学的液体中の成分の分析のための任意の生物学的診断検定方法を
包含する。好ましい方法は、あらゆる種類の競合的検定ならびに免疫測定および
サンドインチ検定を包含する抗原−抗体相互作用に基づく免疫検定である。これ
らの免疫検定には通常、標識試薬を使用する。このような検定には、標識試薬の
標識に作用して、または標識と相互作用して放射線の放出に変化を生じさせる試
薬に作用して、放射線の放出に変化を与えて、検知可能なシグナルを提供する任
意の化学的相互作用が利用される。たとえば、螢光、化学発光、発色またはその
他の可視または可視近傍の放射線の変化が利用できる。すなわち、このような免
疫検定に用いられる標識は、直接または間接に検知できるものである。標識は螢
光団、発色団、化学発光団、リン光体または酵素であってよい。標識が酵素であ
る場合には、それは基質と相互作用して、基質が色原体である場合には吸収に、
基質が螢光団である場合には螢光に、基質が化学発光前駆体である場合には化学
発光に、基質がリン光体である場合にはリン光に変化を生じる酵素とすることが
できる。
本発明を次に例によって特定の好ましい態様に関し、さらに詳細に説明するが、
これは本発明を単に例示するものであって、本発明をそこに挙げた材料、操作等
に限定するものではない。
血漿タンパク質からのフェノバルビタールの置換それぞれPNS 0%(対照)
、0.02%、0.05%、0.2%および0.5%を含有するヒト血漿溶液を
調製し、それぞれに、界面活性剤、Tween 20 (Rohm&Haas)
0.1%を加えた。放射性トリチウム標識エチル−5−フエニルバルビツール醒
、5− C3H(C)) ) (NewEngland Nuclear )の
HEPES緩衝液中5Dミリモル溶液も調製した。
フエノバルビタール溶液(10μl ) i PNS−mffi液のそれぞれに
加え、ついで室温において1時間インキュベーションした。次にこの溶液を、分
子量i o、o o o未満の分子のみを通過させるCenzriconPM1
0フィルター(Am1con Corp、 )を通して50009で遠心分離し
た。タンパク質に結合したフエノバルビタールは、この場合、フィルターを通過
しない。濾液をそれぞれ、シンチレーション液体、BIOFLUORM
13mlで希釈し、5cinci Verse BIO−HP (Fisher
Scienzific ) によって放射能をカウントした。結果を第1衣に示
す。
第1茨
総フエノバルビタールの約45係が血漿タンパク質に結合していて、フィルター
を通過しなかったことがわかる。結果は、PNSが血漿タンパク質からのフェノ
バルビタールの解離に有効で、至適の解離は0.5係PNSで得られることを示
している。
例2
ヒト血清アルブミン(H8A)からのスルホローダミン101の置換
スルホローダミン1.05x10−5nの水溶液2セツトを、種々の量のH8A
を含むHEPES緩衝液中に調製した。一方のセット(対照)にはPNSを加え
ず、他方には0.2係PNSを含有させた。溶液をCenzricon 30
フィルターを通して5000&で遠心分離し、濾液をPerkin−E1mer
λ9スペクトロフォトメーターによシ586 nmで走査した。濾液中に存在す
るスルホローダミン101の量を第2表に示す。
第2表
%H8A (フィルター通過)
PNSは遊離スルホローダミンを与えるのにきわめて有効であったことがわかる
。
例3
血漿タンパク質からのテオフィリン−ローダミン抱合体の置換
この実験は、式
で衣される抱合体を用いて実施した。
この抱合体は、−緒に譲渡された係属中の出願第34.225号(1987年4
月2日出願)に開示され、請求され℃いる。
実験は、HEPES緩膏液中ヒト血漿溶液に抱合体(1,Ox 10−5M )
を溶解して実施した。1セツトの浴液(対照)にはPNSを加えず、他方には0
.2%のPNSを含有させた。浴液をCenzricon 30フイルターを通
して5000Fで遠心分離し、l液f Perkin −E1merλ9スペク
トロフォトメーターを用いて500〜600 nmで走査した。濾液中の遊離抱
合体の量を第3茨に示す。
第3表
対照 0.2係PNS
PNSは遊離抱合体を与えるのにきわめて有効であったことがわかる。さらに、
血漿は約4%のH8Aを含むので、対m溶液で得られた結果から、抱合体は血漿
中の他の成分とも結合したこと、そしてPNSはこのような結合の遮断および/
1fcは結合抱合体のlk換に有効であったことが明らかである。
例4
H8Aからの2ルオレセインおよびフルオレセイン−テオフィリン抱合体の置換
実験は、フルオレセインおよびフルオレセイン−テオフィリン抱合体をそれぞれ
HEPES緩衝液に溶解し、種々の量のH3Aを加えて実施した。1セツトの溶
液(対照)にはPNSを加えず、他方のセントにid O,2%PNSを含有さ
せた。溶液をCenzricon 30フイルターを通して5000gで遠心分
離し、濾液を490 nmで走査した。得られた結果は第4弄に示す。
%ISA 染 料 抱合体
0 1D[l 100 100 1000.075 83 99 72 93
0.15 69 97 61 87
0.3 52 98 44 87
0.5 40 38
0.6 35 93 32 82
1.2 20 89 24 72
1.5 17 88 21 69
PNSは、遊離染料および遊離抱合体を与えるのに有効であったことがわかる。
例5
血漿タンパク質からのフェニトインのits実験は、14(−標識フェニトイン
(9,3x 10−5M )および様々な量のPNSを含有するHEPES緩衝
液中血漿溶液1セットを用いて実施した。溶液をCentricon30を用い
てsooogで濾過し、濾液をシンチレーションカウンターでカウントした(1
00μlの濾液に1Dmtのシンチレーション液を使用)。フェニトインのHE
PES緩衝液を対照とした。結果を第5表に示す。
第5表
%PNS フィルターを通過した
係フェニトイン(±3)
PNSは、遊離のフェニトインを与えるのにきわめて有効であったことがわかる
。
B−およびR−フイコエリトリンの螢光放出をPNSおよび8−アニリノ−1−
ナフタレンスルホン酸(ANS)の関数として検討した。実験は、様々の量のP
NSおよびANS ’i含むHEPES 緩m fFi中フイコエリトリン溶液
を用いて実施した。フイコエリトリンは560nmで励起させ、その放出を57
5 nmで測定した。結果を第6衣に示す。
第6人
存在下 存在下 存在下 存在下
0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.125 1.0 0.61 1.0 0.720.25 1.0 0.43
0.99 0.54o、37s 1.CI C1,33ot990.400.
50 1.0 0.25 0.98 0.29PNSは溶液中でフイコエリトリ
ンの螢光放出に影響を与えないが、ANSは両フイコエリトリンの放出をきわめ
て強く消光するこ゛とがわかる。
以上、本発明を特定の好ましい態様について説明したが、これは本発明を限定す
るものではなく、これらの記載によりむしろ、本発明の技術分野における熟練者
には、本発明の精神から逸脱することなく、添付した請求の範囲内において改変
および修飾が可能なことが明らかであろう。たとえば、ナフタレン環構造上の他
の位置も適当に置換できるし、またフェノキシ基のフェニル環上の位置について
も同様である。すなわち、不発明に従って用いられるフェノキシ置換す7タレ/
化合物の有利な遮断および/または置換特注を有する類縁体は、請求の範囲の目
的にかいてその均等物とみなされるものである。
手続補正書
平成1年5月24日
Claims (31)
- (1)生物学的液体中の成分を定量する方法において、生物学的液体を、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはイオン性の基であって、ナフタレン環構造上のどの炭素原子に結合 していてもよい)て示される化合物またはその塩の存在下に少なくとも第一の試 薬と接触させ、その生物学的液体中に成分の関数である検知可能な変化を生成さ せ、その変化を検知することを特徴とする方法。
- (2)Rは−SO3H,−COOHまたは−OP(OH)2である請求の範囲第 1項に記載の方法。
- (3)化合物は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ て示される化合物またはその塩である請求の範囲第2項に記載の方法。
- (4)生物学的液体は全血、血漿または血清である請求の範囲第3項に記載の方 法。
- (5)第一の試薬は、定量される成分の結合パートナーである請求の範囲第4項 に記載の方法。
- (6)第二の試薬の存在下に行われる請求の範囲第5項に記載の方法。
- (7)第二の試薬は、定量される成分またはその類縁体が標識に連結した抱合体 である請求の範囲第6項に記載の方法。
- (8)標識は螢光性成分である請求の範囲第7項に記載の方法。
- (9)第二の試薬は、定量される成分の結合パートナーが標識に連結した抱合体 である請求の範囲第6項に記載の方法。
- (10)標識は酵素であり、その酵素と基質の反応を包含する請求の範囲第9項 に記載の方法。
- (11)液体サンプル中の被検物質の存在を定量する免疫検定法において、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはイオン性の基であつて、ナフタレン環構造上のどの炭素原子に結合 していてもよい)で示される化合物またはその塩の存在下に、サンプルを被検物 挨物質の結合パートナーと接触させて、被検物質とその結合パートナーの二元複 合体を形成させることを特徴とする方法。
- (12)Rは−SO3H,−COOHまたは−OP(OH)2 である請求の範 囲第11項に記載の方法。
- (13)化合物は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物またはその塩である請求の範囲第12項に記載の方法。
- (14)被検物質は抗原であり、接触工程は標識に結合した抗原またはその類縁 体からなる抱合体の存在下に行われる請求の範囲第13項に記載の方法。
- (15)標識は螢光である請求の範囲第14項に記載の方法。
- (16)液体サンプル中の被検物質の存在を定量する免疫検定法において、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはイオン性の基であつて、ナフタレン環構造上のどの炭素原子に結合 していてもよい)で示される化合物またはその塩の存在下、サンプルを第一およ び第二の結合パートナーと接触させて、被検物質、第一の結合パートナー、およ び第一の結合パートナーとは異なる部位で被検物質に結合する第二の結合パート ナーの三元複合体を形成させることを特徴とする方法。
- (17)Rは−SO3H,−COOH または−OP(OH)2である請求の範 囲第16項に記載の方法。
- (18)化合物は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物またはその塩である請求の範囲第17項に記載の方法。
- (19)第二の試薬は標識に連結している請求の範囲第18項に記載の方法。
- (20)被検物質は抗原であり、標識は酵素である請求の範囲第19項に記載の 方法。
- (21)生物学的液体中の成分の分析のための要素において、少なくとも1個の 試薬からなり、式▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはイオン性の基であつて、ナフタレン環構造上のどの炭素原子と結合 していてもよい)で示される化合物またはその塩を包含することを特徴とする要 紫。
- (22)Rは−SO3H,−COOHまたは−OP(OH)2である請求の範囲 第21項に記載の要素。
- (23)化合物は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物はまたその塩である請求の範囲第22項に記載の要素。
- (24)さらに支持体を包含する請求の範囲第23項に記載の要素。
- (25)2個の試薬層を有し、両試薬層の間に設けられた光遮断層を包含する請 求の範囲第24項に記載の要素。
- (26)試薬層は、生物学的液体中の成分の結合パートナーを包含する請求の範 囲第23項に記載の要素。
- (27)被検成分またはその類縁体が標識に連結した抱合体をさらに包含する請 求の範囲第26項に記載の要素。
- (28)標識は螢光項である請求の範囲第27項に記載の要素。
- (29)分析される成分の第一の結合パートナーと分析される成分の第二の結合 パートナーを包含し、各結合パートナーは上記成分に異なる部位で結合する請求 の範囲第23項に記載の要素。
- (30)第二の結合パートナーは標識に連結している請求の範囲第29項に記載 の要素。
- (31)標識は酵素である請求の範囲第30項に記載の要素。
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